CC BY
82
ОБЗОРЫ
© Коллектив авторов, 2001 УДК 612.015.6
К ВОПРОСУ ОБ УЧАСТИИ КАРНИТИНА В РЕГУЛЯЦИИ ОБМЕННЫХ ПРОЦЕССОВ В КЛЕТКЕ: СОВРЕМЕННЫЙ АСПЕКТ
Т.В.Кременецкая, Е.А.Строев , В.Г.Макарова, Д.Д.Песков
Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова
В работе освещены вопросы, касающиеся биологического действия карнитина, современные представления о функционировании системы транспорта жирных кислот в митохондрии, а также особенности метаболизма карнитина у микроорганизмов.
Карнитин, название которого происходит от латинского слова “саго” или “сапш” (мясо, плоть), был обнаружен в экстрактах мышц быка в 1905 году. Вскоре после этого была выведена химическая формула С7Н151Ч03, а в 1927 году точно установили и опубликовали ее структуру: триметилбетаин у-амино-Р-гидро-ксимасляной кислоты. В 1962 году определили конфигурацию физиологического энантиомера, а в 1997 году она была подтверждена: Ц-) или К(-)-3-гидрокси-4Н,Н,Ы-триметиламинобутират. Так как для мучного червя (ТепеЬпо тоШог) карнитин проявляет свойства, схожие с витаминами, то было предложено название “витамин Вт”. Карнитин обнаружен в настоящее время практически во всех растительных и животных тканях. Его обозначают как витамин Вт из-за водораство-римых свойств и с буквой “т” от “ТепеЬпо”. В коммерческих каталогах он встречается как витамин В7. Карнитин относят к витаминоподобным веществам, т.к. он синтезируется в организме человека и других позвоночных.
Основные биологические функции карнитина
Карнитин является важным кофактором нормального клеточного метаболизма. Он играет важную роль в переносе длинноцепочечных активированных жирных кислот из цитоплазмы в митохондрии. Карнитин участвует в транспорте средне- и короткоцепочечных активированных органических кислот из перок-сисом в митохондрии. Он регулирует соотношение коэнзима А, а в пропорции (КоА)/КоА является резервуаром активированных частиц ацетила. Карнитин может модулировать токсические действия слабо метаболизируемых групп ацила: либо групп ксенобиотиков (например, пиваливая кислота), либо групп, которые проявляются при блокаде нормального метаболического пути (т.е. пропионовая кислота при пропионовой ацидемии), за счет трансэстерификации с КоА и дальнейшего удаления при экскреции эфиров ацилкарнитина. Эти функции являются промежуточными д ля группы ферментов карнитинацилтрансферазы, которые катализируют следующую основную реакцию:
карнитинацилтрансфераза ацил-КоА + Ь-карнитин ^ ^ ацил-Ь-карнитин + КоАБН
Выделили три вида карнитинацилт-рансфераз: карнитинпальмитоилтранс-фераза (ЕС 2.3.1.21), карнитиноктаноил-трансфераза (ЕС 2.3.1.137) и карнитина-цетилтрансфераза (ЕС 2.3.1.7).
Транспорт жирных кислот в митохонд-* рии
Ферментная система транспорта длинноцепочечных жирных кислот (а также по всей вероятности ацилов со средней длиной цепи ?) через митохондриальную мембрану содержит карнитин-пальмиток^трансферазы I и II (СРТ-І и
СРТ-11), а также карнитин-ацилкарнитин-транслоказу (рис. 1).
После многочисленных дискуссий к 1989 году исследователи пришли к общей точке зрения относительно следующих особенностей митохондриального транспорта жирных кислот:
1) трансэстерификация жирных кислот из ацил-Ко А в ацилкарнитин осуществляется в присутствии СРТ-1. которая локализуется на наружной митохондриальной мембране,
2) карнитин-анилкарнитинтранслоказа. связанная с внутренней мембраной митохондрий, обеспечивает более быстрое проникновение в матрикс
Рис. 1. Процесс транспорта жирных кислот в митохондрии согласно современным представлениям.
ацилкарнитина в обмен на свободный карнитин,
3) CPT-II, локализованная во внутренней мембране митохондрий, необходима для повторного образования (реформации) ацил-КоА,
4) СРТ-I, но не CPT-II (установлено в 1977 году) потенциально может ингибироваться малонил-КоА (обратимо) (ингибирование CPT-I мало-нил-КоА in vivo встречается только в печени) и веществами класса - это-моксир-КоА (необратимо). Исследование структуры CPT-I и
CPT-II показало, что они практически идентичны, но отличаются микроокружением и кинетическими свойствами [22, 23]. CPT-I, связанная с наружной стороной внутренней мембраны митохондрий, легко солюбилизируется. Она катализирует реакцию переноса цитоплазматических длинноцепочечных ацилов с КоА на карнитин. Эффективным ингибитором этого фермента является малонил-КоА -ключевой субстрат при синтезе жирных кислот в цитоплазме. При концентрациях малонил-КоА 0,1 -1,0 мкмоль/л активность CPT-I угнетается на 60-80% [12]. СРТ-II более прочно связана с липидным слоем внутренней митохондриальной мембраны (“латентный” фермент) и катализирует перенос ацила с ацилкарнитина, транспортированного на матрикс-ную поверхность внутренней мембраны митохондрий, на внутримитохондриаль-ный Ко ASH. Этот фермент нечувствителен к малонил-КоА, но ингибируется пальмитоил-КоА (рис. 2). Поскольку транспорт жирных кислот через митохондриальную мембрану лимитирует весь процесс их (3-окисления, то регуляция карнитинпальмитоилтрансфераз мало-нил-КоА и пальмитоил-КоА играет важную физиологическую роль в организме. Так, увеличение концентрации малонил-КоА, которое наблюдается при интенсив-
ном синтезе жирных кислот и вообще липидов, препятствует окислению жирных кислот, поскольку блокируется начальная фаза их переноса, осуществляемая с участием СРТ-I. Аккумуляция паль-митоил-КоА в матриксе может возникнуть при угнетении (3-окисления жирных кислот. Это приводит к ингибированию »
СРТ-П и переноса ацилов в направлении матрикса и, наоборот, содействует обратному поступлению их в цитоплазму.
В пероксисомах печени крыс и тканях человека найдена система (3-окисления жирных кислот, сходная с митохондриальной [23]. Транспорт ацилов через мембрану пероксисом осуществляется с помощью карнитина и с участием карни-тинацилтрансферазы, которая отличается от карнитинпальмитоилтрансферазы митохондрий. Очистка и изучение ацил-трансфераз, локализованных в различных мембранах клетки показало, что в пе- 4
роксисомах имеется октаноил-КоА: кар-нитин-ацилтрансфераза [ЕС 2.3.1], которая использует в качестве субстратов преимущественно октаноил-, гексаноил- и деканоилпроизводные. Очевидно, что этот же фермент участвует в транспорте остатков многоатомных жирных кислот.
Идентифицирован высокоактивный остаток гистидина в активных центрах карнитиноктаноилтрансферазы и карнитинпальмитоилтрансферазы, который, по-видимому, участвует в катализе. Предполагается, что остаток гистидина действует как основной катализатор в ацил-трансферазной реакции, облегчая атаку гидроксила карнитина на тиоэфирную связь [3]. "
Семейство карнитинацилтрансфераз содержит консервативный структурный мотив - серин-треонин-серин. Методом сайт-направленного мутагенеза получены рекомбинантные мутанты карнитинацилтрансфераз с одиночными, двойными и тройными заменами этих остатков
малонил-КоА
Рис. 2. Возможная модель регуляции СРТ-системы.
на аланин. По данным кинетического анализа, указанный структурный мотив необязателен для каталитической активности ферментов, но он вовлечен в связывание карнитина с карнитинацилтран-сферазой и в стабилизацию переходного состояния фермента [10].
С помощью технологии молекулярного клонирования установлено, что существуют две изоформы СРТ-1: Ь-СРТ-1 (печеночная форма) и М-СРТ-1 (мышечная форма). Ген печеночной СРТ-1 локализуется на 1Ц хромосоме. Ь-СРТ-1 имеет молекулярную массу ~ 88 кДа. Фермент скелетных мышц отличается меньшими размерами (~ 82 кДа), генетическими свойствами и большей чувствительностью к малонил-КоА. М-СРТ-1 представлена в скелетных мышцах, а также в белых и бурых адипоцитах [15].
Печеночная изоформа находится в митохондриях печени, почек, мозга и других тканях. Уникальность сердца состоит в том, что оно содержит как мы-
шечную, так и печеночную изоформы. Лучше всего Ь-СРТ-1 (низкая Кт для карнитина) представлена в сердце плода, но при рождении ее активность начинает понижаться, в то время как М-изоформа (высокая Кт для карнитина), которая очень мала при рождении, становится преобладающим энзимом во время послеродового развития. Г ен, кодирующий М-СРТ-1 человека, состоит из двух 5'-некодирующих экзонов, 18 кодирующих экзонов и одного З'-некодирующего эк-зона, охватывающего примерно 10 нуклеотидов [17].
Ь-СРТ-1 была единственной изоформой, обнаруженной в незрелом яичке крыс [1]. Экспрессия гена М-СРТ-1 связана только с мейотическими и постмей-отическими половыми клетками. Зрелое яичко содержит смесь Ь- и М-СРТ-1 энзимов, при этом Ь- или М- вид доминирует в экстратубулярных клетках и сперматозоидах соответственно. Зрелые эпи-дидимиальные сперматозоиды лишены
активности СРТ-1, одновременно обладая избыточными уровнями СРТ-П и карни-тинацетилтрансферазы. Назначение это-моксира в дозе, которая привела к полному ингибированию СРТ-1 в печени, сердце, скелетной мышце, почках и не произвело никакого воздействия на фермент как Ь- так и М-типа в яичке зрелых крыс [1]. Данные указывают на важную роль М-СРТ-1 и карнитинацетилтрансфе-разы в созревании и/или функционировании спермы крыс.
Была изучена топология СРТ-1 во внешней митохондриальной мембране [26]. Ь-СРТ-1 печени крысы имеет в своем составе И-терминальный домен (~ 150 аминокислотных остатков), содержащий два гидрофобных трансмембранных сегмента- Н) (остатки 48-75), и Н2 (остатки 103-122). 14- и С-концы находятся на цитозольной стороне мембраны, в то время как короткая петля, соединяющая Н и Н2 (линкерная область) располагается в межмембранном пространстве (рис. 3). И-терминальная область СРТ-1 играет важную роль в подавлении активности фермента малонил-КоА. Большая С-тер-минальная область диктует степень восприимчивости к малонил-КоА [4]. Установлено, что один или более гистидино-вых остатков в молекуле СРТ-1 могут быть вовлечены во взаимодействие с ма-лонил-КоА. Существует точка зрения, что малонил-КоА взаимодействует в пределах каталитического участка СРТ-1, но не с регуляторной субъединицей. СРТ-1 тесно связана с наружной митохондриальной мембраной и теряет свою активность, когда выделяется из мембраны в окружающую среду, возможно потому, что она требует определенного фосфоли-пидного окружения и наличия других белков мембраны для оптимального выполнения своих функций.
На митохондриях печени крыс установлено, что в зависимости от энергети-
ческого статуса этих органелл может изменяться число контактных сайтов СРТ-1 с митохондриальной мембраной и нарушаться липидное окружение вокруг этих контактных участков. In vitro введение L-CPT-I в ОММ (наружная митохондриальная мембрана) требует наличия митохондриальных рецепторов и стимулируется АТФ. Ее N-терминальный домен (остаток 1 -150), который, как уже было отмечено выше, содержит два трансмембранных сегмента, обладает всей информацией для митохондриального прицеливания и ОММ введения. Уничтожение этой области нейтрализует белковое прицеливание [5].
Используя дрожжевую двугибридную систему, было показано прямое взаимодействие СРТ-1 с белком Вс1-2, регулирующим программируемую клеточную смерть (апоптоз) и экспрессируемого на внешней митохондриальной мембране. Для взаимодействия с Вс1-2 требуется полная длина молекулы СРТ-1 [18].
Согласно исследованиям последних десяти лет установлено, что CPT-II человека - это белок, молекулярная масса которого равна 71 кДа и, возможно, он распространен во всем организме, как и соответствующий ген. ДНК были выделены и охарактеризованы для белков крысы и человека. Ген CPT-II человека локализован на хромосоме 1р32. CPT-II, выделенная из печени крысы, содержит 658 аминокислотных остатков (Mr ~ 74119), из которых N-конец, состоящий из 25 остатков, расщепляется до Mr ~ 71000 ферментом, поступающим из митохондрий.
Несмотря на наличие СРТ-системы почти в каждой ткани организма сложный механизм транспорта оказался чрезвычайно трудным для анализа на молекулярном уровне. Исследования в настоящее время проводятся, в основном, в следующих направлениях.
■\ С-каталитический домен
Цитозоль
Внешняя / митохондриальная мембрана
Межмембранное пространство
Внутренняя / митохондриальная мембрана
Матрикс
Рис. 3. Топология СРТ-1 во внешней митохондриальной мембране.
Во-первых, первоначально определенный ингибиторный эффект малонил-КоА на СРТ-1 в контексте кетогенеза в печени сейчас представляется намного шире в физиологии млекопитающих, т.е. играет ключевую роль в поддержании гомеостаза внепеченочных тканей, таких как сердце, скелетные мышцы, (3-клетки поджелудочной железы и является объектом дальнейшего изучения.
Во-вторых, растущий интерес в фармацевтической промышленности при-
надлежит разработке ингибиторов СРТ как потенциальных “помощников” инсулина при лечении сахарного диабета, когда окисление жирных кислот является негативным воздействием на гомеостаз глюкозы.
В-третьих, увеличивается частота врожденных дефектов в локусе СРТ. Это приводит к серьезным последствиям и требует всестороннего изучения.
Биосинтез карнитина
Многочисленные исследования по биосинтезу карнитина, проведенные на различных биологических объектах - от микроорганизмов до растительных и животных тканей, показали, что процесс новообразования этого вещества, очевидно, осуществляется сходным путем.
Исходным соединением в данном синтезе служит незаменимая аминокислота-лизин, причем возможно вовлечение в процесс биогенеза карнитина как свободного лизина, так и находящегося в составе полипептидной цепи.
Изучение локализации ферментов биосинтеза карнитина в тканях животных и человека показало, что ферменты, катализирующие превращение лизина в у-бутиробетаин, находятся в скелетных мышцах, сердце, кишечнике, почках, печени, семенниках и, вероятно, в других тканях. Но последний этап образования карнитина осуществляется только в печени и в незначительной степени в почках и семенниках.
Эндогенный синтез карнитина вносит вклад в поддержание его гомеостаза у млекопитающих. Скорость биосинтеза карнитина у человека приблизительно 2 мкмоль/кг веса тела в день и существенно не изменяется.
Возможные варианты дефицита карнитина у человека
Первое расстройство метаболизма жирных кислот было описано более 20 лет назад. В настоящее время уже идентифицировано 15 врожденных нарушений данного вида метаболизма.
Самой распространенной патологией является отсутствие или недостаток среднецепочечной ацил-КоА-дегидроге-назы. Клиническая картина, связанная с дефицитом карнитина у человека была
впервые описана в 1973 году. Недостаточность карнитина была обнаружена при нескольких генетически-обуслов-ленных дефектах ферментов. Исследователями сделана попытка классифицировать дефицит карнитина на первичный (наследственный) и вторичный (приобретенный), а также на миопатический, кардиомиопатический или системный. Но все эти классификации несостоятельны из-за затруднений по установлению причин недостатка карнитина.
В настоящее время считается, что дефицит карнитина имеет место как таковой, если снижается отношение эсте-рифицированной его формы к свободной.
Наиболее типичной для данной группы нарушений является недостаточность СРТ-П. Проявляется она приступами повторяющейся миоглобинурии, вызванной физической нагрузкой или стрессом. Был обнаружен более тяжелый случай СРТ-Н недостаточности с симптомами, характерными для СРТ-1 недостаточности. Первыми проявлениями заболевания были гипогликемия, гепато- и карди-омегалия.
Активность СРТ-II была сильно снижена во всех исследуемых тканях, включая печеночную, сердечную, мышечную и в фибробластах, но значения СРТ-1 активности оставались в пределах нормы [21].
К настоящему моменту в литературе описано 4 случая недостаточности карнитин-ацилкарнитинтранслоказы у новорожденных детей [21 ], при которых наблюдались гипокетоническая гипогликемия, желудочковая аритмия, а также прогрессирующая мышечная слабость. Недостаточная активность СРТ-I - редкое нарушение, характеризующееся эпизодическими приступами гипокетоничес-кой гипогликемии, гипераммониемией и мультиорганной недостаточностью в
грудном возрасте. У некоторых больных имела место органическая ацидурия.
Несмотря на последние достижения ведущих западных лабораторий в области диагностики причин дефицита карни-тина (использование массспектрометрии, метода стабильных изотопов, газожидкостной хроматографии, технологии молекулярного клонирования и т.д.) лечение таких пациентов значительно затруднено, и продвижение в этом вопросе на настоящий момент происходит достаточно медленно.
Пути метаболизма карнитина у микроорганизмов
Роль карнитина для стимуляции роста и метаболизма микроорганизмов зависит от вида и условий их обитания, концентрации солей и многих других факторов. У некоторых дрожжей, например, Torulopsis bovina АТСС 26014, сдерживающим фактором роста является поступление ацетильных групп с помощью карнитинацетилтрансферазы в митохондрии [19].
У бактерий бетаины выступают в роли осмопротекторов. Осмозащитная функция у-бутиробетаина и карнитина показана у Escherichia coli, Preudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes, P. aeruginosa, растущих в присутствии источников углерода и азота, высокой концентрации NaCl и образующего L-карнитин бетаина [20].
Бетаины накапливаются бактериями за счет мембраносвязанных пермеаз (ферменты, увеличивающие проницаемость мембран). Предположили, что у Е. coli, CaiT, протеин 57-Кда cai оперона, является переносчиком карнитина [7]. CaiT гомологичен переносчику глицинбетаина из Bacillys subtilis, холина BetT из Е. coli, BetT подобному белку из Haemophilus influenzae и переносчику глицинбетаина из Corynebacterium glytamicum. Эти мем-
бранные транспортные белки участвуют в процессе поглощения структурносвя-занньгх четвертичных аминов [14].
Полный распад карнитина как единственный источник энергии, углерода и азота в аэробных условиях
В 1959 году впервые был описан полный распад L-карнитина у Pseudomonas. В аэробных условиях происходит ферментативное дегидрирование карнитина у третьего атома углерода и образуется дегидрокарнитин (рис. 4). Карнитиндегидрогеназа (L-карнитин: N а 0+оксидореду ктаза ЕС 1.1.1.108) является высокоспецифичной для L-карнитина и НАД+ [2]. Фермент был выделен из четырех различных видов бактерий: Pseudomonas, Xanthomonas, Alcaligenes, Agrobacterium [20]. Ген из Xanthomonas translucens карнитиндегидрогеназы клонировали и выделили в Е. coli [20]. Далее дегидрокарнитин расщепляли, чтобы получить бетаин и, по возможности, ацетат. Ко ASH и АТФ стимулировали образование глицинбетаина, и оно проходило при наличии ацетонилтриметиламмо-ния, который, возможно, является продуктом неферментативного декарбокси-лирования неустойчивой (3-кетокислоты-дегидрокарнитина.
У некоторых видов бактерий карни-тин метаболизируется первоначально путем разрыва связи C4-N с образованием триметиламина и малата (рис. 5).
Такой путь был впервые продемонстрирован Unemoto и др. в 1966 г. у Steratia marcescens [20]. Впоследствии было показано, что Acinetobacter calcoaceticus 69/V, выращенные с DL-кар-нитином, ацил-L-Kapi штиновыми эфирами ил и у-бутиробетаином с дополнительным источником азота, метаболизировали эти бетаины, образуя триметиламин. D-карнитин метаболизировался, если в
Н3С —— сн, — сн, — сн, — соо
сн3
2-оксоглутарат,
1
у-бутиробетаин
у-бутиробетаингидроксилаза (ЕС 1. 14. 11. 1)
Ь-карнитин
Ь-карнитиндегидрогеназа (ЕС 1. 1. 1. 108)
О,, Ие , аскорбат
СН3 ОН
I I
НзС — — СН, — С — СН, — СОО
I ■ I
СН3 Н
НАД+
НАДН СН3 О
I II
Н3С — ГЧ+ — СН2 — С — СН2 — СОО СН;
С,-группа
СНз О
I
Н,С — — СН2 — СОО' Н,С — — СН2 — С — СН
Дегидрокарнитин
СН3 Глицинбетаин СН3 Ацетонилтриметил
аммонии
Мстильные группы
Глицин
Рис. 4. Аэробный путь распада у-бутиробетаина и карнитина у микрооргани змов.
инкубационной среде присутствовал дополнительный источник азота, такой как Ь-карнитин. Триметиламин не образовывался из холина или глицинбетаина [16]. Эта бактерия могла расти на ЭЬ-малате и сук-цинате, продуктах расщепления С4-1М-свя-зи карнитина и у-бутиробетаина. Суспен-
зия “покоящихся” клеток А. са1соасеиси5. выращенных на у-бутиробетаине и ЭЬ-карнитине, эффективно расщепляет 1)Ь-3-флюро-4-И,К ^-триметил аминобути-рат, 5-М,1Ч,1Ч-триметиламинопентановую кислоту и кротонобетаин с образованием триметиламина. “Покоющиеся” (“неделя-
СН3 ОН СН3
I | монооксигеназа |
CHj—N+—СНг—С—CHr-СОО' ------------^ ► Н3С—N
I | I триметиламин
СН3 Н НАД(Ф)Н \ СН3
ОН О ОН
| дегидрогеназа ^ |
ООС—С—СИ,—СОО' м------------------ С—С—СНт—СОО'
I НАД(Ф)Н / I яблочный полуальдегид
Н Н н
яблочная кислота
Рис. 5. Образование триметиламииа у бактерий аэробным распадом Q—N связи карнитина.
щиеся”) клетки не образуют триметиламин из глицинбетаина или 3-М,Т4,М-три-метиламинопентановой кислоты [9].
В бесклеточных экстрактах АстешЬасЮт са1соасеиси5 69/У был продемонстрирован ферментативный разрыв С4-Ы-связи Ь-карнитина, О-карнитина, кротонобетаина и у-бутиробетаина (но не глицинбетаина или холина) [25]. Одновременно с разрывом С4-И-связи происходит гидроксилирование, образуется триметиламин и янтарный полуальдегид в результате расщепления у-бутиробетаина или яблочного полуальдегида из карнитина (рис. 5).
Используя культуры А. сакюасйюш АТСС 39648, ЭкиШо и др. [20] продемонстрировали монооксигеназный катализ расщепления ОЬ-карнитина с образованием триметиламииа и яблочной кислоты.
Первой ступенью было гидроксилирование у четвертого углеродного атома, для чего требовался молекулярный кислород. Полученный неустойчивый промежуточный продукт спонтанно распадался на триметиламин и яблочный полуальдегид посредством обратной аль-дольной реакции. Последовательность
реакций зависела от концентраций как НАД+, так и НАДФ+. Образование три-метил амина из у-бутиробетаина и кротонобетаина было также подтверждено при выделении вышеуказанного фермента [11].
Анаэробный путь превращения карнитина j микроорганизмов
В анаэробных условиях энтеробактерии не ассимилируют углерод и азот, а метаболизируют его посредством превращения кротонобетаина в у-бутиробетаин в присутствии других углеродных и азотных источников (рис. 6). Впервые было показано, что Е. coli, выделенный из кишечной полости крысы, восстанавливает L-карнитин до у-бутиробетаина [24]. Такое превращение связано со стимуляцией анаэробного роста энтеробактерий, в том числе и Proteus vulgaris [20], растущих в сложной среде. Преобразование происходит с помощью двух ферментативных реакций: дегидратации и восстановления. Восстановление промежуточного кротонобетаина ответственно за стимуляцию роста. Добавление нитратов
сн, он
I ■ I
Н3С — Ы+ — СН2 — С — СН2 — СОО' СНз Н
Н-,0 -Н20
Ь-карнитин
1
Карнитиндегидратаза (ЕС 4. 2. 1.89)
СН, Н
І ‘ I
НчС — М+ — СН, — С=С — СОО'
I ■ I
СН3 Н
Кротонобетаин
1
+2е, 2Н+
Кротонобетаинредуктаза
СН,
Н3С — И+ — СН2 — СН2 — СН2 — СОО' СНз
у-бутиробетаин
Рис. 6. Анаэробный путь превращения Ь-карнитина в у-бутиробетаин у микроорганизмов.
или ]М-окиси триметиламина в бактериальные культуры полностью подавляет метаболизм карнитина, а добавление фумарата существенно тормозит этот процесс. Таким образом, карнитин может служить в качестве акцептора электронов при анаэробном росте энтеробактерий в отсутствие предпочтительных субстратов. Это может быть его основной функцией для данного процесса.
Карнитиндегидратаза (Ь-карнитин гидролиаза, ЕС 4.2.1.89) из Е. соИ 044 К74 представляет собой индуцибельный фер-
мент, обнаруженный в клетках, выращенных анаэробно в присутствии Ь-карнитина или кротонобетаина. Очищенный фермент является высокоспецифичным для Ь-карнитина: ацил-Ь-карнитиновые эфиры с различной длиной цепи и кар-боксиэфиры Ь-или Б-карнитина не являлись субстратами для очищенного фермента. Во время очистки был выделен до сих пор не идентифицированный кофактор, необходимый для реакции. Г)-карни-тин, у-бутиробетаин и холин являются конкурентными ингибиторами гидрата-
ции кротонобетаина [13]. Присоединение воды через двойную связь транскротоно-бетаина происходит по стереоспецифич-ному механизму.
Активность кротонобетаинредукта-зы выявлялась в экстрактах Е. соП 044 К74, выращенных анаэробно в средах с добавлением Ь-карнитина или кротонобетаина.
Был идентифицирован ген, кодирующий карнитиндегидратазу Е. соИ (са1В) [8]. Экспрессия са1В подтвердила молекулярную массу фермента (45 кДа) и показала, что для каталитической активности необходима его посттрансляционная модификация.
Са1В - это часть са1 оперона, который содержит пять дополнительных открытых для считывания фрагментов (са1 ТАВСОЕ) и транскрибируется во время анаэробного роста в присутствии Ь-кар-нитина. В живых организмах экспрессия са1 оперона приводит к синтезу пяти полипептидов в дополнение к Са1В. Проведенный ферментный анализ указывает на то, что каждый протеин имеет свою функцию. СаГГ был предложен как переносчик для карнитина и/или других бетаинов, Са!Б - это оксидоредуктаза, а Са1С - кротонобетаин/карнитин КоА ли-газа. Установлено, что Са1Э проявляет сходство аминокислотной последовательности с еноилгидратазой. Выработка Са1Е в большом количестве стимулирует активность карнитинрацемазы Са1Э и заметно увеличивает уровень активности карнитиндегидратазы. Было сделано заключение, что Са1Е - фермент, вовлеченный в синтез или активацию неиден-тифицированного кофактора, необходимого для активности карнитиндегидратазы (Са1В) [6].
Участок, соседний с са1 ТАВСБЕ опероном содержит ген (са1Е), который кодирует протеин (Са1Р). Экспрессия са1Р гена стимулируется карнитином, но под-
вергается анаэробной индукции, связанной с восстановлением нитратафумара-та, который является транскрипциональ-ным регулятором, и активацией белка-рецептора циклического АМФ. Протеин H-NS - регулятор подобный гистону, подавляет экспрессию. Предполагают, что CaiF может быть ключевым элементом в карнитиновом метаболизме у Е. соИ [20].
Обратимая конверсия L-карнитина в у-бутиробетаин - это обычный путь у микроорганизмов. Из общего количества 706 штаммов (436 штаммов бактерий, 37 штаммов актиномицетов и 233 штаммов дрожжей, представляющих 68 генераций), рассортированных по активности карнитиндегидратазы, 162 штамма дрожжей и два штамма актиномицетов были исследованы на предмет образования L-карнитина из транскротонобетаина [20]. Штаммы, относящиеся к Escherichia и Proteus, продуцировали карнитин в наибольшем количестве. Метаболический путь, используемый сейчас для анаэробного производства карнитина в коммерческих целях, был определен Kulla [20] у микроорганизма, изолированного из образцов почвы (ген не специфичный, но таксономически подобен Agrobacterium и Rhisobium). В мутантном штамме НК13 этого организма, L-карнитин был эффективно продуцирован из у-бутиробетаина или транскротонобетаина.
Хотя знания о метаболизме карнитина у бактерий и высших организмов значительно продвинулись за последние 30 лет, остается еще очень много вопросов без ответа. Например, у микроорганизмов несмотря на то, что путь восстановления карнитина до у-бутиробетаина достаточно изучен, многие детали образования триметиламина и общей дессими-ляции карнитина и их регуляция еще не освещены. У млекопитающих имеются ограниченные знания о структуре и ре-
гуляции переносчиков карнитина в таких органах как почки, печень, сердечная и скелетная мышцы, хотя дефект одного или более из этих переносчиков у людей и соответствующей модели на животных известен в течение 10 лет. Мало информации о структуре и регуляции ферментов в ходе биосинтеза карнитина. Роль секреции карнитина и ацилкарнитино-вых эфиров в желчи остается предполагаемой, а значение ацилкарнитиновых эфиров в нормальных физиологических процессах и в механизме развития патологических состояний не до конца исследованы и понятны.
Таким образом, исследования в данной области должны быть продолжены в XXI веке.
ЛИТЕРАТУРА
1. Adams S.H., Esser V., Brown N.F. et al. // Biol. Reprod. - 1998. - Vol. 59 (6). - P. 1399-1405.
2. Aurich H, Kleber HP, Schopp W. // Biochem. Biophys. Asta. - 1966. - Vol.139.
- P.505-507.
3. Bhaird Noirin Nic A., Ramsay Roma R. // Biochem. Soc. Trans. - 1995. - Vol.25 (3). -P. 490.
4. Cohen I., Guillerauet F.? Girard J., Pirp-Buus
C. // J. Biol. Chem. - 2000. - N11. - P. 21 -29.
5. Cohen I., Konl C., McGarry J.D. et al. // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273 (45). -P.29896-29904.
6. Eichler K., Bourgis F., Buchet A. et al. // Mol. Microbiol. - 1994. - Vol. 13. - P. 775-786.
7. Eichler K., Buchet A., Lemke R. et al. // J. Bacteriol. -1996. - Vol. 178. - P. 1248-1257.
8. Eichler K., Schunck W.H., Kleber H.P., Mandrand-Berthelot M.A. // J. Bacteriol. -1994. - Vol. 176. - P. 2970-2975.
9. Englard S., Blanchard J.S., Miura-Fraboni J. // Arch. Microbiol. - 1983. - Vol. 135. -P.305-310.
10. Geonin Ciaran N. // Biochem and Biocem Res. Comm. - 1997. - Vol.238, N3. - P. 784-789.
11. Goulas P.//Biochem. Biophys. Asta. - 1988.
- Vol. 957. - P. 335-339.
12. Hoppel C.L. // Fied. Proc. - 1982. - Vol. 41 (12). - P. 2852-2857.
13. Jung H., Jung K., Kleber H.P. // Biochem.
Biophys. Asta. - 1989. - Vol. 1003. - P. 270-276.
14. Kappes R.M., Kempf B., Bremer E. // J.
Bacteriol. - 1996. - Vol. 178. - P. 5071-5079.
15. McGarry J.D.//Regul. of Metabol. - 1995. ^
- Vol. 48 (7). - P. 2843-2850.
16. Miura-Fraboni J., Englard S. // FEMS
Microbiol. Lett. - 1983. - Vol. 18. - P. 113- *
116.
17. Park E.A., Cook G.A. //Mol Cell Biochem.
- 1998. - Vol. 180 (1-2). - P. 27-32.
18. Paumen M.B., Yasumasa I., Han Hua et al.
// Biochem. & Biophys. Res Commun. -1997. - Vol. 231 (3). - P. 523-525.
19. Peter H., Burkovski A., Kramer R. // J.
Bacteriol. - 1996. - Vol. 178. - P. 5229-5234.
20. Rebouche C.J., Seim H. // Annu. Rev. Nutr.
- 1998.-Vol. 18.-P. 39-61.
21. Roschinger W. et al. // Clin. Chim. Acta. -2000. - Vol. 298 (1-2). - P. 55-68.
22. Saggerson E.D. // Biochem.J. - 1982. - Vol.
202 (2). - P. 397-405.
23. Saggerson E.D, Carpenter C.A, Tselentis •>
B.S. // Biochem. J. - 1982. - Vol. 208 (3). -
P. 667-672.
24. Seim H„ Kleber H.P, Strack E. // Z. Allg. ^
Mikrobiol. - 1979. - Bd. 19. - S. 753-758.
25. Seim H., Loster H., Claus R. et al. // FEMS Microbiol. Lett. - 1982. - Vol. 15. - P. 165-167.
26. Woldegiorgis G., Shi J., Zhu H., Arvidson D.N.
// J. Nutr. - 2000. - Vol. 130 (2). - P. 310-314.
ABOUT QUESTION OF CARNITINE IN REGULATION OF CHANGES PROCESSES IN CELL: MODERN ASRECT
T.V.KremenezkavajYe.A.Stroevl. V.G.Makarova,
D.D.Peskov
In work it’s lighted questiones of biological carnitine action, modern opinions of mitochondrial system of fatty acid transportation mechanisms and specific properties of microorganism carnitine metabolism.
