CC BY
138
[гиена и санитария 1/2013
- в случае более высокого значения риска для заболеваний органов дыхания у детей и подростков степень неблагополучия устанавливается только по классу органов дыхания, так как органы дыхания вносят основной вклад в общую заболеваемость.
для выбора подхода к использованию предлагаемых критериев выполнено сравнение оценок медикоэкологической ситуации административных территорий Иркутской области по ранее официально утвержденным критериям и по 3 вариантам использования предлагаемых критериев:
• При оценке состояния территорий не учитывался 1 класс с наиболее высоким показателем относительного риска (за исключением болезней органов дыхания), и следующий за ним по уровню риска класс являлся определяющим степень неблагополучия. В случае более высокого значения риска для заболеваний органов дыхания степень неблагополучия устанавливался только по данному классу органов дыхания, так как органы дыхания вносят основной вклад в общую заболеваемость детей.
• При оценке состояния территорий не учитывались 2 класса с наиболее высокими относительными рисками (за исключением болезней органов дыхания), и следующий за ними класс являлся определяющим степень неблагополучия. В случае высоких значений риска для заболеваний органов дыхания степень неблагополучия определялась этим классом.
• При оценке состояния территории степень неблагополучия определялась по классу заболеваний, имеющему наибольший относительный риск (как было принято в "Критериях ..." (1992).
Сравнительная оценка медико-экологической ситуации административных территорий Иркутской области в промышленных и непромышленных городах и районах представлена в табл. 3.
целесообразность выбора варианта 1 оценки степени напряженности медико-экологической ситуации вытекает в основном из более адекватных оценок экологических ситуаций на непромышленных территориях с удовлетворительной и относительно напряженной си-
туацией, формирующих ряд фоновых территорий и отобранных по критерию ±^05ох (т. е. примерно в пределах ±2о).
Это позволяет, на наш взгляд, выбранный нами вариант оценки считать более оптимальным по сравнению с практикуемым консервативным подходом к оценке по одному максимальному показателю (который повышает оценку степени напряженности медико-экологической ситуации по сравнению с рекомендуемыми на промышленных территориях на 4 из 10 и на непромышленных - на 12 из 21) (табл. 4).
Учитывая статистическую природу критериев, их можно использовать для оценки медико-экологической ситуации по другим показателям нарушений здоровья, для которых фоновый уровень установлен по статистическому методу.
Таким образом, предложенные критерии с использованием фоновых показателей заболеваемости позволяют более объективно оценивать медико-экологическую ситуацию на контролируемой территории и принимать обоснованные решения о характере использования информации в системе социально-гигиенического мониторинга и при выполнении эпидемиологических исследований.
Литер атура
1. Комплексная оценка степени напряженности медикоэкологической ситуации различных территорий, обусловленной загрязнением токсикантами среды обитания населения: Метод. рекомендации № 2510/5716-97-32. - М., 1997.
2. Критерии оценки экологической обстановки территорий для выявления зон чрезвычайной экологической ситуаций и зон экологического бедствия: Методика Минприроды РФ. - М., 1992.
3. Определение и использование региональных фоновых показателей нарушений здоровья населения для оценки риска и экологического состояния территорий: Метод. рекомендации. - Ангарск, 2002.
Поступила 06.02.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 613.31:628.162]-078
А. В. Загайнова, Т З. Артемова, Р. А. Дмитриева, Е. К. Гипп, Ю. Г. Талаева, Н. Н. Буторина, Т. Н. Максимкина,
О. В. Савостикова, О. В. Ушакова, М. А. Водянова, Ф. И. Ингель, В. В. Юрченко, Е. К. Кривцова
К ВОПРОСУ о ВОЗДЕЙСТВИИ ИАИОЧАСТИЦ МЕТАЛЛОВ, ПРИСУТСТВУЮЩИХ В ВОДНОЙ среде, на бактерии и перевиваемые культуры клеток нер-2 и
BGM
ФГБУ НИИ ЭЧиГОС им. А. Н. Сысина Минздрава России, Москва
Одним из перспективных направлений изучения биологической активности наночастиц является поиск новых эффективных методов и технологий обеззараживания питьевой воды, воздуха и поверхностей закрытых помещений, в том числе лечебно-профилактических учреждений и объектов массового скопления людей, а также разработка новых методов для оценки их токсичности in vitro.
В работе изучено влияние различных форм серебра, меди и алюминия на индикаторные и потенциальнопатогенные микроорганизмы в водной среде, а также на моделях перевиваемых культуральных клетках BGM (клетки опухоли почек зеленой мартышки) и Нер-2 (клетки карциномы гортани человека) оценивается токсичность этих веществ.
Ключевые слова: наночастицы, наноматериалы, микрочастицы, валидация, токсический эффект
76
A. V. Zagainova, T. Z. Artemova, R. A. Dmitrieva, E. K. Gipp, L. V. Ivanova, Yu G. Talaeva, N. N. Butorina, T. N. Maksimkina,
O. V. Savostikova, O. V. Ushakova, M. A. Vodianova, F. I. Ingel, V. V. Yurchenko, E. K. Krivtsova — TO A QUESTION ON THE IMPACT OF NANOPARTICLES OF METALS PRESENT IN THE AQUATIC ENVIRONMENT, ON BACTERIA AND CONTINUOUS CELL LINES HEP-2 AND BGM
Federal State Budgetary Institution "A. N. Sysin Research Institute of Human Ecology and Environmental Health" of the Ministry of Healthcare and Social Development, 119121, Moscow, Russian Federation
Promising application of nanoparticles and nanomaterials is the creation of sanitary hygienic means of new generation used for disinfection of water and indoor surfaces of mass use, furniture, sanitary technical equipment by virtue of modifying traditional materials to bring them effective biocidal properties, and for the development of methods in vitro for assessment their toxicity. In this paper the possibility of the use various forms of silver, copper and aluminum as disinfectant for bacterial test organisms in the aquatic environment and assess their toxicity on biological models of continuous culture of BGM cells (a stable line of African green monkey kidney cells) and HEp-2 (Human epithelial type 2 (HEp-2) cells, derived from a human laryngeal carcinoma) is considered
Key words: nanoparticles, nanomaterials, microparticles, inactivation, validation, toxic effect
Введение
Одной из основных задач современной гигиенической науки является поиск новых эффективных методов и технологий обеззараживания питьевой воды, воздуха и поверхностей закрытых помещений, в том числе лечебно-профилактических учреждений и объектов массового скопления людей. В этой связи представляют несомненный интерес изучение влияния наночастиц на жизнедеятельность патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и определение степени неблагоприятного воздействия на человека.
Как известно, наночастицы и наноматериалы обладают особым комплексом физико-химических свойств и характеристик биологического действия, которые радикально отличают их от свойств этого же вещества или материала, находящегося в форме сплошных фаз или макроскопических дисперсий, что характеризует их как новый вид материалов и продукции с обязательной оценкой потенциального риска для здоровья человека и окружающей среды [1].
В настоящее время все более широкое применение в медико-биологических исследованиях находят методы in vitro с использованием клеточных культур, позволяющие в более короткие сроки и с меньшими трудозатратами в той или иной степени заменить трудоемкие и дорогостоящие эксперименты на животных [2, 5, 6]. Однако отсутствуют единые подходы к выбору клеточных культур для создания корректных моделей в исследованиях in vitro, что во многом определяется особенностями реакций клеточных линий на разные классы соединений и обусловлено различиями в результатах экспериментов между первичными культурами клеток и клеточными линиями [3, 4, 9].
для оценки токсических эффектов в культурах клеток определяют концентрацию соединений, которая на 50% снижает жизнеспособность клеток (IC50). Принято считать, что индекс IC50 позволяет оценить ориентировочные уровни среднесмертельных доз химических агентов и перейти к величинам и ПДК [7, 8, 11, 12].
Целью настоящего исследования явилось изучение воздействия наночастиц металлов в водной среде на бактерии и возможность применения перевиваемых клеточных культур - клеток BGM (клетки опухоли почек зеленой мартышки) и Нер-2 (клетки карциномы гортани человека) для определения токсических эффектов, индуцированных ионами и наночастицами серебра, меди, алюминия.
Материалы и методы
Объекты
1. Тест-микроорганизмы Escherichia coli 1257, Pseudomonas aeruginosa 10145 ATCC, Enterococcus faecalis и Enterococcusfaecium. Рабочую суспензию микроорганизмов готовили из культур, выращенных на питательном агаре. Исследования проводили в модельных водоемах - стерильных емкостях, заполненных фильтрованной стерильной дехлорированной водой. Суточные бактериальные культуры готовили по стандарту мутности (10 ед.) с последующими десятикратными разведениями до n • 104 КОЕ/мл. Для всех видов микроорганизмов доза заражения, внесенного в модельные водоемы, составила n • 104 КОЕ/мл.
2. Перевиваемые культуры BGM (клетки почек зеленой африканской мартышки) и Нер-2 (клетки карциномы гортани человека). Образцы клеток были получены из коллекции клеточных культур Института вирусологии им. Д. И. Ивановского (Москва). Для экспериментов клетки выращивали в пластиковых флаконах на среде Игла, содержащей двойной набор аминокислот, 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и 25 000 ЕД пенициллина на 100 мл среды. Культуры растили 3 сут при 37oC до образования полного монослоя, содержащего до 3 • 107 живых клеток.
Вещества:
- наночастицы (14 нм) серебра с защитным коллоидом из камеди аравийской в концентрациях 0,05 мг/л (ПДК серебра в питьевой воде), 0,1 и 0,5 мг/л;
- микрочастицы (120 нм) серебра 0,05 мг/л (ПДК серебра в питьевой воде), 0,1 и 0,5 мг/л;
- сульфат серебра (ионы серебра) в концентрациях 0,05 мг/л (ПДК серебра в питьевой воде), 0,1 и 0,5 мг/л;
В экспериментах на культурах клеток каждое из этих веществ дополнительно использовали в дозе 5,0 мг/л.
- наночастицы металлической меди (50-60 нм) в концентрациях 1,0 мг/л (ПДК меди в питьевой воде) и 1,5 мг/л;
- сульфат меди (ионы меди) в концентрациях 1,0 мг/л (ПДК меди в питьевой воде) и 1,5 мг/л;
- наночастицы алюминия (100 нм) в концентрациях 0,25, 0,5 мг/л (ПДК меди в питьевой воде) и 0,75 мг/л;
- сульфат алюминия (ионы алюминия) в концентрациях 0,5 мг/л (ПДК меди в питьевой воде) и 0,75 мг/л;
- камедь аравийская 0,5 % водный раствор.
Все исследованные соединения имели экологический паспорт.
77
[гиена и санитария 1/2013
Постановка экспериментов
1. Изучение бактерицидного действия
Каждое вещество в одной из их изученных концентраций вносили в отдельный водоем, содержащий один вид тест-микроорганизма, и экспонировали в течение 3, 6, 24, 48 и 72 ч. В водоем, контрольный для каждого тест-микроорганизма, вещества не вносили, поэтому динамика изменения числа микроорганизмов в нем показывала естественный процесс их роста и отмирания. После экспозиции проводили посевы проб воды из каждого водоема на селективные питательные среды в соответствии с видовой принадлежностью микроорганизма. Пробы воды из опытных водоемов отбирали в стерильные флаконы с нейтрализатором - динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Одновременно с микробиологическими исследованиями в воде модельных водоемов определяли остаточные концентрации наночастиц и ионов металлов методом атомноабсорбционной спектрометрии, предварительно перемешивая на ультразвуковой установке Bandelin.
2. Анализ цитотоксического действия
Культуры клеток BGM и Нер-2 экспонировали теми же веществами и в тех же концентрациях, что и экспериментальные водоемы. Наблюдение за изменением структуры монослоя проводили в течение 24 и 48 ч, после чего клетки смывали с покровного стекла раствором Версена с хемопсином, мягко суспендировали, 10 мин центрифугировали при 1000 об/мин, надосадки отсасывали, а осадок ресуспендировали в пробирки эппиндорф. Соотношение живых и мертвых клеток в этой суспензии определяли в камере Горяева с использованием красителя трипанового синего. Оценку токсического действия ионов и наночастиц металлов серебра, алюминия и меди на перевиваемые клетки проводили путем расчета IC50.
Результаты и обсуждение
При воздействии наночастиц серебра в концентрации 0,05 мг/л (в пределах ПДК) и экспозиции 24 ч в изученных пробах воды тест-микроорганизмы не обнаруживались (рис. 1). При увеличении концентрации до 0,1 мг/л и экспозиции 24 ч в пробах воды не обнаружили Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, при этом необходимо отметить, что Е. coli не обнаруживали после 6 ч воздействия. При дальнейшем увеличении концентрации наночастиц серебра в воде модельных водоемов наблюдалось отсутствие роста изученных тест-микроорганизмов уже через
6 ч. В то же время эффективность действия ионов серебра в концентрации 0,05 мг/л (ПдК) на E. coli составила 99,83%, через 6 ч экспозиции Е. coli в пробах воды не обнаруживалась, остальные тест-микроорганизмы не обнаруживались через 24 ч (см. рис. 1). Повышение концентрации до 0,1 мг/л после экспозиции 6 ч эффективность обнаружения остальных тест-микроорганизмов составила в среднем 99,83%. При дальнейшем увеличении концентрации ионов серебра до 0,5 мг/л Е. coli в воде модельных водоемов не обнаруживались уже через 3 ч воздействия препарата.
При воздействии наночастиц меди в концентрации 1,0 мг/л в пробах воды Е. coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium не обнаруживались только после 48 ч экспозиции. При этом бактерии Pseudomonas aeruginosa оставались не только жизнеспособными в течение 48 ч, но даже размножались. Однако при повышении концентрации наночастиц меди до 1,5 мг/л в пробах воды при экспозиции 24 ч не обнаруживались Е. coli и Pseudomonas aeruginosa, в то же время отсутствие роста Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium наблюдалось при экспозиции 48 ч. После воздействия на бактерии сульфата меди в концентрации 1,0 мг/л (в пределах ПдК) рост Е. coli и Pseudomonas aeruginosa отсутствовал уже через 3 ч, через 6 ч в исследованных пробах воды не обнаруживались Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium. При продолжении эксперимента реактивации бактерий не выявлено.
При воздействии наночастиц и ионов алюминия на тест-микроорганизмы при экспозиции 48-72 ч во всех изученных пробах воды отмечалось увеличение количества бактерий на 1-3 порядка по сравнению с контролем.
Анализ результатов экспериментов in vitro показал, что в контрольных культурах обеих линий через сутки соотношение живых и мертвых клеток составляло около 1000:1 (токсический эффект 0,1; время экспозиции составляло 24 ч). Камедь не влияла на жизнеспособность клеток обеих линий.
На культуре Нер-2 при контакте с сульфатом серебра, нано- и микрочастицами серебра наблюдалась общая закономерность: с увеличением концентрации вещества уменьшалась доля живых и увеличивалась доля мертвых клеток. При этом сульфат (ионы) серебра оказался наиболее токсичным и в максимальной дозе вызывал гибель 78,6% клеток. действие микрочастиц серебра в максимальной дозе сопровождалось гибелью
а б в
—О— Е. coli контроль Е. coli опыт a Pseudomonas aeruginosa контроль
Рис. 1. Инактивация бактерий E. coli, Ps. aeruginosa в воде модельных водоемов под воздействием наночастиц и ионов серебра в концентрации 0,05 мг/л.
а - контроль, б - опыт с наночастицами серебра, в - контроль и опыт с ионами серебра.
78
а
в
Живые клетки Мертвые клетки
Рис. 2. Влияние сульфата (ионов) серебра (а), наночастиц серебра размером 14 нм (б) и микрочастиц серебра размером 120 нм (в) на частоту живых и мертвых клеток в культуре Hep-2.
69,5% клеток, наночастиц серебра - гибелью 60,1% клеток (рис. 2).
В то же время при контакте тестируемых веществ с культурой BGM были получены обратные зависимости: увеличение концентрации ионов, нано- и микрочастиц серебра от 0,0005 до 0,5 мг/л увеличивало количество живых и уменьшало число мертвых клеток (рис. 3). При этом через 3 ч контакта с веществами клетки BGM деформировались, в них отмечалась повышенная зернистость, происходило активное деление, в результате которого заметно уменьшалось число многоядерных клеток.
Таким образом, на данной культуре с увеличением концентраций веществ наблюдалась стимуляция ро-
в
Живые клетки ^ Мертвые клетки
Рис. 3. Дозовые зависимости частоты живых и мертвых клеток в культурах BGM при экспозиции сульфата серебра (а), наночастицами серебра размером 14 нм (б) и микрочастицами серебра размером 120 нм.
ПДК серебра в питьевой воде - 0,05 мг/л.
ста клеток BGM. Максимальный токсический эффект (77,2% при IC50 41,4%) был выявлен только при контакте культуры BGM с 5 мг/л сульфата серебра - концентрацией, превышающей в 100 раз ПДК.
С целью подтверждения достоверности полученных результатов проводили две серии независимых экспериментов, результаты оказались идентичными.
Таким образом, воздействие соединений серебра на разные культуры перевиваемых клеток вызывало различные токсические эффекты, что может свидетельствовать о селективности токсического действия серебра вне зависимости от его формы (ионы, нано- и микрочастицы).
При контакте 1,0 мг/л наночастиц и ионов меди с обеими клеточными культурами была выявлена одинаковая закономерность (уменьшалась доля живых и увеличивалась доля мертвых клеток). При этом сульфат (ионы) меди оказался более токсичным, вызывал гибель 25,6%
79
[гиена и санитария 1/2013
клеток Нер-2 и 12,7% клеток BGM (IC50 составило 46 и 44% соответственно).
Как показали исследования, наночастицы и ионы алюминия не оказывали влияния на жизнедеятельность изученных тест-микроорганизмов, при этом была выявлена одинаковая закономерность в обеих клеточных культурах; с увеличением концентрации уменьшалась доля живых и увеличивалась доля мертвых клеток. установлено, что наночастицы и ионы алюминия оказывали большой токсический эффект на обе линии перевиваемых клеточных культур: при концентрациях наночастиц алюминия от 0,25 до 0,75 мг/л для клеток Нер-2 токсический эффект составил от 61 до 89%, для клеток BGM -от 84 до 86%, при концентрациях ионов алюминия 0,5 и 0,75 мг/л для клеток Нер-2 токсический эффект составил 86 до 89%, для клеток BGM - 87%. Полученные данные о токсичности различных форм алюминия согласуется с данными литературы.
Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что сульфат (ионы) и наночастицы серебра оказывают воздействие на жизнедеятельность индикаторных (E. coll) и потенциально-патогенных (Ps. aeruginosa, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium) бактерий, а также на перевиваемые клетки Нер-2.
Отмечено, что ионы серебра и меди оказывали более эффективное действие на тест-микроорганизмы по сравнению с их наноформами. Аналогичная закономерность была обнаружена на перевиваемых клетках Нер-2 в отношении серебра, а для ионов и наночастиц меди - на обеих клеточных культурах. установлено, что наночастицы и ионы алюминия оказывали большой токсический эффект на обе линии перевиваемых клеточных культур, в то же время при воздействии на тест-микроорганизмы отмечалось увеличение количества бактерий на 1-3 порядка по сравнению с контролем.
Таким образом, можно предположить, что наблюдаемые эффекты зависят как от химического состава исследуемого материала, так и от формы его частиц (ионная, нано- или микрочастицы).
Необходимо отметить, что проведенные исследования носят поисковый характер, поэтому малоизученные эффекты наночастиц различного химического состава, размера и формы на перевиваемых культуральных клетках нельзя рекомендовать для оценки токсичности
наноматериалов без валидации полученных данных на теплокровных животных.
Литер атура
1. Двоскин Я. Г. Химическая безопасность и основы профилактической токсикологии: Метод. пособие / Под ред. Л. Г По-дуновой. - М., 2003.
2. Дядищев Н. Р., Рыбалкин П., Марченко А. И. // Тезисы докладов 1-го съезда токсикологов России 17-20 ноября 1998 г. / Под ред. проф. Б. А. Курляндский. - М., 1998. - С. 299.
3. Каюмов Р. И., Еськов А. П. Экспресс-оценка общей острой токсичности методом in vitro с использованием спермы быка в качестве клеточного тест-объекта. - М., 1997.
4. Каюмов Р. И., Еськов А. П., Петрова Л.П. // Токсикол. вестн.
- 2002. - № 5. - С. 44-47.
5. Копаладзе Р. А. // Тезисы докладов 2-го съезда токсикологов России 10-13 ноября 2003 г. / Под ред. Г. Г. Онищенко, Б. А. Курляндского. - М., 2003. - С. 137.
6. МалышеваМ. В., РязановаР. А. // Тезисы докладов 1-го съезда токсикологов России 17-20 ноября 1998 г. / Под ред. Б. А. Курляндского. - М., 1998. - С. 297.
7. МУ № 15-6/21. Методические указания по использованию культуры диплоидных эмбриональных клеток человека, рекомендуемых для токсиколого-гигиенических исследований. Утв. зам. нач. гл. сан.-эпид. упр. МЗ СССР М. И. Наркевич.
- М., 1991.
8. Оценка токсичности материалов, изделий и объектов окружающей среды на альтернативных биологических моделях (экспресс-методы): Метод. пособие / Под ред. Е. Н. Беляева.
- M., 2004. - С. 240-301.
9. Показатели клеточного метаболизма in vitro в исследовании антивирусных и антимикробных препаратов в скрининге цитопротекторных соединений / Еропкин М. Ю., Еропкина Е. М., Смирнова Т. Д. и др. - С.-Петербург: ГУ НИИ гриппа РАМН.
10. Применение метода клеточных культур для исследования биологического действия пестицидов: Метод. рекомендации № 1970-79. Утв. нач. гл. сан.-эпид. упр. МЗ СССР В. Е. Ков-шило. - М., 1980.
11. Прядилова Н. В. // Гиг. труда. - 1980. - № 1. - С. 29-34.
12. Тестирование лекарственных препаратов наружного применения в культуре клеток человека: Метод. рекомендации № 96/247. Утв. зам. мин. МЗ РФ В. И. Стародубов. - М., 1996.
Поступила 24.02.12
80
