CC BY
73
УДК 615.454
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2019-21-11-27-34
КАЧЕСТВЕННОЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ В РАЗРАБОТАННЫХ МЯГКИХ АНТИАРТРИТНЫХ И АНТИАРТРОЗНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ
Локарев1 А.В., Самуйленко1 А.Я., Огай2 М.А., Морозов3 Ю.А., Макиева3 М.С.
1 Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, Московская область, посёлок Биокомбината, Российская Федерация 2Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал «Волгоградский государственный медицинский университет», г. Пятигорск, Российская Федерация 3Северо-Осетинский государственный университет им. К.Л. Хетагурова, г. Владикавказ, Российск4ая Федерация
QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DETERMINATION OF FLAVONOIDS IN THE DEVELOPED SOFT ANTIARTHRITIS AND ANTIARTHRITIS DOSAGE FORMS
Lokarev1 A. V., Samuilenko1 A. Y., Ogai2 M. A., Morozov3 Y.A., Makeeva3 M. S.
1All-Russian research and technological Institute of biological industry, Moscow, Russian Federation 2Pyatigorsk medical and pharmaceutical Institute-branch of the "Volgograd state medical University",
Pyatigorsk, Russian Federation 3North Ossetian state University named after K. L. Khetagurova», Vladikavkaz, Russian Federation
Аннотация: Артрит и артроз - серьезные заболевания среди людей и животных. В ряде случаев возникают без видимых причин - идиопатиче-ский или первичный. Существует также вторичный - развившийся в результате какого-то патологического процесса.
В последнее время болезнь стала прогрессировать. Из имеющегося арсенала препаратов, для комплексного лечения данной патологии, особую нишу занимают лекарственные средства на основе природных соединений [1]. Лекарственные средства из растительных объектов дешевле синтетических аналогов, хорошо сочетаются с другими лекарственными средствами. Их можно безопасно использовать в комплексе со средствами для лечения болезней, осложненных сопутствующими заболеваниями, обладают низкой токсичностью, отсутствием побочных эффектов даже при длительном
Annotation: Arthritis and arthrosis are serious diseases among humans and animals. In some cases, there are no apparent reasons - idiopathic or primary. There is also a secondary - developed as a result of some pathological process. Recently, the disease began to progress. From the existing Arsenal of drugs for the complex treatment of this disease, a special niche is occupied by drugs based on natural compounds [1]. Medicines from plant objects cheaper synthetic analogues, well combined with other drugs. They can be safely used in combination with agents for the treatment of diseases complicated by concomitant diseases, have low toxicity, no side effects, even with long-term use, a plurality of pharmacological properties, due to which herbal preparations affect several systems of the body.
One of the alternatives to injection and oral administration may be local therapy in both humans and
применении, множественностью фармакологических свойств, благодаря которым препараты растительного происхождения воздействуют сразу на несколько систем организма. Одной из альтернатив инъекционного и перо-рального приема может быть местная терапия каку людей, так и животных. Локальное воздействие препаратов в месте возникновения патологии ускоряет процессы выздоровления, восстановления и устранения симптоматики [1]. С этой целью, нами были разработаны мягкие лекарственные формы для местного применения, содержащие сложный фитокомплекс из 13 растительных объектов, где в качестве основного комплекса биологически активных веществ выступают флавоноиды.
Материалы и методы: Были использованы для качественного анализа хромогенные реакции, для количественного анализа - спектрофото-метрия. Комплексный экстракт, необходимый для введения в основу и формирования мазей был получен из 13 растительных объектов: ромашки, календулы, тмина, сосны, тысячелистника, мяты, шиповника, фенхеля, солодки, полыни, чабреца, зверобоя, чистотела. Результаты. Полученные результаты качественного и количественного анализа подтвердили содержание флавоноидов. Заключение: Цветные реакции полностью подтвердили флавоноидную структуру биологически активных веществ. Количественное содержание флавоноидов в пересчете на рутин в раз-ныхмазях составляет 0, 051- 0,060.
Ключевые слова: артрит, артроз, ромашка, календула, экстракт, флавоноиды, спектрофото-метрия, рутин.
animals. Local influence of drugs at the site of pathology accelerates the processes of recovery, recovery and elimination of symptoms [1]. To this end, we have developed soft dosage forms for topical use, containing a complex phytocomplex of 13 plant objects, where flavonoids act as the main complex of biologically active substances. Materials and methods: Chromogenic reactions were used for qualitative analysis and spectrophotometry for quantitative analysis. The complex extract necessary for the introduction and formation of ointments was obtained from 13 plant objects: chamomile, calendula, cumin, pine, yarrow, mint, rose hips, fennel, licorice, wormwood, thyme, St. John's wort, celandine.
Results. The results of qualitative and quantitative analysis confirmed the content of flavonoids. Conclusion: Color reactions fully confirmed the fla-vonoid structure of biologically active substances. The quantitative content of flavonoids in terms of routine in different ointments is 0, 051 - 0.060.
Key words: arthritis, arthrosis, chamomile, calendula, extract, flavonoids, spectrophotometry, rutin.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
[1] Фитотерапия, биологически активные вещества естественного происхождения в современной медицине : Материалы 6-й Международной научной конференции, 14-15 декабря 2006 г., Черноголовка / [редкол.: К. А. Трескунов (отв. ред.) и др.].
REFERENCES
[1] Phytotherapy, biologically active substances of natural origin in modern medicine: Proceedings of the 6th International scientific conference, December 14-15, 2006, Chernogolovka / [ed.: K. A. Treskunov (resp. ed.), etc.]. - Cher-nogolovka (Moscow. region) : Institute of problems of chemical. physics RAS [et al.], 2006. -332 p._
- Черноголовка (Моск. обл.) : Ин-т проблем хим. физики РАН [и др.], 2006. - 332 с.
2. Курдюков, Е.Е. К вопросу стандартизации по содержанию флавоноидов листьев сте-вии как перспективного лекарственного растительного сырья / Е.Е. Курдюков, А.В. Кузнецова Е.Ф. Семенова, И.Я. Моисеева // Химия растительного сырья. 2019 - №1, с. 217224.
3. Минаева, М.С Дифференциальная спектро-фотометрия как один из методов определения содержания флавоноидов в побегах черники обыкновенной/ М.С. Минаева, Н.А. Кузьмичева // Научное сообщество студентов XXI столетия. Естественные науки: сб. ст. по мат. XXXI междунар. студ. науч.-практ. конф. № 5(30). URL: http://sibac.info/archive/nature/5(30).pdf (дата обращения: 02.04.2019.
4. Государственная фармакопея Российской Федерации / МЗ РФ. - XIV изд. - Т.1. -Москва, 2019. - 1814 с.
Введение: В настоящее время, артрит и артроз — одни из самых распространенных заболеваний суставов в мире. Причем часто поражает людей еще вполне трудоспособного возраста, в последнее время болезнь стала прогрессировать и появляться у людей, только перешагнувших отметку в 30 лет. При данной проблеме в хрящевой ткани сустава возникает воспаление, затем деформация и разрушение. Вариаций артрита и артроза достаточно много, так как поражать он может различные суставы в организме человека. Весьма существенна эта проблема и в ветеринарии. Из имеющегося арсенала препаратов, для комплексного лечения данной патологии, особую нишу занимают лекарственные средства на основе природных соединений [1].
Преимущества растительных препаратов над химически синтезированными лекарствами очевидны. Прежде всего, многие лекарства из растений просто дешевле синтетических аналогов, а самые простые можно изготовить самостоятельно. Большинство препаратов растительного происхождения прекрасно сочетаются с другими лекарствами. Это значит, что их можно безопасно использовать в комплексе со средствами для лечения болезней, осложненных сопутствующими заболеваниями. Также среди научно доказанных преимуществ лекарств растительного происхождения — низкая токсичность, отсутствие побочных эффектов даже при длительном применении, множество фармакологических свойств, благодаря которым препараты растительного происхождения воздействуют сразу на несколько систем организма. В каждом лечебном растении содержится целый комплекс веществ, который не только устраняет причину болезни, но и оказывает благотворное воздействие на весь организм в целом.
[2] Kurdyukov, E. E. standardization of the content of flavonoids of stevia leaves as a promising medicinal plants / E. E. Kurdyukov, A. V. Kuz-netsova, E. F. Semenova, I. Y. Moiseeva // Chemistry of vegetable raw materials. 2019 - no. 1, pp. 217-224.
[3] Minaeva, M. Differential spectrophotometry as a method of determining the content of flavonoids in the sprouts of bilberry/ M. S. Minaeva, N. And. Kuz'micheva // the Scientific community of students XXI century. Natural science: collection of articles on the Mat. XXXI Intern. stud. scientific.scient. Conf. No. 5(30). URL: http://sibac.info/archive/nature/5(30).pdf (date accessed: 02.04.2019.
[4] State Pharmacopoeia of the Russian Federa-tion/MOH. - XIV ed. - Vol.1. - Moscow, 2019. - 1814 S.
Растительные препараты повышают сопротивляемость болезням, активизируют обмен веществ [1].
При терапии артрозов используют растения для активизации регенерационных процессов, восстановления поврежденных тканей хрящей и сухожилий. Одной из альтернатив инъекционного и перорального приема может быть местная терапия как у людей, так и животных. Локальное воздействие препаратов в месте возникновения патологии ускоряет процессы выздоровления, восстановления и устранения симптоматики [1].
С этой целью, нами были разработаны мягкие лекарственные формы для местного применения, содержащие сложный фитокомплекс из 13 растительных объектов: ромашки, календулы, тмина, сосны, тысячелистника, мяты, шиповника, фенхеля, солодки, полыни, чабреца, зверобоя, чистотела. Эффективность разработанных мягких лекарственных форм во многом определяется содержащимися в комплексом экстракте флавоноидами. Поэтому, возникла необходимость, доказать их наличие в качественном и количественном отношении.
Материалы и методы: Качественное определение флавоноидов в гелях. Навески гелей (около 10 г) помещали в термостойкий химический стакан, растворяли в 50 мл спирта этилового 96%, нагревали до кипения и кипятили в течение 5 минут для осаждения карбопола. После охлаждения раствора, его фильтровали через фильтр марки «Синяя лента», отбрасывая первые порции фильтрата [2]. Для подтверждения наличия флавоноидов в гелях проводили качественные хромогенные реакции по методикам:
1. Цианидиновая проба (проба Шинода). К 1 мл экстракта добавляли несколько капель кислоты хлористоводородной концентрированной и 30 мг порошка магния. Наблюдалось малиново - красное окрашивание.
2. Реакция комплексообразования с раствором ацетата свинца. При добавлении к 3 мл экстракта 1 мл 2% раствора свинца ацетата основного наблюдалось окрашивание раствора в желтый цвет.
3. Взаимодействие со щелочами. 1 мл экстракта смешивали с тем же количеством 10% раствора натрия гидроксида. Раствор окрашивался в желто - бурый цвет.
Количественное определение суммы флавоноидов в гелях
Около 10 г (точная навеска) геля помещали в термостойкий химический стакан, добавляли 25 мл спирта этилового 96% нагревали до кипения и кипятили в течение 5 минут для осаждения карбопола. После охлаждения раствора его количественно переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили тем же спиртом до метки (раствор А) [3].
К 1 мл раствора А, помещенного в мерную колбу, вместимостью 50 мл, прибавляли 4 мл 2% раствора алюминия хлорида в 96% этиловом спирте и 4 капли раствора уксусной кислоты разведенной. Объем раствора доводили тем же спиртом до метки (раствор Б) и оставляли на 40 мин.
Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре при длине волны 415±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 2 мл извлечения, 4 капли раствора разведенной уксусной кислоты и 96% этилового спирта, добавленного до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора РСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
Содержание суммы флавоноидов в процентах (X) в пересчете на рутин вычисляли по формуле:
„ Ахапх50х50хР АхапхР
Х = -=-, где
Аохах100х50 Аохах2
А - оптическая плотность испытуемого образца, Ао - оптическая плотность стандартного образца, а - навеска геля, г
ао - навеска стандартного образца, г
Р - содержание основного вещества в стандартном образце рутина, %. Результаты: Разработанные мягкие лекарственные формы, содержали комплексный экстракт из 13 растительных объектов, отображенных в таблице 1.
Таблица 1
Состав оптимальной комбинации
№ п/п Оптимальная комбинация спирто-водного извлечения из ЛРС Оптимальное соотношение (части)
1. Ромашка (цветки) 0,04
2. Календула (цветки) 0,05
3. Тмин (плоды) 0,03
4. Сосна(почки) 0,50
5. Тысячелистник (трава) 0,05
6. Мята (лист) 0,10
7. Шиповник (плоды) 0,06
8. Фенхель(плоды) 0,30
9. Солодка (корень) 0,25
10. Полынь (трава) 0,40
11. Чабрец (трава) 0,15
12. Зверобой (трава) 0,05
13. Чистотел (трава) 0,02
Итого: 13 компонентов 2,00
Качественное определение флавоноидов в гелях проводили по выше описанной методике в материалах и методах. Результаты отражены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты качественного анализа гелей с комплексным экстрактом
Наименование геля Аналитический эффект реакции
Цианидиновая проба (проба Шинода) Реакция с раствором ацетата свинца Реакция взаимодействия с щелочами
«Алтай - Экстра» Малиново - красное окрашивание Желтое окрашивание Желтое окрашивание
«Артролайт» Малиново - красное окрашивание Желтое окрашивание Желтое окрашивание
«Алезан» Малиново - красное окрашивание Желтое окрашивание Желтовато-бурое окрашивание
Полученные результаты свидетельствуют о наличии в экстракте - основном компоненте разработанных мягких лекарственных форм, веществ флавоноидной природы.
Количественное определение суммы флавоноидов в гелях также проводили по методике, описанной в материалах и методах.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в испытуемых гелях, представлено в таблице 3.
Таблица 3
Содержание суммы флавоноидов в гелях с комплексным экстрактом
Наименование образца Содержание флавоноидов, %
«Алтай - Экстра» 0,057 ± 0,006
«Артролайт» 0,058± 0,006
«Алезан» 0,051± 0,005
Валидация методики количественного определения
Для подтверждения специфичности методики снимали спектры поглощения растворов испытуемых гелей и раствора стандартного образца рутина, параллельно с спектром гелей -плацебо. Последние представляли собой карбополовые гели, аналогичные по составу основам испытуемых фитопрепаратов. Снятие спектров образцов - плацебо проводилось с целью установления отсутствия наложения спектра светопоглощения компонентов основы на спектр определяемого вещества [3, 4]. Спектры поглощения испытуемых образцов (рисунок 1) и стандартного образца имеют совпадающие максимумы светопоглощения при длине волны 415±2 нм, спектр раствора - плацебо такого максимума не имеет (рисунок 2).
Сканирование образца
Оптическая плотность (А)
Длина волны, нм
Рис. 1. Спектр поглощения образца геля, на примере геля «Артролайт»
Сканирование образца
Оптическая плотность [А]
0.008
Б ОО. О
Длима волны, hi
Рис. 2. Спектр поглощения образца геля - плацебо
Для определения прецизионности методики оценивали ее повторяемость (анализ проводился одним исполнителем, на одном и том же оборудовании, с одним и тем же набором реактивов) в пределах одного дня. Результаты сопоставимы.
Правильность методики подтверждали методом добавок рутина в образец геля-плацебо на основе карбопола. Была построена градуировочная кривая зависимости оптической плотности от концентрации рутина, представленная на рисунке 3. Установлен линейный характер этой зависимости, что подтверждается величиной коэффициента детерминации (Я2), равной 0,9894.
0,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Оптическая плотность
Рис. 3. Градуировочная кривая зависимости оптической плотности от концентрации рутина
Метрологические характеристики разработанной методики отражены в таблице 4.
Таблица 4
Метрологические характеристики методики определения содержания суммы флавоно-
идов в изучаемых гелях
Образец N Хср AX S S2 Sx Р,% t (p,f)
«Алтай -Экстра» 10 0,057 0,003 4,64х10"3 2,16х10"5 1,47х10-3 95 2,26 5,8
«Артролайт» 10 0,058 0,006 2,83х10"3 8,04х10"5 8,97х10-3 95 2,26 3,6
«Алезан» 10 0,051 0,005 4,32х10"3 1,87х10"5 1,37х10-3 95 2,26 5,8
Таким образом, проведенные исследования подтвердили содержание в разработанных мягких лекарственных формах флавоноидов (основной группы биологически активных веществ) как в качественном, так и в количественном отношении достаточном для проявления фармакологического эффекта, и в пересчете на рутин эта величина составляет 0, 051- 0,058.
