CC BY
27
2012, Т. 2, № 1-2
Современное лабораторное обеспечение.
ПОЛНОГЕНОМНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММА VIBRIO CHOLERA O1 ELTOR INABA № 301
М.Л. Маркелов1, К.В. Кулешов1, В.Г. Детков1, Г.А. Шипулин1, С.О. Водопьянов2, А.В. Керманов2, В.Д. Кругликов2, A.C Водопьянов2, А.Б. Мазрухо2, Р.В. Писанов2
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва; 2ФКУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону
Введение. В последнее время наибольшую актуальность представляют подходы полногеномного анализа бактериальных изолятов, основанные на использовании методов высокопроизодительного секвенирования, что позволяет оценить структуру генома, проанализировать эпидемиологически значимые маркеры и установить происхождение штамма. Методы. Объектом нашего исследования явился штамм Vibrio cholerae Ol Eltor Inaba № 301 выделенный из морской воды в районе г. Таганрог летом 2011. В этот период в г. Мариуполь (Украина) была зарегистрирована вспышка холеры. Протокол полногеномного секвенирования включал следующие этапы: секвенирования фрагментных библиотек на Roche 454 GS Junior system с использованием версии реактивов Titanium; сборка контигов de novo с помощью программного обеспечения Newbler 2,5, параметры сборки контигов были оптимизированы для получения высоких значений N50.
Результаты. Всего секвенировано 218 882 рида, при этом средняя длина рида составила 350 п.о. В результате сборки de novo собрано 124 контига со средним покрытием 33х, при этом 50% всех секвенированных нуклеотидов была включены в контиги длинной не менее 132 тыс. п.о. Общая длина всех контигов составила порядка 4 млн п.о., GC состав — 47,6%. Автоматическое аннотирование контигов на основе алгоритма Glimmer3 выявило 3680 открытых рамок считывания. Исследуемый изолят 2011EL-0301несет гибридный профаг СТХф локализованный в 1 хромосоме при этом профаг несет ctx B аллель классического типа, аrstR — аллель типа Эль-Тор. Участок VPI-1 включает tcp аллель Эль-Тор типа.
Сравнение полученного генома с различными геномами Vibrio cholerae существующим в базе данных GenBank с использованием алгоритмов выравнивания полногеномных нуклеотидных последовательностей, позволило выявить, что наиболее близкими к исследуемому штамму являются геномы изолятов, выделенных во время вспышек на Гаити в Африке, а также при случаях завоза холеры из Азии (Reimeretal., 2011). Для более детального анализа филогенетического расположения исследуемого штамма среди поздних изолятов выделенных V. cholerae был проведен анализ нуклеотидных последовательностей 29 геномов на основе белок-кодирующих участков ДНК с гомологией более 95%, которые при-сутствали во всех анализируемых геномах. Таким образом, была выделена коровая часть генома длиной порядка 3,2 млн п.о., содержащая филогенетически значимые однонуклеотидные полиморфизмы. По результатам сравнения исследуемый изолят входит вклад изолятов ассоциированных со вспышкой холеры в Южной Африке в 2009 г. (№ 2011EL-1137) и случаями завоза холеры из Пакистана (№ 3582— 05, № 2009V-1116, № 2009V-1046, № 2010V-1014).
Установить взаимосвязь секвенированного штамма Vibrio cholera O1 Eltor Inaba № 301 со штаммами, вызвавшими вспышку на Украине летом 2011, не предоставилось возможным из-за отсутствия сведений о геномах «украинских» штаммов.
Выводы. На наш взгляд внедрение в практику работы специализированных учреждений метода полногеномного секвенирования, основанного на использовании методов высокопроизодитель-ного секвенирования, имеет большие перспективы как в плане установления источника инфекции, так и при мониторинге геномных перестроек возбудителя холеры.
К ВОПРОСУ ОБ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЕ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
В.Ю. Марков
ФБУНЦентральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва
Было предпринята оценка этиологической структуры острых кишечных инфекций (ОКИ) в современный период (данные Ф. № 2) по Москве и Санкт- Петербургу, идентичных по своим особенностям как города — мегаполисы, что отличает их от остальных субъектов РФ, которые характеризуются неоднородной структурой городских и сельских поселений. Изучены материалы за 1995 и 2010 гг. Большая доля ОКИ этиологически нерас-шифрована — в Москве 71,4 и 83,8% за указанные годы, в Санкт-Петербурге — 56,7 и 69,5%. Удельный вес ОКИ установленной этиологии (включая бактериальную дизентерию и другие сальмонелле-зы) составил в Москве 28,6 и 16,2%, а в Санкт-Петербурге — 43,3 и 30,5%. Уменьшение доли ОКИ установленной этиологии на наш взгляд связано с резким снижением бактериальной дизентерии, прежде всего Зонне. Последнее могло повлиять и на статистический рост ОКИ неустановленной этиологии. В структуре ОКИ установленной этиологии в 1995 г. как в Москве, так и Санкт-Петербурге доминировали шигеллезы — 63,3 и 71,2% соответственно, тогда как их доля в 2010 г. составила лишь 8,9 и 4,2%. Доля сальмонеллезов в Москве достаточно значима — 26,8 и 34,3%, в Санкт-Петербурге выражена менее (14,4 и 11,3%), но характеризуется достаточной стабильностью в том и другом городе. В 1995 г. в Москве эшерихиозы составляли 4,9%, иерсиниоз — 3,7%, ротавирусы — 0,6%, др.установленных ОКИ — 0,5%, а в Санкт-Петербурге доля упомянутых инфекций составила 8,6; 1,1; 1,6; 0,005; 3,1 процентов соответственно. К 2010 г. этиологическая структура ОКИ в этих городах претерпела кардинальные изменения, выразившиеся в доминировании инфекций вирусной природы. В Москве ротавирусы составили 44,1%, в Санкт-Петербурге — 46,8%, а норовирусы достигли 3,3% в Москве и 2,3% — в Санкт-Петербурге. Суммарно на эти инфекции приходится 47,4 и 49,1% по этим городам соответственно. Другие бактериальные инфекции составили в Москве: эшери-хиозы — 1,4%, кампилобактерии — 0,2%, иерси-ниоз — 2,1%, других установленных ОКИ — 5,7%, а в Санкт-Петербурге доля упомянутых инфекций составила — 11,7; 1,6; 1,4; 20,7 процентов соответственно. Таким образом, изменения этиологической структуры ОКИ явились результатом сниже-
Материалы X съезда ВНПОЭМП, Москва, 12-13 апреля 2012 г.
Инфекция и иммунитет
ния эпидемиологической значимости отдельных бактериальных инфекций, с одной стороны, и широким внедрением в практику новейших методов детекции кишечных вирусов (в частности ПЦР-диагностики) с другой. Вместе с тем, считаем возможным напомнить, что проведенное в середине 80-х годов прошлого века комплексное клинико-лабораторное и эпидемиологическое исследование у госпитализированных больных (взрослых и детей) в Москве установило этиологию ОКИ в целом в 80,8% случаев и лишь в 19,2% этиологическая природа заболеваний не выявлена.
ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР-РВ
А.А. Марова, А.С. Оксанич, А.Н. Каира, Г.Н. Бахтояров, В.В. Зверев, Е.Б. Файзулоев
ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва
Острые кишечные инфекции (ОКИ) в структуре инфекционных заболеваний занимают второе место, уступая только острым респираторным заболеваниям. По данным Роспотребнадзора ежегодный темп прироста по этой группе нозологий за последние 7 лет составлял 6,0—7,0%, а на долю ОКИ неустановленной этиологии приходилось не менее 2/3 всех случаев. В 2010 г. заболеваемость ОКИ установленной этиологии по сравнению с предыдущим годом выросла на 14,0%, а ОКИ неустановленной этиологии — на 18,6%. В 2011 г. было зарегистрировано незначительное снижение ОКИ установленной этиологии — на 4,4%, а ОКИ неустановленной этиологии — на 12,9%. Такой пик на графике заболеваемости ОКИ можно объяснить активной циркуляцией кишечных вирусов, удельный вес которых в структуре ОКИ установленной этиологии по сравнению с 2009 годом увеличился на 5,0%. При этом регистрируемая заболеваемость ротавирусными инфекциями выросла на 25%, а норовирусными инфекциями — в 2,4 раза.
Целью настоящей работы являлась апробация метода мультиплексной ПЦР-РВ для дифференциальной диагностики кишечных вирусов и оценки их вклада в этиологическую структуру ОКИ.
В ходе исследования была подобрана панель клинических образцов (фекальные экстракты) от людей с симптомами ОКИ (n = 697) из различных районов Московской и Омской областей, собранных в период с 2008 по 2011 годы. Из имеющихся образцов только 115 (16,5%) имели установленную этиологию: 7 (6,1%) содержали аденовирусы, 88 (76,5%) — ротавирусы и 20 (17,4%) — энтеровирусы. Все образцы были проанализированы с помощью лабораторного образца набора реагентов, основанного на методе мультиплексной ПЦР-РВ, на наличие нуклеиновых кислот 11 групп кишечных вирусов: аденовирусов, энтеровирусов, полиови-русов, вирусов гепатитов А и Е, ротавирусов групп А и С, ортореовирусов, норовирусов, саповирусов и астровирусов. В результате РНК ротавирусов группы А была выявлена в 272 образцах, норови-русов — 66, астровирусов — 9, энтеровирусов — 28, саповирусов — 9, ортореовирусов — 1, ДНК аденовирусов — 31, а в 84 случаях была выявлена сме-
шанная вирусная инфекция. Это позволило для групп обследованных пациентов выявить вероятного возбудителя ОКИ в 71,7% случаев.
Таким образом, внедрение диагностических наборов на основе метода мультиплексной ПЦР-РВ в лабораториях системы эпиднадзора позволит улучшить качество эпидемиологических исследований и повысить долю кишечных заболеваний с установленной этиологией.
АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ STAPHYLOCOCCUS AUREUS, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЯЗВЕННЫХ ДЕФЕКТОВ У ПАЦИЕНТОВ С СИНДРОМОМ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ СТОПЫ
Н.А. Мациевский1, Н.С. Козлова1, Б.И. Делиев1, Е.П. Баранцевич2
1ГБОУ ВПО Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург; 2ФГУ «Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова Росздрава», Санкт-Петербург
Синдром диабетической стопы остается наиболее тяжелым хроническим осложнением сахарного диабета. Прогноз у таких пациентов значительно ухудшается при инфицировании язвенных дефектов, и информация об устойчивости их микрофлоры к антибактериальным препаратам является крайне актуальной.
Из язвенных дефектов 42 пациентов стационара с синдромом диабетической стопы были выделены 98 штаммов микроорганизмов, среди которых преобладали культуры Staphylococcus aureus (31,6%). У 31 выделенного штамма Staphylococcus aureus методом серийных разведений в среде Мюллер-Хинтон была определена чувствительность к шести антимикробным препаратам. Все изученные штаммы стафилококков оказались резистентны хотя бы к одному антибиотику, при этом среди них безусловно преобладали культуры, устойчивые к пенициллину (96,8%). Более половины штаммов оказались резистентны к ципрофлоксацину (64,5%) и оксациллину (61,3%), более трети — к эритромицину (41,9%). Значительно меньшим было количество штаммов, устойчивых к клиндамицину (9,7%). Наибольшую активность в отношении S. aureus проявлял ванкомицин, к которому был выявлен только один умеренно устойчивый штамм (3,2%). Важно отметить высокий удельный вес полирезистентных культур Staphylococcus aureus, устойчивых к трем и более антимикробным препаратам, который составил более двух третей изученных штаммов (71,0%), при этом большая их часть оказалась метициллинрезистентными (81,8%). Только один устойчивый к метициллину штамм Staphylococcus aureus был чувствителен к препаратам с другими механизмами действия.
Таким образом, среди Staphylococcus aureus, выделенных из язвенных дефектов пациентов стационара с синдромом диабетической стопы, был выявлен высокий удельный вес культур, устойчивых к пенициллину, ципрофлоксацину, оксациллину и эритромицину, с превалированием полирезистентных штаммов, большинство из которых оказалось ме-тициллинрезистентными. Наибольшую активность в отношении Staphylococcus aureus сохраняет ванко-мицин, к которому был выявлен только один умеренно устойчивый штамм (3,2%).
