CC BY
43
2012, Т. 2, № 1-2
Современное лабораторное обеспечение.
телей чумы и туляремии в биологическом материале и объектах окружающей среды: «Ген Yersinia pestis индикация — РГФ» и «Ген Francisella tularensis — РГФ», а также для ускоренной идентификации штаммов чумного микроба (определение видовой принадлежности, дифференцирование авирулентных штаммов, определение плазмидного профиля изолятов): «Ген Yersinia pestis идентификация — РГФ». Первые две тест-системы основаны на выявлении видоспе-цифичных генов 3a (Y. pestis) и iglBC (F. tularensis). Набор «Ген Yersinia pestis идентификация — РГФ» подразумевает использование шести пар прайме-ров, обеспечивающих амплификацию генов 3а (ви-доспецифичный фрагмент хромосомы), irp2 и hmsH (хромосомная область пигментации), cafl (плазмида pFra), pla (плазмида pPst), lcrV (плазмида pCad).
Технические испытания разработанных наборов реагентов проводили на базе ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», в соответствии с техническими условиями и инструкциями по применению. Результаты технических испытаний свидетельствуют о соответствии образцов разработанных наборов требованиям технических условий, ГОСТ Р 51352-99, ГОСТ Р 5108897, ГОСТ Р 51609-2000, приказа № 735 от 30.10.2006 Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Медицинские испытания разработанных наборов проводили на базе ФБУН ГНЦ ПМБ и ФКУЗ «Ставропольский НИПЧИ». Всего изучено 516 проб (от 138 до 196 проб для каждого из наборов). В результате для всех тест-систем подтверждены все заявленные диагностические показатели по чувствительности, специфичности и воспроизводимости.
На все наборы получены регистрационные удостоверения (№ ФСР 2011/12105 от 13.10.2011 г.; № ФСР 2011/12106 от 14.10.2011 г.; № ФСР 2011/12107 от 14.10.2011 г.).
Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009— 2013 гг.)».
ПОЛНОГЕНОМНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММА VIBRIO CHOLERA O1 ELTOR INABA № 301
К.В. Кулешов1, М.Л. Маркелов1, В.Г. Детков1, Г.А. Шипулин1, С.О. Водопьянов2, А.В. Керманов2, В.Д. Кругликов2, A.C Водопьянов2, А.Б. Мазрухо2, Р.В. Писанов2
1ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва; 2ФКУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону
Введение. В последнее время наибольшую актуальность представляют подходы полногеномного анализа бактериальных изолятов, основанные на использовании методов высокопроизодительного секвенирования, что позволяет оценить структуру генома, проанализировать эпидемиологически значимые маркеры и установить происхождение штамма. Методы. Объектом нашего исследования явился штамм Vibrio cholerae O1 Eltor Inaba № 301 выделенный из морской воды в районе г. Таганрог летом 2011. В этот период в г. Мариуполь (Украина) была зарегистрирована вспышка холеры. Протокол полногеномного секвенирования включал следующие этапы:
секвенирования фрагментных библиотек на Roche 454 GS Junior system с использованием версии реактивов Titanium; сборка контигов de novo с помощью программного обеспечения Newbler 2,5, параметры сборки контигов были оптимизированы для получения высоких значений N50.
Результаты. Всего секвенировано 218 882 рида, при этом средняя длина рида составила 350 п.о. В результате сборки de novo собрано 124 контига со средним покрытием 33х, при этом 50% всех секвенированных нуклеотидов была включены в контиги длинной не менее 132 тыс. п.о. Общая длина всех контигов составила порядка 4 млн п.о., GC состав — 47,6%. Автоматическое аннотирование контигов на основе алгоритма Glimmer3 выявило 3680 открытых рамок считывания. Исследуемый изолят 2011EL-0301несет гибридный профаг СТХф локализованный в 1 хромосоме при этом профаг несет ctx B аллель классического типа, аrstR — аллель типа Эль-Тор. Участок VPI-1 включает tcp аллель Эль-Тор типа. Сравнение полученного генома с различными геномами Vibrio cholerae существующим в базе данных GenBank с использованием алгоритмов выравнивания полногеномных нуклеотидных последовательностей, позволило выявить, что наиболее близкими к исследуемому штамму являются геномы изолятов, выделенных во время вспышек на Гаити в Африке, а также при случаях завоза холеры из Азии (Reimeretal., 2011). Для более детального анализа филогенетического расположения исследуемого штамма среди поздних изолятов выделенных V. cholerae был проведен анализ нуклеотидных последовательностей 29 геномов на основе белок-кодирующих участков ДНК с гомологией более 95%, которые присутствали во всех анализируемых геномах. Таким образом, была выделена коровая часть генома длиной порядка 3,2 млн п.о., содержащая филогенетически значимые однонукле-отидные полиморфизмы. По результатам сравнения исследуемый изолят входит вклад изолятов ассоциированных со вспышкой холеры в Южной Африке в 2009 г. (№ 2011EL-1137) и случаями завоза холеры из Пакистана (№ 3582-05, № 2009V-1116, № 2009V-1046, № 2010V-1014). Установить взаимосвязь секвениро-ванного штамма Vibrio cholera O1 Eltor Inaba № 301 со штаммами, вызвавшими вспышку на Украине летом 2011, не предоставилось возможным из-за отсутствия сведений о геномах «украинских» штаммов.
Выводы. На наш взгляд внедрение в практику работы специализированных учреждений метода полногеномного секвенирования, основанного на использовании методов высокопроизодитель-ного секвенирования, имеет большие перспективы как в плане установления источника инфекции, так и при мониторинге геномных перестроек возбудителя холеры.
ПОДБОР ОПТИМАЛЬНОГО АНТИГЕННОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЛИОИДОЗНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА
А.С. Куликова, А.А. Будченко, И.Ю. Мазурова, М.Я. Кулаков, А.М. Степурина, К.А. Павлова
ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
В схеме диагностики сапа и мелиоидоза одним из самых распространенных серологических методов является реакция непрямой геммаглютинации, ко-
Материалы X съезда ВНПОЭМП, Москва, 12-13 апреля 2012 г.
Инфекция и иммунитет
торая относится к числу наиболее чувствительных и простых полуколичественных методов.
Цель работы — выявление штамма B.pseudomallei с оптимальным составом антигенов для создания чувствительного и специфичного мелиоидозного эритроцитарного антигенного диагностикума.
Для создания диагностикума использовали антигены штаммов возбудителя мелиоидоза и близкородственного вида B. thailandensis с различной вирулентностью (ЛД50 для золотистых хомячков: B. pseudomallei 57 576 (< 101 м.к.), B. pseudomallei 111 (< 101 м.к.), B. pseudomallei 107 (> 107 м.к.) и B. thailandensis 264 (> 106 м.к.). Антигенные препараты получали водно-солевой экстракцией и осаждением 40% сульфатом аммония. Состав оценивали в реакции имму-нодиффузии и иммуноэлектрофорезе. Полученная фракция содержала нейтральный антиген 8 и отрицательно заряженный антиген d, присутствующие во всех штаммах B. pseudomallei коллекции инститита и играющие роль при идентификации мелиоидоза.
Диагностикумы проверяли в РНГА с сапными и мелиоидозными сыворотками: гипериммунными, иммунными и от зараженных животных. РНГА с анализируемыми диагностикумами позволила выявить антитела в гипериммунных сыворотках в разведениях от 1:5000 до 1:100 000, а в сыворотках животных, зараженных сапом и мелиоидозом (белая крыса и морская свинка) — от 1:80 до 1:640. РНГА с диагностикумами на основе антигенов B.pseudomallei 107 и смеси антигенов B. pseudomallei 57 576 и 111 с сыворотками кроликов, вакцинированных авирулентными живыми культурами B. pseudomallei VPA, 107 и B. thailandensis 264 выявила титры от 1:640 до 1:2560. РНГА с диагностикумом на основе антигенов B. thailandensis 264 выявила максимальный титр 1:640 с этими же сыворотками. Контроль специфичности осуществляли, используя гетерологичные иммунные сыворотки и интактные сыворотки лабораторных животных. РНГА со всеми диагностикумами с гетерологичными сыворотками показала титры антител от 0 до 1:140, а с интакт-ными сыворотками — от 0 до 1:40. Диагностикум на основе антигена B. pseudomallei 107 показал большую специфичность и чувствительность. Учитывая авирулентность B. pseudomallei 107, из этого штамма получали комплекс антигенов, оптимальный для создания мелиоидозного эритроцитарного диагно-стикума.
ПЕРСПЕКТИВЫ МОНИТОРИРОВАНИЯ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ENTEROBACTERIACEAE МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ Б.Р. Кулуев12, Д.Н. Дубровская2, Д.Я. Хайдарова2, И.А. Шакирова2, А.Р. Мавзютов2
1Учреждение Российской академии наук Институт биохимии
и генетики Уфимского научного центра РАН;
2ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России, г. Уфа
В настоящее время для контроля за распространением антибиотикоустойчивости и профилактики внутрибольничных инфекций преимущественно используются методы серийных разведений, диско-диффузионный, Е-тест. Они отличаются трудоемкостью, продолжительностью и низкой воспроизводимостью, поскольку ориентированы на выявление
фенотипических признаков. Указанное не позволяет использовать их для решения эпидемиологических задач.
В связи с этим нами был проведен поиск нуклеотидных последовательностей генов Enterobacteriaceae, отвечающих за их антибиоти-коустойчивость и подобраны соответствующие праймеры, характеризующиеся схожими температурами отжига, но разными размерами ампликонов для возможности в дальнейшем множественной ПЦР и одновременной детекции нескольких генов антибиотикоустойчивости. В качестве тестовых использовали 150 клинических штаммов условно-патогенных энтеробактерий (Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus morganii и Escherihia coli). В результате проведенных исследований нам удалось обнаружить 10 исследуемых генов, а именно гены marA, marQ гены устойчивости к амино-гликозидам, сульфаниламидам, тетрациклину, фосфомицину, бацитрацину, эритромицину, три-метоприму и блеомицину, тогда как гены устойчивости к тобрамицину, гентамицину, хлорамфени-колу и альбицидину выявлены не были. У Klebsiella pneumoniae обнаруживаются гены устойчивости к 6 антибиотикам (аминогликозидам, сульфаниламидам, фосфомицину, эритромицину, триме-топриму, блеомицину) и два гена множественной антибиотикоустойчивости — marA и marG Причем 4 штамма Klebsiella pneumoniae имели гены устойчивости к трем антибиотикам и 2 штамма к двум антибиотикам одновременно. У E. coli обнаруживались гены резистентности к 3 антибиотикам (сульфаниламидам, тетрациклину, бацитрацину), причем практически все анализируемые штаммы были резистентны к бацитрацину. Для Proteus mirabilis был характерен лишь ген устойчивости к эритромицину. Чаще всего резистентность среди условно-патогенных энтеробактерий наблюдалась к триметоприму, тетрациклину, бацитрацину, сульфаниламидам, фосфомицину. Реже встречалась устойчивость к блеомицину и эритромицину.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг., в рамках реализации мероприятия 1.2.1. (ГКП385от 30.07.2009).
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ХЛАМИДИЙНОЙ И ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИЙ У ЖИТЕЛЕЙ САНКТ-ПЕТЕРБУРГА ПО ДАННЫМ СЕРОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА
Л.Б. Куляшова, Л.А. Березина, А.В. Закревская, А.Б. Жебрун
ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург
Урогенитальный хламидиоз относится к одной из самых распространенных инфекций передаваемых половым путем и является важным фактором формирования вторичного бесплодия. В настоящее время отсутствуют объективные данные об инфи-цированности Chlamydia trachomatis и вирусами семейства Herpesviridae общей популяции населения Санкт-Петербурга.
Целью настоящего исследования явилось изучение распространенности хламидийной и герпетической инфекций в Санкт-Петербурге по данным се-роэпидемиологического мониторинга.
