CC BY
55К вопросу определения площадей неразделенных пиков в автоматизированных системах обработки хроматограмм
Печеровый А.В. (www057@rambler.ru ) Орловский государственный технический университет
Хроматография представляет собой физико-химический метод анализа состава многокомпонентных веществ основанный на разделении исходного вещества на составляющие компоненты при его прохождении через колонку заполненную сорбентом. Обнаружение разделенных компонентов пробы осуществляют при помощи специального устройства - детектора, измеряющего какое-либо свойство выходящего из колонки раствора, функционально связанное с концентрацией компонента.
Выходной сигнал детектора (хроматограмма) представляет собой набор разнесенных во времени пиков, каждый из которых соответствует определенному компоненту вещества. Качественный и количественный состав вещества определяют исходя из того, что положение хроматографического пика на хроматограмме для данной хроматографической системы характеризует природу вещества, а площадь ограниченная этой кривой и базовой линией пропорциональна количеству данного вещества прошедшего через детектор. Обнаружение, идентификация пиков и вычисление концентраций компонентов автоматизированы и осуществляются с использованием компьютеров.
Иногда при проведении хроматографического анализа возникает ситуация, вызванная неполным разделением компонентов вещества в колонке, приводящая к образованию на хроматограмме групп неразделенных пиков, которые являются суммой нескольких отдельных пиков, соответствующих различным веществам. Наличие групп неразделенных пиков существенно влияет на результаты анализа, так как в этом случае затруднено достоверное определение площади каждого из пиков, образующих группу.
Классическими методами определения площадей неразделенных пиков являются методы, основанные на их разделении по перпендикулярам и касательным, однако эти методы дают существенно отличающиеся результаты и, следовательно, не один из них не может считаться приемлемо точным. Поэтому в настоящее время для определения площадей неразделенных пиков используют методы на базе математического моделирования, основанные на представлении хроматографического пика суммой различных кривых. Идеальный хроматографический пик описывается кривой нормального распределения Гаусса [2]:
V-Ь )2
х(<)=•е ' (1),
где Хт - высота пика;
tR - время удерживания пика;
т - постоянная времени, зависящая от параметров ВЭЖХ системы и условий проведения эксперимента. Форма реальных хроматографических пиков в большинстве случаев существенно отличается от описываемой выражением (1). Некорректный выбор выражений, описывающих пики, приводит к погрешностям определения концентраций до нескольких десятков процентов [3], а также к пропуску или ошибочной идентификации компонентов вещества с малыми концентрациями. Поэтому на практике для описания хроматографических пиков используют различные модификации этого выражения, например выражение вида (2), адекватно описывающее искаженные хроматографические пики [4].
х(г) =
0 при t < 1т -т1п
К [^ - tm + т п)/ т]п ехр[-(Г - tm +тп)/т] при -тхп < I < (2)
К2[0 - tm + Т2п)/т2]П exp[-(t - tm +Т2п)/Т2 ПРи t ^ tm
где tm - момент времени, соответствующий максимуму (для хроматографического
пика tm = tR );
К, п - параметры кривой Определение площадей неразделенных пиков при помощи математического моделирования основано на повторении расчетной кривой, образуемой суммой математических моделей каждого из пиков, формы экспериментальной кривой. Существующие программные продукты используют как диалоговый режим задания значений коэффициентов модели, так и их автоматическое определение. В диалоговом режиме совмещение расчетной и экспериментальной кривых осуществляется пользователем. При автоматическом определении значений коэффициентов модели производится составление и решение системы трансцендентных уравнений. Для ее решения, как правило, используют различные численные методы.
Порядок системы уравнений определяется сложностью выбранной модели пика (количеством коэффициентов) и числом пиков подлежащих разделению. Для того, что бы исключить усложнение системы уравнений при увеличении количества разделяемых пиков и упрощения процесса разработки программного обеспечения реализующего разделение и определение площадей неразделенных пиков с использованием сложных моделей хроматографических пиков автором предлагается следующая методика:
1. Вычисление начальных приближений математической модели каждого из пиков, без учета влияния остальных пиков.
2. Разделение исходной группы неразделенных пиков на участки, где доминируют восходящие или нисходящие ветви каждого из пиков (рисунок 1). Количество участков в 2 раза больше количества пиков в группе.
3. Выбор т характерных точек на каждом участке. Значение т равно количеству коэффициентов выбранной модели хроматографического пика.
4. Вычисление по начальным приближениям во всех характерных точках значений расчетных кривых описывающих каждый из пиков;
5. Расчет суммы значений аппроксимирующих кривых описывающих соседние пики для всех характерных точек текущего участка по формуле:
Р-1 N
Увл [/]=£ Урасч [к, /]+ £ Урасч [к, /] (3),
к =1 к =Р+1
где УВЛ [г] - суммарное значение высот соседних пиков в точке ц
Р - порядковый номер текущего пика в группе; N - количество пиков в группе;
УРАСЧ [к, /] - расчетное значение высоты К-го пика в точке ц
6. Решение системы из т-уравнений описывающих данный участок кривой:
м [Р, /1 ]=Гэксп [/1 ]- Увл / ]
< ... (4),
м [Р, гт ] = Уэксп [/т ]- Увл [т ] где т - количество коэффициентов в используемой модели;
/1.../т - номера характерных точек, для которых составлена система уравнений;
М[Р, /] - выражение описывающее модель пика Р в точке /; Уэксп [] - значение экспериментальной кривой в точке /;
7. Расчет значений кривой описывающей пик Р во всех характерных точках по вычисленным на шаге 6 значениям коэффициентов модели;
8. Выполнение этапов 5-7 для каждого из пиков входящих в группу;
9. Расчет отклонения значения каждого из коэффициентов модели на текущем шаге от значения на предыдущем и сравнение его с максимально допустимым отклонением:
4, ] = (5),
где X[] - значение ]-го коэффициента модели на текущем шаге;
X [ ]-1 - значение ]-го коэффициента модели на предыдущем шаге.
а[/]^адоп ь]
(6),
где АдОП [] - максимально допустимое отклонение значения ]-го коэффициента модели;
10. Повторение этапов 5-9 до тех пор, пока не будет достигнуто выполнения неравенства (6) для всех коэффициентов модели.
11. Выполнение окончательного расчета аппроксимирующих кривых по вычисленным коэффициентам моделей всех пиков.
12. Определение площадей пиков описываемых аппроксимирующими кривыми.
ПИК 1
1В 1Н 2В 2Н 1>с
Рисунок 1 - Разделение группы неразделенных пиков на участки
Предлагаемая методика была использована для разделения групп пиков при разработке автором программы "Х-Моделист у.2.0". Данная программа позволяет разделять группы пиков на основании построения математической модели каждого из них. В качестве исходных данных программе используются отсчеты мгновенных значений хроматограммы. Для моделирования хроматографических пиков программа использует модели описываемые выражениями (1) и (2). Решение системы уравнений осуществляется
комбинацией методов Ньютона-Канторовича [5] и Хука-Дживса [6]. Начальные приближения вычисляются исходя из времен удерживания и высот пиков.
Одной из особенностей программы является возможность использования "комбинированного режима", для повышения точности воспроизведения расчетной кривой формы экспериментальной кривой. В этом режиме на основании математического моделирования определяются отсчеты мгновенных значений каждого из пиков на всех участках группы неразделенных пиков, кроме внешних (рисунок 1, участки 1В, 2Н). Для первого и последнего участков расчетные значения отсчетов мгновенных значений внешних ветвей крайних пиков рассчитываются по выражениям (7) и (8) для восходящей и нисходящей ветвей соответственно:
N
увосх и - уэксп и - 2 ¥расч [к, *'] (7)
К-2
N-1
унисх и - уэксп и - 2 урасч [к, г] (8)
К-1
Для оценки погрешности аппроксимации группы неразделенных пиков относительно экспериментальных данных в программе "Х-Моделист у.2.0" рассчитываются отклонение площади расчетного и экспериментального пика по выражению (9) и относительное среднеквадратическое отклонение расчетной кривой от экспериментальной [7], вычисляемое в программе по выражению (10).
IX
2 я [К ]-^
эксп
А 5 - --100% (9),
V
эксп
IX
где 2 V [К ] - сумма площадей всех пиков, образующих группу;
К-1
ЯЭКСП - площадь экспериментального пика.
1
а-■
• 100% (10),
где Утах - максимальное значение высоты пика или группы пиков;
к - общее количество отсчетов группы пиков.
Результаты применения программы "Х-Моделист у.2.0" для обработки реальных неразделенных хроматографических пиков с использованием модели описываемой выражением (2) приведены в таблице 1. Внешний вид основного диалогового окна, а так же
графики экспериментальной и расчетных кривых (таблица 1, кривая №1) построенные в программе "Х-Моделист у.2.0" приведены на рисунке 2.
Рисунок 2 - Основное диалоговое окно программы "Х-Моделист у.2.0г
Данные таблицы 1 подтверждают, что предложенная методика может быть эффективно использована при разработке программного, обеспечения предназначенного для определения площадей групп неразделенных пиков.
Таблица 1
Результаты обработки неразделенных пиков в программе "Х-Моделист у.2.0"
№ кривой Условия получения Режим разделения Ветвь пика Параметры модели с,% ДБ, %
Проба Элюент Колонка Хроматограф, детектор Пик 1 Пик 2
К т п К т п
1 Тест-смесь производных аминокислот, объем 1 мкл 80% МеОН+ 20% воды, расход 50 мкл/мин Лихросфер 60С18 Милихром-5, детектор -спектрофото-метрический, X =220 нм "Комбинированный" Восходящая 1,7 . . 10-7 5,39 11,86 0,20 0,06
Нисходящая 1,9 ■ ■ 10-4 5,56 9,31
"Только модель" Восходящая 2,34 . . 10-9 5,55 13,94 1,7 . . 10-7 5,39 11,86 1,24 0,46
Нисходящая 1,9 . . 10-4 5,56 9,31 1,4 6,49 3,98
2 Тест-смесь ароматических углеводородов, объем 1 мкл Градиент рН, расход 100 мкл/мин Нуклеосил 60С18 Милихром-5, детектор -спектрофото-метрический, X =200 нм "Комбинированный" Восходящая 2,6 . . 10-20 7,02 20,72 0,53 0,11
Нисходящая 2,58 . . 10-7 9,35 9,63
"Только модель" Восходящая 1,61 . . 10-8 10,81 10,82 2,6 . . 10-20 7,02 20,72 1,14 0,75
Нисходящая 2,58 . . 10-7 9,35 9,63 1,27 . . 10-19 6,77 20,19
Литература:
1. Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн. 1. Общие вопросы. Методы разделения: Учеб. для ВУЗов/Ю.А. Золотов, Е.Н. Дорохова, В.И. Фадеева и др. Под ред. Ю.А. Золотова. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Высшая Школа, 2000 - 351 с.
2. Гуревич А.Л., Коломыцев Л.А., Русинов Л.А. Автоматизация обработки хроматографической информации. М.: Энергия, 1973. С. 13, 91.
3. Foley, J. P. Systematic Errors in the Measurement of Peak Area and Peak Height for Overlapping Peaks. //Chromatogr. 1987, 384, 301-313.
4. Некоторые особенности обнаружения и идентификации пиков в автоматизированных системах обработки хроматограмм /М.Т. Прасов, А.В.Тютякин, А.В. Печеровый //Датчики и системы. 2004 №8 С.26-30
5. Бронштейн И.Н., Семендяев К.А. Справочник по математике для инженеров и учащихся втузов. - М.: Наука, 1980. С. 882, 883.
6. Банди Б. Методы оптимизации. Вводный курс. М.: Радио и связь, 1988. С. 17 - 25.
7. Мейзда Ф. Электронные измерительные приборы и методы измерения. - М.: Мир, 1990. С. 44.
