CC BY
150
УДК 615.014:539.12+615.916:666.363+615.916:546.57
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОТОКСИЧНОСТИ И ЦИТОТОКСИЧНОСТИ НАНОКОМПОЗИТА ВЫСОКОДИСПЕРСНОГО КРЕМНЕЗЕМА
С НАНОЧАСТИЦАМИ СЕРЕБРА
Д.С. САВЧЕНКО
Национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца, бул. Шевченко, 13, г. Киев, Украина, 01601, e-mail: savchenko ds@ukr.net
Аннотация. Обеспечение высокой эффективности и качества лекарственных средств, разработанных на основе нанотехнологий, возможно только при соблюдении требований по разработке, исследованию, внедрению и производству новых фармакологических средств. При определении токсикологических характеристик веществ, определение генотоксичности и цитотоксичности является первым этапом, целью которого является определение способности вызывать первичные ДНК повреждения, а также вероятное негативное действие на культуры клеток. Такие исследования дают первичную информацию о токсическом действии веществ и составляют основу для подтверждения безопасности новых лекарственных средств.
Учитывая постоянную потребность во внедрении новых противомикробных препаратов для лечения кишечных инфекций, целесообразна разработка комбинированных средств, которые имели лучшие показатели эффективности и безопасности. Значительный научно-практический интерес представляют исследования препаратов на основе наносеребра, активного против антибиотикорезистентных микроорганизмов. В частности разработан и синтезирован сотрудниками кафедры фармакологии и клинической фармакологии Национального медицинского университета им. А.А. Богомольца и Института химии поверхности им. А.А. Чуйко НАН Украины нанокомпозит высокодисперсного кремнезема и наночастиц серебра, который рассматривается как перспективный препарат комплексного антибактериального и сорбционно-детоксикационного действия.
Целью данной работы было изучение цитотоксичности и генотоксичности нанокомпозита высокодисперсного кремнезема и наночастиц серебра. Методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток тестовой культуры СНО-К1 определена степень повреждения ДНК нанокомпозитом высокодисперсного кремнезема с наночастицами серебра. Изучение цитотоксичности проводили на эукариотических клетках перевиваемой культуры эпидермоидной карциномы гортани (Нер-2). Показано, что нанокомпозит высокодисперсного кремнезема с наночастицами серебра не обладает генотоксическими свойствами, а его цитотоксичноть исчезает при концентрациях ниже 0,007%.
Ключевые слова: наночастицы серебра, высокодисперсный кремнезем, нанокомпозит, генотоксичность, цитотоксичность.
INVESTIGATION OF GENOTOXICITY AND CYTOTOXICITY OF NANOCOMPOSITE HIGHLY DISPERSED SILICA WITH SILVER
NANOPARTICLES
D.S. SAVCHENKO
Bogomoletz National Medical University, 01601, Ukraine, c. Kyiv, T. Shevchenko blvd., 13, e-mail: savchenko ds@ukr.net
Abstract. Provision of high efficiency and quality of drugs developed on the basis of nanotechnology is possible only under the requirements for the development, research, production and introduction of new pharmacological agents. Determination of genotoxici-ty and cytotoxicity is the first stage of toxicological studies of newly synthetized substances, the aim of which is to determine the ability to induce primary DNA and cell cultures damages. Such studies provide information about primary toxic effects of substances and constitute a basis for confirming the safety of new drugs.
Considering a constant need for the introduction of new antimicrobial agents for treatment of intestinal infections, it is expedient to develop combinative drugs which will have better efficacy and safety. Significant scientific and practical interest has study of drugs based on nanosilver, which is active against antibiotic-resistant microorganisms. By the Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology of Bogomoletz National Medical University and Chuiko Institute of Surface Chemistry NAS of Ukraine was specifically designed and synthesized nanocomposite highly dispersed silica with silver nanoparticles, which is considered as a promising drug with a complex of antibacterial and sorption-detoxication properties.
The purpose of this work is to study the cytotoxicity and genotoxicity of nanocomposite highly dispersed silica with silver nanoparticles. The degree of DNA damage by nanocomposite was studied by alkaline gel electrophoresis of isolated cell test culture CHO-K1. Investigation of cytotoxicity was carried out on passaged eukaryotic cell culture of human epidermoid carcinoma larynx (Hep-2). It is shown that nanocomposite highly dispersed silica with silver nanoparticles does not have genotoxic properties, and its cytotoxicity disappears at concentrations below 0,007%.
Key words: silver nanoparticles, silica, nanocomposite, genotoxicity, cytotoxicity.
Нанобиотехнология - современное направление исследований, которое занимает особое место в научнопрактической деятельности человека. В последние годы это направление переживает особенно бурное развитие. В значительной степени достижения нанобиотехнологии сказались на развитии медицины и ветеринарии, где наноматериалы получили широкое применение в лечении и диагностике заболеваний различной этиологии, а также как средства целевой доставки лекарственных средств [3,6].
Перспективными в этом аспекте являются наночастицы металлов (НЧМ) [3,5,6]. НЧМ имеют особые физикохимические свойства и биологическое воздействие, по сравнению с веществами в обычном физико-химическом состоянии, поэтому их следует отнести к новым видам материалов, характеристика потенциального риска которых для здоровья человека и состояния окружающей среды во всех случаях является обязательной.
На сегодняшний день одной из наиболее активно ис-
следуемых НЧМ для медицинских целей является наносеребро, которое обладает рядом фармакологических эффектов (противомикробным, противовоспалительным, иммуномодулирующим) [4,7]. Именно наночастицы серебра (НЧС) могут быть эффективной альтернативой высокотоксичным противомикробным средствам. Такие наночастицы имеют реальные перспективы для использования при разработке изделий медицинского назначения, в хирургической практике при создании противомикробных препаратов [4].
Высокая заинтересованность в продуктах нанотехнологий порождает большое количество вопросов, связанных с безопасностью использования наноматериалов. Биологическая безопасность наноматериалов является актуальным вопросом, который требует комплексного научнообоснованного подхода [2]. Особую роль в характеристике биобезопасности НЧМ в соответствии с международными нормами, играет отсутствие повреждения ДНК такими наноматериалами [6]. Наиболее перспективным методом выявления повреждений ДНК является метод ДНК-комет (щелочного гель-электрофореза изолированных клеток), который широко используется в научно-исследовательской практике, однако данные о применении его для тестирования биобезопасности наноматериалов в литературе практически отсутствуют.
Изучение цитотоксического влияния дает первичную информацию о токсическом действии веществ, и лежит в основе подтверждения безопасности новых лекарственных средств [8]. В рамках проведения исследования, изучение цитотоксического влияния нанокомпозита высокодисперсного кремнезема с наночастицами серебра (ВКНС) проводилось с целью определения минимальной концентрации, с которой будет изучаться острая токсичность в условиях in vivo.
НЧС проявляют генотоксическое и цитотоксическое действие в человеческих культурах тканей, вызывая повреждение ДНК, хромосомные аберрации, и гибель клеток, если они применяются в незащищенном виде в концентрациях выше определенного уровня.
Новый высокоэффективный нанокомпозит ВКНС разработан в результате совместных исследований кафедры фармакологии и клинической фармакологии НМУ им.
А.А. Богомольца и Института химии поверхности им. А.А. Чуйко НАН Украины. Создание композита заключается в том, что НЧС и высокодисперсного кремнезема объединяли путем механосорбционного покрытия поверхности на-норазмерного кремнезема монослоем AgNO3 в газовой дисперсионной среде и последующим термолизом соли, в результате чего на поверхности нанодисперсного кремнезема образуются НЧС размером от 12 нм до 18 нм. Концентрация НЧС в размере 7,9% в объеме энтеросорбента, позволила равномерно распределить НЧС в виде монослоя на поверхности высокодисперсного кремнезема, а также позволила объединить высокие противомикробные свойства НЧС с выраженными сорбционными свойствами нанодис-персного кремнезема [1].
Цель исследования - определение повреждений ДНК нанокомпозитом ВКНС а также определения минимальной концентрации нанокомпозита, которая не будет вызывать цитотоксического действия.
Материалы и методы исследования. Определение ге-нотоксичности. В работе изучали генотоксическое действие нанокомпозита ВКНС. Исследовали влияние 10%, 5%, 1% и
0,5% нанокомпозита на эукариотические клетки.
В работе использованы культуры клеток яичника китайского хомяка СНО-К1 из коллекции Государственного научно-контрольного института биотехнологии и штаммов микроорганизмов (Киев, Украина).
Клетки культуры СНО-К1 выращивали на среде F10 («Sigma», США), содержащей 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота («Gibco», США) в титре 5*105 кл/мл. Число живых клеток, определенных с помощью окрашивания 0,3% раствором трипанового синего, составляла не менее 90%.
Обработку эукариотических клеток культуры СНО-К1 исследуемым нанокомпозитом ВКНС осуществляли в течение 4 часов при температуре 37°С. Положительным контролем служили клетки культур, обработанные N-нитрозометилмочевиной в концентрации 1 мМ в течение 24 часов. В качестве отрицательного контроля были те же клетки не обработанные нанокомпозитом ВКНС.
Определение генотоксических свойств исследуемого вещества осуществляли по следующей схеме: получение гель-слайда, формирование микропрепарата, лизис, щелочная денатурация, проведение электрофореза, нейтрализация / фиксация, окраска препарата, микроскопический анализ.
Для окраски микропрепаратов методом «ДНК-комет» использовали флуоресцентный краситель акридиновый оранжевый, после чего микроскопию микропрепаратов осуществляли с помощью флуоресцентного микроскопа («ЛЮМАМ Р8», Россия) с использованием возбуждающего фильтра 490 нм, дихроичных зеркал на 510 нм, и отсекающего фильтра после 530 нм. Увеличение 200-400 х. В каждом микропрепарате анализировали по 150-200 «ДНК-комет» без наложенных «хвостов». В анализ не включали апоптиче-ские клетки, которые появляются на микропрепаратах в виде слабо флуоресцирующих «ДНК-комет» с широким диффузным «хвостом» и практически отсутствующей «головой», так называемые «ежи». Анализ «ДНК-комет» проводили визуально. При этом «ДНК-кометы» распределяли на пять условных типов с соответствующим для каждого числом от 0 до 4. Степень повреждения ДНК при этом выражали как индекс «ДНК-комет» (И ), который вычисляли по формуле: И =(0n +1n +2n +3n +4n )/L, где n -n - чис-
^ ДНК 0 1 2 3 4 0 4
ло «ДНК-комет» каждого типа, L - сумма «ДНК-комет».
Эксперименты выполнены в двух параллелях. Статистическую обработку результатов проводили по каждой экспериментальной точке путем сравнения показателей повреждения ДНК в исследовательской и контрольных группах. Критерием положительного результата служил статистически достоверный воспроизводимый эффект.
Определение цитотоксичности. В работе изучали цито-токсическое действие нанокомпозита ВКНС. Исследовали влияние на эукариотические клетки 1%, 0,5%, 0,25%, 0,12%,
0,06%, 0,03%, 0,015% и 0,007% нанокомпозита. Разведение готовили на дистиллированной воде и вносили аликвоты в питательную среду с монослоем клеток.
В работе использовали перевиваемыую культуру клеток эпидермоидной карциномы гортани (Нер-2). Культура клеток была получена из музея клеточных культур Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Г. Е. Кавецкого НАН Украины.
Для культивирования применяли питательную среду 199 (НПП "Био-Тест-Лаборатория», Украина) в которую вносили 10% прогретой при 56 °С в течение 30 мин эмбриональной сыворотки телят (ЭСТ, «Sigma», США) 25 мМ HEPES, 100 ед / мл канамицина (Пан-Эко, Россия). В состав поддерживающей среды входили: среда 199, 2% ЭСТ, 25 мМ HEPES, 100 ед / мл канамицина (Пан-Эко, Россия).
Посевная доза клеток составляла 3-6*105 клеток / мл, по 100 мкл клеточной суспензии на лунку. В процессе исследования клетки выращивали в 96-луночных планшетах («Costar», Великобритания) и инкубировали в термостате в
водонасыщенных атмосфере с 5% СО2 при t=37 °С. Сплошной монослой клеток получали через 24 ч. Изучение цитотоксичности препаратов проводили при условии пребывания клеток в поддерживающей среде (среда, содержащая 1% ЭСТ).
Изучение цитотоксичности нанокомпозита ВKHС проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах со сложившимся монослоем клеток. Для этого среду культивирования удаляли, а к клеткам вносили поддерживающую среду. В лунки вносили последовательные разведения исследуемых образцов и инкубировали в течение 18 часов. Планшеты инкубировали в условиях термостата при 37 ОС и 5% СО2. ^нтролем были лунки в которые вносили соответствующее количество воды.
Оценка жизнеспособности клеток проводилась по интенсивности поглощения клетками суправитально красителя нейтрального красного (NR) [В]. Hейтральный красный является слабым катионным красителем, легко проникает через клеточные мембраны путем неионной диффузии, а также быстро проникает в лизосомы клеток. Изменение состояния поверхности клеток или чувствительности лизо-сомальных мембран сопровождаются увеличением ломкости лизосом, другими внутриклеточными изменениями, которые постепенно становятся необратимыми. Такие изменения сопровождаются уменьшением поглощения и связывания нейтрального красного. Метод позволяет провести различие между жизнеспособными, поврежденными или мертвыми клетками, и является высокочувствительным, интегрированным ответом на вопрос о целостности клеток и торможение их роста.
Оптическую плотность клеток, которые поглотили нейтральный красный, измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом LabsystemMultiscan (Великобритания) при длине волны 540 нм. Учет цитотоксичности проводили, определяя процент живых клеток по отношению к контрольным (необработанным). Процент клеток, которые активно поглощали нейтральный красный, определяли за формулой: ИС=(П исл /П конт р)х100
^итерии цитоксичности - показатели ИС100 и ИC50 - концентрации, которые вызывают соответственно 100% и 50%, снижение активности поглощения клетками нейтрального красного.
Результаты и их обсуждение. Исследования генотоксичности нанокомпозита ВKHС показало отсутствие такого свойства в данной субстанции о чем свидетельствуют результаты приведенные в табл. 1.
Таблица 1
Таблица оценки генотоксичности нанокомпозита ВКНС
Образец Индекс ДНК-комет (И ) ДНК
Клетки СНО-К1 обработанные 10% раствором ВКНС 0,059±0,003
Клетки СНО-К1 обработанные 5% раствором ВКНС 0,053±0,002
Клетки СНО-К1 обработанные 1% раствором ВКНС 0,055±0,001
Клетки СНО-К1 обработанные 0,5% раствором ВКНС 0,054±0,002
Клетки СНО-К1 обработанные 1мМ Ы-нитрозометилмочевиной (позитивный контроль) 2,55±0,13
Клетки СНО-К1 негативный контроль 0,051±0,001
Тестирование проводят по визуальным показателям роста монослоя эукариотических клеток и по показателям жизнеспособности эукариотических перевиваемых культур при микроскопическом анализе монослоя клеток и окраске некоторыми красителями (кристалл-виолеттом, суправи-тальным красителем нейтральным красным).
Показано цитотоксическое действие 1%, 0,5%, 0,25%,
0,12%, 0,06%, 0,03%, 0,015%, 0,007% раствора нанокомпозита
ВKHС (рис. 1-В (здесь и далее cм. обл. 3)). Использование нанокомпозита ВKHС в концентрациях 1%, 0,5%, 0,25%, приводит к тотальной деструкции монослоя культуры клеток Hер-2 (рис. 1-3).
При обработке монослоя эукариотических клеток перевиваемой культуры эпидермоидной карциномы гортани ^ер-2) исследуемыми нанопрепаратами было показано частичную деструкцию монослоя при концентрациях нанокомпозита В^С 0,12%, 0,06%, 0,03 %, 0,015% (рис. 4-7).
При концентрации нанокомпозита ВKHС 0,007% наблюдали минимальную деструкцию монослоя - до В0% живых клеток (рис. В), что подтверждаеться сравнением с микрофотографией контрольного образца культуры клеток Hер-2 (рис. 9). В соответствии с полученными результатами, было установлено, что ИС100=0,25%, а ИC50=0,007%.
Выводы. Перед началом проведения опытов на животных, были проведены исследования по изучению цито-и генотоксичности нанокомпозита высокодисперсного кремнезема с наночастицами серебра. Результаты исследования указывают на отсутствие генотоксических свойств у нанокомпозита высокодисперсного кремнезема с наночастицами серебра, однако его цитотоксичность проявляется при концентрации 0,007%, что стало основой для проведения углубленных токсикологических исследований. Определенная концентрация - 0,007%, будет являться исходной при изучении острой токсичности субстанции.
Литература
1. Чекман, И.С. Hанофармакология: экспериментально-клинический аспект / И.С. Чекман // Врачебное дело .200В.- № 3-4.- С. 104-109.
2. Caruthers, S.D. Nanotechnological applications in medicine / S.D. Caruthers, S.A. Wickline, G.M. Lanza // Cur. Opin. Biotechnol.- 2007.- Vol. 1В.- № 1.- P. 26-30.
3. Comparative evaluation of silver-containing antimicrobial dressings and drugs / J.J. Castellano [et al.] // Int Wound J.- 2007.- Vol. 4.- № 2.- P. 114-122.
4. Highly sensitive rapid, reliable, and automatic cardiovascular disease diagnosis with nanoparticle fluorescence enhancer and mems / B. Hong [et al.] // Adv Exp Med Biol.-200В.- № 614.- P. 265-273.
5. Nanoparticles: pharmacological and toxicological significance / C. Medina [et al.] // Brit. J. Pharmacol.- 2007.-Vol. 150.- P. 552-55В.
6. Silver colloid nanoparticles: synthesis, characterization, and their antibacterial activity / A. Panacek [et al.] // J Phys Chem B.- 2006.- Vol. 110.- № 33.- P. 1624В-16253.
7. The effect of nano- and micron-sized particles of cobalt-chromium alloy on human fibroblasts in vitro / I. Papageorgiou [et al.] // Biomaterials.- 2007.- Vol. 2В.- № 19.- P. 2946-295В.
В. Nanotechnology for targeted cancer therapy / M.D. Wang [et al.] // Exp. Rev. Anticancer Ther.- 2007.- Vol. 7.-№ 6.- P. В33-В37.
References
1. Chekman IS. Nanofarmakologiya: eksperimental'-no-klinicheskiy aspekt. Vrachebnoe delo. 200В;3-4:104-9. Russian.
2. Caruthers SD, Wickline SA, Lanza GM. Nanotechnological applications in medicine. Cur. Opin. Biotechnol. 2007; 1В(1):26-30.
3. Castellano JJ, Shafii SM, Ko F, Donate G, Wright TE, Mannari RJ, Payne WG, Smith DJ, Robson MC. Comparative evaluation of silver-containing antimicrobial dressings and drugs. Int Wound J. 2007;4(2):114-22.
4. Hong B, Kai J, Ren Y, Han J, Zou Z, Ahn CH, Kang KA.
Highly sensitive rapid, reliable, and automatic cardiovascular disease diagnosis with nanoparticle fluorescence enhancer and mems. Adv Exp Med Biol. 2008;614:265-73.
5. Medina C, Santos-Martinez MJ, Radomski A, Corrigan
OI, Radomski MW. Nanoparticles: pharmacological and toxico-logical significance. Brit. J. Pharmacol. 2007;150:552-8.
6. Panacek A, Kvitek L, Prucek R, Kolar M, Vecerova R, Pizurova N, Sharma VK, Nevrcna TJ, Zboril R. Silver colloid nanoparticles: synthesis, characterization, and their antibacteri-
al activity. J Phys Chem B. 2006;110(33):16248-53.
7. Papageorgiou I, Brown C, Schins R, Singh S, Newson R, Davis S, Fisher J, Ingham E, Case CP. The effect of nano- and micron-sized particles of cobalt-chromium alloy on human fibroblasts in vitro. Biomaterials. 2007;28(19):2946-58.
8. Wang MD, Shin DM, Simons JW Simons, Nie S. Nanotechnology for targeted cancer therapy. Exp. Rev. Anticancer Ther. 2007;7(6):833-37.
УДК 616.61-008.64-07:617.747-074
БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СТЕКЛОВИДНОГО ТЕЛА ГЛАЗА В ПОСТМОРТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ПОЧЕЧНОЙ
НЕДОСТАТОЧНОСТИ
П.А. АКИМОВ, Н.А. ТЕРЁХИНА
ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика ЕА. Вагнера» Минздрава России, ул. Петропавловская, 26, г. Пермь, 614990, Россия, e-mail: rector@psma.ru
Аннотация. Исследовано содержание пептидов средней молекулярной массы и креатинина в сыворотке крови и стекловидном теле глаза от 48 трупов людей, страдавших при жизни сахарным диабетом и 27 - не страдавших при жизни данным заболеванием, составивших группу контроля. Наличие почечной недостаточности среди больных сахарным диабетом и в группе контроля было соответственно у 20 и 15 человек. Содержание креатинина в сыворотке трупной крови без наличия почечной недостаточности оказалось выше, чем у живых людей, примерно в 2-2,5 раза, как в контрольной группе, так и у больных сахарным диабетом и не превышало 240 мкмоль/л. Содержание пептидов средней молекулярной массы в сыворотке крови контрольной группы не превышало 2,8 г/л, а у больных сахарным диабетом без почечной недостаточности - 2,9 г/л. Полученные результаты аналогичны нормальным показателям у живых людей по данным литературы. Установлена прямая корреляция в содержании креатинина и пептидов средней молекулярной массы между стекловидным телом глаза и сывороткой крови. Максимальное содержание креатинина и пептидов средней молекулярной массы в стекловидном теле глаза без наличия почечной недостаточности составило соответственно 110 мкмоль/л и 0,5 г/л. При наличии почечной недостаточности изученные показатели резко увеличены, как в сыворотке крови, так и в стекловидном теле глаза. Таким образом, для диагностики почечной недостаточности в постмортальном периоде целесообразно определять в стекловидном теле глаза содержание креатинина и пептидов средней молекулярной массы.
Ключевые слова: почечная недостаточность, креатинин, пептиды средней молекулярной массы, стекловидное тело глаза.
BIOCHEMICAL ANALYSIS OF VITREOUS HUMOR IN POSTMORTAL DIAGNOSIS OF RENAL FAILURE
P.A. AKIMOV, N.A. TEREKHINA Vagner State Medical Academy, 614990, Russia, Perm, st. Peter and Paul, 26, e-mail: rector@psma.ru
Abstract. The content of medium molecular weight peptides and creatinine in serum and vitreous humor from 48 corpses of people suffering from diabetes mellitus during his lifetime and 27 without this disease, formed the control group, were investigated. The presence of renal failure among patients with diabetes mellitus and in the control group was, respectively, in 20 and 15 persons was revealed. The content of serum creatinine in cadaver blood without renal failure was more than 2-2,5 - folds in comparative with living people and was not more than 240 jamol/L. The content of serum medium molecular weight peptides in control group was not more than 2,8 g/L, and in the group of diabetes mellitus without renal failure - 2,9 g/L. The obtained results are analogical with data of living people accordingly literature sources. Direct correlation between the content of creatinine, medium molecular weight peptides and vitreous humor and serum are estimated. The maximum content of creatinine and medium molecular weight peptides in vitreous humor were, respectively, 110 jamol/L and 0,5 g/L. The values extreme graduated in presents of renal failure as in serum, as in vitreous humor. Thus, in postmortal period appropriate to determine the vitreous humor creatinine and medium molecular weight peptides content for the diagnosis of renal failure.
Key words: renal failure, creatinine. medium molecular weight peptides, vitreous humor.
Биохимические методы исследований для целей танатологии составляют особый раздел биохимии - постмор-тальную биохимию, которая изучает обменные процессы, происходящие в мертвом теле, прикладное значение она имеет для судебной медицины. Известно, что ряд биохимических параметров крови соответствует прижизненным показателям, но имеется ряд показателей, которые резко отличаются в постмортальном периоде. В судебной биохимии, из-за гемолиза крови, используются другие альтерна-
тивные объекты исследования, такие как ликвор, перикардиальная и синовиальная жидкости, стекловидное тело глаза. Биохимический анализ стекловидного тела глаза был использован для постмортальной диагностики гипергли-кемической, кетоацидотической и гипогликемической комы [1,2,5,6,8]. При сахарном диабете (СД) вследствие глики-рования белков базальной мембраны сосудов развитие нефропатии, и как следствие развитие почечной недостаточности, довольно частое явление.
