CC BY
45
Материалы X съезда ВНПОЭМП, Москва, 12-13 апреля 2012 г.
Инфекция и иммунитет
от больных были выделены галофильные вибрионы. Другие микроорганизмы при исследовании на патогенную кишечную флору не обнаружены. Штаммы Vibrio parahaemolyticus, обусловившие вспышку пищевой токсикоинфекции в г. Владивостоке в 1997 г. относились к серогруппе О3:К6 и не были охарактеризованы по продукции умеренных фагов.
Целью нашей работы стало изучение лизогении у штаммов парагемолитических вибрионов серо-группы О3:К6, а также характеристика выделенных умеренных бактериофагов по их специфичности и литической активности.
В исследования были включены 33 штамма парагемолитических вибрионов серогруппы О3:К6. В качестве индикаторных штаммов использовались культуры V. parahaemolyticus КМ-97 и КМ-184. В экспериментах испытали односуточные бульонные культуры, половина которых была инактивированна хлороформом, другая — прогреванием при 56°С в течении 40 мин. Выделение фагов и их изучение проводили по общепринятым методам (Адамс М., 1961).
Результаты показали, что 13 штаммов V. para-haemolyticus являются продуцентами умеренных фагов. Фаги формировали на газонах индикаторных штаммов типичные негативные колонии с полупрозрачным плотным центром 0,5—2 мм, с ровным краем. Концентрацию фаговых частиц выявляли методом агаровых слоев по Грациа. Титр фагов составлял n х 108 БОЕ/мл.
Фаги, продуцируемые лизогенными штаммами парагемолитических вибрионов, являются специфичными, лизируя парагемолитические и алги-нолитические вибрионы. Среди микроорганизмов близкородственных видов, родов и семейств чувствительных к умеренным фагам не обнаружено.
Выделенные умеренные фаги, при изучении диапазона действия, проявляли активность в отношении штаммов V. parahaemolyticus, у которых отсутствовали детерминанты вирулентности (tdh-trh-). Штаммы V. parahaemolyticus с детерминантами вирулентности в различных сочетаниях не лизировались фагами.
Таким образом, нами впервые выделены фаги из штаммов V. parahaemolyticus серогруппы О3:К6 и проведена их первичная характеристика по специфичности и литической активности.
ПЕРСИСТЕНЦИЯ ВИРУСА ЭПШТЕЙНА-БАРР
В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ЖЕЛУДКА
ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГАСТРОДУОДЕНИТЕ У ДЕТЕЙ
Г.В. Кузьмина1, М.Ю. Деменчук1, К.Б. Кочетко1, И.В. Федосеева1, Р.М. Левит2
ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ярославской области»; ГУЗ ЯО ДКБ № 1, г. Ярославль
В последние годы существенно расширились представления об этиологии хронического гастро-дуоденита (ХГД). При сохраняющейся значительной роли Helicobacter pylori (Нр), активно обсуждается вопрос о значении некоторых вирусных инфекций, среди которых большое внимание уделяется герпес-вирусам, в частности вирусу Эпштейна—Барр (ВЭБ).
Цель работы: Определить частоту персистенции вируса Эпштейна—Барр в слизистой оболочке верхних отделов желудочно-кишечного тракта, ее ассоциацию с Helicobacter pylori-инфекцией при хроническом гастродуодените у детей.
Материалы и методы. обследовано 97 детей в возрасте от 7 до 15 лет больных ХГД. Программа исследования включала в себя оценку клинико-анамнестических данных, эзофагогастродуодено-скопию с последующим морфологическим исследованием материала биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки. Выявление инфекции Helicobacter ру^п осуществлялось с помощью 5 методик: быстрого уреазного теста, гистологического, определение ДНК инфекта в слизистой оболочке желудка методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием тест систем фирмы «ДНК-Технология», г. Москва, серологического метода с применением тест-системы «ХеликоБест— антитела» для определения суммарных антител к антигену Cag АНр в сыворотке крови (производитель «Вектор-Бест», г. Новосибирск), дыхательного теста. Диагностика ВЭБ-инфекции осуществлялась с использованием ИФА сыворотки крови с качественным и количественным определением антител к антигенам вируса (ядерному антигену, капсидному антигену класса М и G к ранним белкам вируса ВЭБ класса G). Маркеры VCA — IgM и ЕА — IgG ВЭБ соответствуют активации вирусной инфекции и определялись качественно, а NA — IgG и VCA — IgG ВЭБ — количественно и выражались в условных единицах на 1 мл сыворотки (усл. ед/мл). Выявление ДНК вируса Эпштейна—Барр в слизистой оболочке желудка осуществлялось с использованием тест систем фирмы «ДНК-Технология» (г. Москва) методом ПЦР.
Результаты. Установлено, что персистенция ВЭБ в слизистой оболочке верхних отделов желудочно-кишечного тракта при хроническом гастродуоде-ните у детей имеет место у трети пациентов, причем в большинстве случаев (79%) ассоциируется с ^l^obacter pylori-инфекцией. При Нр-негативном варианте заболевания вирус обнаруживается в единичных случаях. Выявлено прямое влияние персистенции вируса Эпштейна—Барр на характер па-томорфологических нарушений при хроническом гастродуодените у детей. Показано, что ассоциация ВЭБ — и Нр-инфекцией приводит к распространенному воспалительному процессу с формированием пангастрита, увеличению степени его выраженности и активности.
Таким образом, при диагностике хронического гастродуоденита у детей следует принимать во внимание его полиморфизм в отношении различных сочетаний ^l^obacter pylori и Эпштейна—Барр-инфекции. Детей с хроническим гастродуоденитом при ассоциации ^l^obacter pylori и Эпштейна— Барр-инфекции следует рассматривать как угрожаемых по более тяжелому течению и устойчивому к лечению заболевания.
РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЯ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ
В.Е. Куклев, Н.А. Осина, А.С. Абдрашитова, А.М. Сеничкина, Т.В. Бугоркова, И.В. Шульгина, О.А. Лобовикова, С.А. Щербакова, В.В. Кутырев
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», г. Саратов
На основании проведенных нами ранее исследований были разработаны качественно новые генодиагностические препараты для индикации возбуди-
2012, Т. 2, № 1-2
Современное лабораторное обеспечение.
телей чумы и туляремии в биологическом материале и объектах окружающей среды: «Ген Yersinia pestis индикация — РГФ» и «Ген Francisella tularensis — РГФ», а также для ускоренной идентификации штаммов чумного микроба (определение видовой принадлежности, дифференцирование авирулентных штаммов, определение плазмидного профиля изолятов): «Ген Yersinia pestis идентификация — РГФ». Первые две тест-системы основаны на выявлении видоспе-цифичных генов 3a (Y. pestis) и iglBC (F. tularensis). Набор «Ген Yersinia pestis идентификация — РГФ» подразумевает использование шести пар прайме-ров, обеспечивающих амплификацию генов 3а (ви-доспецифичный фрагмент хромосомы), irp2 и hmsH (хромосомная область пигментации), cafl (плазмида pFra), pla (плазмида pPst), lcrV (плазмида pCad).
Технические испытания разработанных наборов реагентов проводили на базе ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», в соответствии с техническими условиями и инструкциями по применению. Результаты технических испытаний свидетельствуют о соответствии образцов разработанных наборов требованиям технических условий, ГОСТ Р 51352-99, ГОСТ Р 5108897, ГОСТ Р 51609-2000, приказа № 735 от 30.10.2006 Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Медицинские испытания разработанных наборов проводили на базе ФБУН ГНЦ ПМБ и ФКУЗ «Ставропольский НИПЧИ». Всего изучено 516 проб (от 138 до 196 проб для каждого из наборов). В результате для всех тест-систем подтверждены все заявленные диагностические показатели по чувствительности, специфичности и воспроизводимости.
На все наборы получены регистрационные удостоверения (№ ФСР 2011/12105 от 13.10.2011 г.; № ФСР 2011/12106 от 14.10.2011 г.; № ФСР 2011/12107 от 14.10.2011 г.).
Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009— 2013 гг.)».
ПОЛНОГЕНОМНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММА VIBRIO CHOLERA O1 ELTOR INABA № 301
К.В. Кулешов1, М.Л. Маркелов1, В.Г. Детков1, Г.А. Шипулин1, С.О. Водопьянов2, А.В. Керманов2, В.Д. Кругликов2, A.C Водопьянов2, А.Б. Мазрухо2, Р.В. Писанов2
1ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва; 2ФКУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону
Введение. В последнее время наибольшую актуальность представляют подходы полногеномного анализа бактериальных изолятов, основанные на использовании методов высокопроизодительного секвенирования, что позволяет оценить структуру генома, проанализировать эпидемиологически значимые маркеры и установить происхождение штамма. Методы. Объектом нашего исследования явился штамм Vibrio cholerae O1 Eltor Inaba № 301 выделенный из морской воды в районе г. Таганрог летом 2011. В этот период в г. Мариуполь (Украина) была зарегистрирована вспышка холеры. Протокол полногеномного секвенирования включал следующие этапы:
секвенирования фрагментных библиотек на Roche 454 GS Junior system с использованием версии реактивов Titanium; сборка контигов de novo с помощью программного обеспечения Newbler 2,5, параметры сборки контигов были оптимизированы для получения высоких значений N50.
Результаты. Всего секвенировано 218 882 рида, при этом средняя длина рида составила 350 п.о. В результате сборки de novo собрано 124 контига со средним покрытием 33х, при этом 50% всех секвенированных нуклеотидов была включены в контиги длинной не менее 132 тыс. п.о. Общая длина всех контигов составила порядка 4 млн п.о., GC состав — 47,6%. Автоматическое аннотирование контигов на основе алгоритма Glimmer3 выявило 3680 открытых рамок считывания. Исследуемый изолят 2011EL-0301несет гибридный профаг СТХф локализованный в 1 хромосоме при этом профаг несет ctx B аллель классического типа, аrstR — аллель типа Эль-Тор. Участок VPI-1 включает tcp аллель Эль-Тор типа. Сравнение полученного генома с различными геномами Vibrio cholerae существующим в базе данных GenBank с использованием алгоритмов выравнивания полногеномных нуклеотидных последовательностей, позволило выявить, что наиболее близкими к исследуемому штамму являются геномы изолятов, выделенных во время вспышек на Гаити в Африке, а также при случаях завоза холеры из Азии (Reimeretal., 2011). Для более детального анализа филогенетического расположения исследуемого штамма среди поздних изолятов выделенных V. cholerae был проведен анализ нуклеотидных последовательностей 29 геномов на основе белок-кодирующих участков ДНК с гомологией более 95%, которые присутствали во всех анализируемых геномах. Таким образом, была выделена коровая часть генома длиной порядка 3,2 млн п.о., содержащая филогенетически значимые однонукле-отидные полиморфизмы. По результатам сравнения исследуемый изолят входит вклад изолятов ассоциированных со вспышкой холеры в Южной Африке в 2009 г. (№ 2011EL-1137) и случаями завоза холеры из Пакистана (№ 3582-05, № 2009V-1116, № 2009V-1046, № 2010V-1014). Установить взаимосвязь секвениро-ванного штамма Vibrio cholera O1 Eltor Inaba № 301 со штаммами, вызвавшими вспышку на Украине летом 2011, не предоставилось возможным из-за отсутствия сведений о геномах «украинских» штаммов.
Выводы. На наш взгляд внедрение в практику работы специализированных учреждений метода полногеномного секвенирования, основанного на использовании методов высокопроизодитель-ного секвенирования, имеет большие перспективы как в плане установления источника инфекции, так и при мониторинге геномных перестроек возбудителя холеры.
ПОДБОР ОПТИМАЛЬНОГО АНТИГЕННОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЛИОИДОЗНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА
А.С. Куликова, А.А. Будченко, И.Ю. Мазурова, М.Я. Кулаков, А.М. Степурина, К.А. Павлова
ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
В схеме диагностики сапа и мелиоидоза одним из самых распространенных серологических методов является реакция непрямой геммаглютинации, ко-
