CC BY
4ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ЭНДОФИТНОГО ГРИБА ASPERGILLUS FISCHERI VO1R, ИНГИБИРУЮЩИХ АКТИВНОСТЬ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ ЛИПАЗЫ Д.М.Рузиева, М.М.Йулдошева, Г.А.Расулова, Т.Г.Гулямова https://doi.org/10.5281/zenodo.8367114 Аннотация. Распространенность ожирения растет угрожающими темпами но, к сожалению, в настоящее время на рынке доступно лишь несколько препаратов. В настоящем исследовании представлены данные исследований качественной идентификации и извлечения вторичных метаболитов эндофитного гриба Aspergillus fischeriVOlR, выделенного из корня растения Viola odorata, обладающие способностью подавлять активность панкреатической липазы. Установлено, что при ступенчатом фракционировании исходного этилацетатного экстракта эндофитного гриба A.fischeri VOIR наиболее высокая ингибиторная активность наблюдается в бутанольной фракции и составляет 84,9%. Качественный анализ бутанольной фракции наглядно свидетельствовал о присутствие биоактивных соединений, таких как флавоноиды и пептиды. В результате очистки суммарной бутанольной фракции A.fischeri VOIR т о
н Ключевые слова: Орлистат, эндофит, вторичные метаболиты, ингибиторная активность, тонкослойная хроматография, флавоноиды.
о Аннотация. Хозирги кунда а^оли уртасида семириб кетишнинг юцори суръатда рсиб бориши кузатилмоцда, аммо афсуски, сотувда семиришга царши саноцли дорилар мавжуд. Ушбу тадцицотда Viola odorata усимлигининг илдизидан ажратиб олинган Aspergillus fischeriVOlR эндофит замбуругининг ошцозон ости бези липазасини йингибирлаш хусусиятига эга булган иккиламчи метаболитларни экстракциялаш ва улар нстида утказилган сифат та^лиллари юзасидан маълумотлар келтирилган. Тадцицот ватижасига кура, A.fischeriVOlR эндофит замбуругининг дастлабки этилацетат эйкстрактини дифференциал фракциялаш натижасида энг юцори ингибитор фаоллик бутанол фракциясида булиб, 84,9% ни ташкил цилди. Бутанол фракцияси сифат та^лилидан утказилганда, биофаол бирикмаларнинг флавоноидлар ва пептидларга ¡пегишли эканлиги аницланди. А^^ег^ОШнинг умумий бутанол фракциясини юпца оатламли хроматография усулида тозалаш натижасида Rf 0,75 булган энг фаол Б-2 фракциясининг ошцозон ости бези липазасига ингибиторлик фаоллиги 57,2 % ни ташкил аилди, сифат та^лилларига кура улар флавоноид табиатли моддалар эканлиги маълум тулди.
о Калит сузлар: Орлистат, эндофит замбуруг, иккиламчи метаболитлар, ингибитор гфаоллик, юпца цатламли хроматография, флавоноидлар.
р Abstract. The prevalence of obesity is increasing at an alarming rate but, unfortunately, only a few drugs are currently available on the market. The present study presents data on the (Qualitative identification and extraction of secondary metabolites of the endophytic fungus Aspergillus fischeriVOlR isolatedfrom the root of Viola odorata, which have the ability to inhibit the activity ofpancreatic lipase. It was found that during stepwise fractionation of the initial ethyl acetate extract of the endophytic fungus A.fischeri VOIR, the highest inhibitory activity was observed in the butanol fraction and amounted to 84.9%. Qualitative analysis of butanol fraction
т о
б р
о
1679
clearly indicated the presence of bioactive compounds such as flavonoids and peptides. As a result of purification of the total butanol fraction of A.fischeri VOIR by thin-layer chromatography, the most active fraction B-2 with Rf 0.75 was selected, the inhibitor activity of which under the given conditions is 57.2% and qualitatively belong to flavonoids.
Keywords: Orlistat, endophyte, secondary metabolites, inhibitor activity, thin-layer chromatography, flavonoids.
Введение
В настоящее время ожирение растет угрожающими темпами. Ожирение является мировой проблемой, которая может способствовать развитию различных заболеваний, таких как дислипидемия, метаболический синдром, гипертония и повышенный риск сердечно-сосудистой смертности [1]. Согласно недавнему докладу Всемирной организации здравоохранения во всем мире более 1 миллиарда взрослых имеют избыточный вес, по крайней мере 300 миллионов из них страдают ожирением [2,3]. Было реализовано несколько стратегий, направленных на поиск методов лечения критической проблемы ожирения. Одним из терапевтических подходов к профилактике ожирения является замедление всасывания жирных кислот путем ингибирования липазы в пищеварительном тракте [4]. Панкреатическая липаза (ПЛ) является первичным пищеварительным ферментом, катализирующим гидролиз сложноэфирных связей три- и диглицеридов до моноглицеридов и свободных жирных кислот. Ингибиторы ПЛ относятся к лекарствам периферического действия, опосредующим прямое снижение всасывания калорий в желудочно-кишечном тракте и влияющим на абсорбцию липидов [5,6]. В настоящее время единственным лекарством от ожирения такого типа, одобренным для длительного применения, является ингибитор липазы Орлистат [7]. Это насыщенное производное липстатина, потенциального природного ингибитора ПЛ, полученного из Streptomyces toxytricini [8]. Однако, длительное применение Орлистата сопровождается тяжелыми побочными эффектами, включая гепатотоксичность, камни в желчном пузыре, в почках, острый панкреатит, что требует разработки новых безопасных и эффективных препаратов для лечения ожирения [9].
Исследования микробных натуральных продуктов, в частности, эндофитных грибов лекарственных растений, становится предметом повышенного интереса [10]. Это связано с тем, что эндофиты, это группа микроорганизмов, бессимптомно обитающих внутри тканей растений, признаны как огромный и мало исследованный ресурс уникальных химических структур. В частности, эндофиты антилипидимических растений за счет способности синтезировать те же самые вещества, что и растение-хозяин, в том числе и ингибиторы панкреатической липазы, являются весьма перспективным объектом как альтернативные продуценты гиполипидимических соединений с минимальными побочными эффектами. Перспективность эндофитных грибов, как возможных продуцентов ингибиторов липазы впервые была показана Gupta et al. [11,12] при скрининге культуральных фильтратов 70 эндофитных грибов. Качественный анализ выявил ингибиторный потенциал у изолятов 57TBBALM, 33TBBALM и 1CSSTOT, но только один изолят 57TBBLAM (Penicillium), проявлял значение IC50 3.69 мкг/мл, сравнимое с IC50 2.73 мг/мл Орлистата как позитивного контроля [11].
1680
Katosh et al. [13] провели оценку ингибирующей активности 27 изолятов эндофитов, выделенных из V.odorata. Согласно полученным ими данным, экстракты семи эндофитов проявляли ингибиторную активность со значением IC50<10pg/mL. Из них наиболее перспективным оказался экстракт VOLF4 (Aspergillus sp. ), проявляющий ингибиторную активность с IC50 3.8 pg/mL.
Проведенные нами ранее исследования ингибиторной активности эндофитов, выделенных из различных лекарственных растений, показали, что этилацетатный экстракт эндофита A.fischeriVOIR, выделенного из Viola odorata на 91,5% подавляет активность панкреатической липазы [14]. Учитывая то, что эндофиты продуцируют различные группы химических соединений, целью настоящей работы было извлечение и идентификация природы ингибиторных метаболитов эндофитного гриба Aspergillus fischeri VOIR.
Материалы и методы
Культивирование. Эндофитный гриб Aspergillus fischeri VOIR выращивали глубинным культивированием на среде Чапека-Докса на качалке при 180 об/мин, в течение 7 дней. Биомассу гриба отделяли от культуральной жидкости и вторичные метаболиты экстрагировали этилацетатом из расчета 1 г биомассы в 5 мл растворителя в течение 24 часов на круговой качалке при 180 об/мин при комнатной температуре. Смесь фильтровали через бумагу (Whatman№1). Экстракты упаривали досуха на вакуумном испарителе и добавляли 1мл диметилсульфоксида (ДМСО) Полученные экстракты хранили при -4°C до использования.
Фракционирование вторичных метаболитов. Фракционирование вторичных метаболитов из этилацетатного экстракта биомассы эндофитов проводили по схеме, описанной Kumar et al [15], включающей последовательную экстракцию водой, бутанолом, смесью метанола с гексаном (1:1). Экстракты сушили на роторном испарителе и добавляли 1 мл диметилсульфоксида. Полученные сухие экстракты хранили при -4° С до использования.
ТСХ анализ бутанольной фракции Aspergillus fischeriVOlR
Тонкослойную хроматографию экстрактов проводили на пластинках Silicageton TLCALfoils фирмы SIGMA-ALDRICH. Размер пластин составлял 10х10,10х15 см в системе: бензол:хлороформ (20:1) в стандартной хроматографической камере. 25 мкл экстракта наносили на пластинки вручную микрошприцем на расстоянии 1 см от нижнего края. Пластинку с нанесенными веществами погружали в предварительно насыщенную парами подвижной фазы камеру. Хроматографические полосы после разделения выскабливали и экстрагировали в бутаноле. Изображение пластинки проводили в УФ-свете при длине волны 254 нм.
Определение ингибиторной ПЛ активности фракций. 50 мг липазы ("Sigma", 60 ед/мл) суспендировали в 10 мл трис-HCl буфера, содержащего 2,5 мМ трис и 2,5 мМ NaCl, pH 7,4. Раствор интенсивно встряхивали в течение 15 мин и центрифугировали при 4000 об/мин 10 мин и отбирали супернатант. Исходные растворы экстрактов и стандарта Ксеникала готовили в ДМСО с линейными концентрациями в диапазоне 2-2000 мкг/мл. Конечная реакционная смеси состояла из 875 мкл буфера, 100 мкл фермента и 20 мкл экстракта в различной исходной концентрации, предварительно инкубированных в течение 5 мин при 37 0 C с последующим добавлением 10 мкл субстрата (4-нитрофенилпальмитата в 10 мМ в ацетонитриле). Количество ДМСО в конечной концентрации не превышало 2%.
1681
Оптическую смесь измеряли на спектрофотометре (УФ-вид модели ЦУ-5100) через 5 минут при 405 нм [16]. Процент ингибирования рассчитывали по формуле:
% ингибирования = (Ae-At) М£ x100
где Aе - оптическая плотность ферментного контроля (без ингибитора), а At -разница между оптической плотностью исследуемого образца с субстратом и без него. В качестве препарата сравнения использовали Ксеникал.
Определение качественного состава экстрактов вторичных метаболитов эндофитных грибов.
Качественный состав соединений в экстрактах эндофитных грибов определяли фитохимическими методами по Visweswari [17].
Наличие танинов и фенольных веществ определяли путем добавления к 2 мл полученного экстракта 2-3 капель 1% раствора FeCLз. В присутствии ионов железа танины дают черно-синий или черно-зеленый цвет, фенолы - фиолетовый.
Наличие сапонинов устанавливали путем растворения 1 мл экстракта в 5 мл горячей воды (60°С) с дальнейшим интенсивным встряхиванием в течение 5 минут до образования стойкой пены. Объем пены сохранялся в течении последующих 30 минут.
Наличие терпеноидов определяли путем смешивания 0,5 мл экстракта с 2 мл хлороформа и 3 мл H2SO4 (конц.) Образование между фазами красно-коричневого окрашивания говорило о наличии терпеноидов.
Наличие антрахинонов устанавливали смешиванием 2 мл экстракта с 4 мл гексана и последующим встряхиванием. При этом наблюдалось разделение экстракта на 2 слоя. Верхний слой отделяли, обрабатывали 4 мл разведенного 10% аммиака и определяли окраску нижнего слоя. Фиолетово-розовая окраска говорила о наличии антрахинонов.
Наличие сердечных гликозидов определяли путем смешивания 1 мл экстракта с 1 мл ледяной уксусной кислоты и последующим добавлением 1 капли 3% хлорида железа в метаноле. Затем добавляли по стенке пробирки H2SO4 (конц.) и определяли окраску нижнего слоя. Сине-зеленое окрашивание говорило о наличии сердечных гликозидов.
Наличие алкалоидов основаны на способности алкалоидов образовывать не растворимые в воде соединения с солями тяжелых металлов, с комплексными йодидами, комплексными кислотами и другими соединениями кислотного характера. Эти реакции позволяют установить наличие алкалоидов даже при незначительном их содержании. Раствор йода в растворе калия йодида (реактив Вагнера, реактив Бушарда) с алкалоидами образуют бурые, трудно растворимые в воде осадки. К 1 мл эстракта добавляют 5 капель реактива для осаждения алкалоидов. При наличии алкалоидов появляется бурый осадок.
Тест на пептиды: к 2 мл каждого экстракта добавляли 1 мл 40 % гидроксида натрия и несколько капель 1% сульфата меди; образование фиолетового-голубого цвета указывает на присутствие молекул пептидной связи в экстракте образца.
Тест на флавоноиды: к 2 мл каждого экстракта добавляли несколько капель 20% гидроксида натрия, наблюдается образование интенсивного желтого цвета. К нему было добавляем несколько капель 70% разбавленной соляной кислоты и желтый цвет исчезает. Образование и исчезновение желтого цвета указывает на присутствие флавоноидов.
Все эксперименты проводили в 3-х повторностях.
Результаты и обсуждение
1682
Проведенные ранее нами исследования, по изучению состава и свойств внутриклеточных метаболитов эндофитного гриба A.fischeriVOIR, ингибирующих активность панкреатической липазы, показали наиболее высокое значение ингибиторной активности - 91,5 % в этилацетатном экстракте. Учитывая то, что эндофиты продуцируют различные группы химических соединений, нами проведено извлечение активных ингибиторных метаболитов из этилацетатного экстракта биомассы Aspergillus fischeriVOIR методом ступенчатого фракционирования и определение их природы.
Разделение вторичных метаболитов проводили по схеме, предложенной Kumar et al [18], включающей последовательную экстракцию исходного этилацетатного экстракта, водой, смесью метанола с гексаном (1:1) и бутанолом. В результате из исходного этилацетатного экстракта было получено четыре фракции (водная, бутанольная, метанольная и гексановая) (рис.1).
Рис.1. Схема очистки вторичных метаболитов исходного этилацетатного экстракта A.fischeriVOIR методом дифференциального фракционирования в различных растворителях. (Kumar et al. 2013)
Как видно из данных, представленных на рис.2, исходное содержание сухих экстрактивных веществ в этилацетатном экстракте составляло 65 мг/г биомассы, а ингибиторная активность к панкреатической липазе - 91,5%. При фракционировании суммарного этилацетатного экстракта органическими растворителями с различной полярностью в бутанольную фракцию извлекается основная часть метаболитов этилацетатного экстракта - 35 мг/г биомассы с ингибиторной активностью 84,9%. Водой фракционируются 8,5 мг/г биомассы с активностью - 39,6%. Низкий уровень экстрактивных веществ - 4 мг/г и 4,2 мг/г биомассы с ингибиторной активностью -29,8% и 12,2%, наблюдается в гексановой и метанольной фракциях, соответственно.
1683
этилацетят бутанол вода гексан метанол
■ вес сухого экстракта мг/г б/м ■ % инг. липазы
Рис.2. Выход вторичных метаболитов и их ингибиторная активность экстрактов, полученных фракционированием исходного этилацетатного экстракта Л./кекепУО^
Фитохимический анализ состава компонентов, присутствующих в бутанольной фракции, показал, что из девяти определяемых химических классов соединений (терпеноиды, фенолы, антрахиноны, сердечные гликозиды, танины, флавоноиды, сапонины, пептиды и алкалоиды) в бутанольной фракции обнаруживаются флавоноиды и пептиды (таблица 1).
Таблица 1.
Фитохимический анализ бутанольной фракции Л.А$скепУО1К
Терпе ноиды
Антрах и-ноны
Флаво-
ноиды
Пептиды
Сердечные гликозиды
Сапонины
Алкал о-иды
Фено -лы
Танины
Для идентификации ингибиторного соединения бутанольную фракцию
эндофитного гриба Л^сЪеггУаК, разделяли тонкослойной хроматографией в системе бензол : хлороформ (20:1).
ТСХ анализ бутанольной фракции эндофитного гриба Л.А$скепУО1К
1684
Rf=0,844
Rf=0,4
№
А-1
B-2
C-3
значен ие
0,84
0,75
0,41
ингибирование ПЛ (%
30,2
57,2
25,6
Бутанольная фракция (84,9 %)
Элюентная система: бензол : хлороформ (20:1)
фракция В-2
Изображение в УФ-свете с длиной волны 254
Объем пробы -25 мкл
Рис.3 Разделение вторичных метаболитов бутанольной фракции эндофитного
гриба A.fischeriVO1R
Результаты хроматографирования показали четкое разделение бутанольной фракции на 3 полосы с различными значениями Rf. Определение ингибиторной ПЛ активности каждой из фракций показало значения ингибиторной активности 30,2%, 25,6%, и самый высокий уровень активности, составляющий 57,2%, принадлежал пробе В-2. (рис.3).
Качественный анализ фракции В-2 показал положительную реакцию на флавоноиды, о чем свидетельствует окрашивание пробы в желтый цвет при добавлении 20% раствора NaOH (рис.3)
Таким образом, ингибирование липазы суммой вторичных метаболитов A.fischeriVOIR связано с веществами флавоноидной природы. Следует отметить, что в течение последних 20 лет флавоноидам уделяется большое внимание в связи с их разнообразными биоактивными свойствами, как это показано на примере высокой противовирусной эффективности глицирризина и хризина против ВИЧ [19-20].
Результаты наших исследований согласуются с данными литературы, в которых сообщается об ПЛ-ингибирующих свойствах флавоноидов эндофитных грибов Aspergillus nidulans и Aspergillus oryzae, выделенных из Ginkgo biloba L [21].
Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что эндофит A.fischeriVOIR продуцирует соединения флавоноидной природы с высокой ПЛ-ингибирующей активностью и может рассматриваться как потенциальный источник для получения натуральных препаратов от ожирения.
REFERENCES
1. World Health Organization (2015) Global health observatory data, risk concerns.
2. Arbeeny C.M. Addressing the unmet medical need for safe and effective weight loss therapies. Obes. Res. 2004, 12, 1191-1196. rCrossrefl, [Google Scholar!
3. Harrold J., Williams G., Wong S. Neuroendocrine targets for the treatment of obesity: physiological roles and unrealized opportunities. Curr Med Chem 2003, 3, 141155. [Crossref], [Google Scholar]
1685
4. Lowe M.E. Pancreatic triglyceride lipase and colipase: insights into dietary fat digestion. Gastroenterology. 1994;107:1524-36.
5. Elangham C.S. Current strategies in the development of anti-obesity drugs and their safety concerns. Vet.Pathol. 46:10-24, 2009
6. Colon-Gonzalez F., Kim G.W., Lin J.E., Valentino M.A., Waldman S.A. Obesity pharmacotherapy: what is next? Mol Asp Med. 2013;34:71-83.
1. 7.Orlistat (marketed as Alli and Xenical) Information. http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsandPro viders/ucm180076.htm
7. Weibel E.K., Hadvary P., Hochuli E., Kupfer E., Lengsfeld H. Lipstatin, an inhibitor of pancreatic lipase, produced by Streptomyces toxytricini. I. Producing organism, fermentation, isolation and biological activity. J Antibiot. 1987;40:1081-5.
8. Drent M.L., van der Veen, E.A. Lipase inhibition: a novel concept in the treatment of obesity. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 1993, 17, 241-244. [Google Scholar]
9. Dias D.A., Urban S., Roessner U. A historical overview of natural products in drug discovery. Meta. 2012;2:303-36.
10. Gupta M., Saxena S., Goyal D. Potential pancreatic lipase inhibitory activity of an endophytic Penicillium species. J Enzyme Inhib Med Chem. 2015;30:15-21
11. Gupta M., Saxena S., Goyal D. Lipase inhibitory activity of an endophytic fungal species of Aegle marmelos: a bioresource for potential pancreatic lipase inhibitors. Symbiosis. 2014; 64:149-57.
12. M.Katoch, A.Paul, G.Singh and S.N.C. Sridhar. Fungal endophytes associated with Viola odorata Linn. as bioresource for pancreatic lipase inhibitors. BMC Complementary and Alternative Medicine (2017) 17:385
13. Gulyamova T.G., Ruzieva D.M., Yoldosheva M.M., Rasulova G.A., Kondrasheva K.V. Screening of Pancreatic Lipase Inhibitors of Endophytic Fungi of Medicinal Plants in Uzbekistan. Biosci Biotech Res Asia 2022, Vol. 19(4), p. 1037-1044
14. Susheel Kumar, Nutan Kaushik. Endophytic Fungi Isolated from Oil-Seed Crop Jatropha curcas Produces Oil and Exhibit Antifungal Activity. 2013; Vol 8 (2 ) e56202 doi: 10.1371/j ournal.pone.0056202
15. Katoch, A.Paul, G. Singh and S.N.C.Sridhar. Fungal endophytes associated with Viola odorata Linn. as bioresource for pancreatic lipase inhibitors Katoch et al. BMC Complementary and Alternative Medicine (2017) 17:385 DOI 10.1186/s12906-017-1893-y.
16. Visweswari G., Christopher R., Rajendra W. Phytochemical screening of active metabolites present in Withania Somnifera root: Role in traditional medicine. International Journal of Pharmaceutical Science and Research. 2013;4(7):2770-2776.
17. Kumar S., Kaushik N. (2013) Endophytic Fungi Isolated from Oil-Seed Crop Jatropha curcas Produces Oil and Exhibit Antifungal Activity. PLoS ONE 8(2): e56202. doi: 10.1371/j ournal.pone.0056202
18. R.Ushasri and R.Anusha. In vitro anti-diabetic activity of ethanolic and acetone extracts of endophytic fungi Syncephalastrum racemosum isolated from the seaweed Gracilaria corticata by alpha-amylase inhibition assay method. Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci (2015) 4(1): 254259.
1686
19. S.J.Higginbotham*, A.E.Arnold, A.Ibanez, C. Spadafora, P.D. Coley, T.A.Kursar. Bioactivity of Fungal Endophytes as a Function of Endophyte Taxonomy and the Taxonomy and Distribut ion of Their Host Plants.PLOS one, September 2013, V. 8, 9,1-119.
20. Min Qiu, Rui-sheng Xie, Yu Shi, Haihua Zhang &Hai-min Chen. Isolation and identification of two flavonoid-producing endophytic fungi from Ginkgo biloba L.Annals of Microbiology volume 60, pages143-150 (2010).
1687
