CC BY
90
№ 6 - 2013 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 615.1:577.1:546.57
ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ НАНОКОМПОЗИТА ВЫСОКОДИСПЕРСНОГО КРЕМНЕЗЕМА С НАНОЧАСТИЦАМИ СЕРЕБРА
Д. С. Савченко
Национальный медицинский университет им. А. А. Богомольца (г. Киев, Украина)
Цель исследования — изучение антиоксидантных свойств нанокомпозита высокодисперсного кремнезема и наночастиц серебра. Выраженность проявлений оксидативного стресса in vitro, инициированного H2O2, CaCl2, и последующего добавления детергента (тритон Х-100) вызывает увеличение количества окислительных модификаций белка в супернатанте гомогената мозга крыс, которое уменьшается под влиянием исследуемого нанокомпозита. Наблюдается уменьшение открытия митохондриальной поры на 50,9 %, а синтеза нитротирозина, альдегидфенигидразонов и кетофенилгидразонов на 22,2; 34,8 и 46 % соответственно.
Ключевые слова: наночастицы серебра, высокодисперсный кремнезем, нанокомпозит, антиоксидантная активность.
Савченко Дмитрий Сергеевич — аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии Национального медицинского университета имени А. А. Богомольца, г. Киев, рабочий телефон: +38 044 454 49 24, e-mail: savchenko_ds@ukr.net
Введение. На сегодняшний день одной из наиболее активно исследуемых наночастиц металлов для медицинских целей является наносеребро, обладающее различными фармакологическими свойствами: противомикробным, противовоспалительным, иммуномодулирующим [10]. Именно наночастицы серебра (НЧС) могут быть эффективной альтернативой высокотоксичным противомикробным средствам. Подобные наночастицы имеют реальные перспективы для использования как при разработке изделий медицинского назначения для хирургической практики, так и при создании противомикробных препаратов [9].
Привлекает внимание возможность получения НЧС в кремнеземных матрицах в связи с наличием у кремнезема уникального комплекса физико-химических и медико-биологических свойств: гипоаллергенность, отсутствие раздражающего и общее детоксикационное действие, обусловленные высокой адсорбционной способностью экзо-и эндотоксинов [7].
На кафедре фармакологии и клинической фармакологии Национального медицинского университета имени А. А. Богомольца активно проводятся исследования по изучению фармакологических и токсикологических свойств наночастиц металлов (золота, серебра, меди, железа, магния и др.) и неметаллов (высокодисперсного кремнезема) [6].
Новый высокоэффективный нанокомпозит высокодисперсного кремнезема с наночастицами серебра (ВКНС) разработан в результате совместных исследований кафедры фармакологии и клинической фармакологии Национального медицинского университета имени А. А. Богомольца и Института химии поверхности им. А. А. Чуйко НАН Украины. В процессе синтеза на поверхности нанодисперсного кремнезема образуются НЧС размером от 12 до 18 нм. Концентрация НЧС в объеме энтеросорбента составляет 7,9 %, и позволяет равномерно распределить НЧС в виде монослоя на поверхности высокодисперсного кремнезема, а также объединить высокие противомикробные свойства НЧС с выраженными сорбционными свойствами нанодисперсного кремнезема [5].
Учитывая вышесказанное, целью данной работы было определение антиоксидантной активности (АОА) нанокомпозита ВКНС посредством изучения влияния на снижение Red / Oxi-зависимого открытия митохондриальной поры (МП) нейроцитов, а также по снижению образования окислительных модификаций белка (ОМБ) [1, 2].
Материалы и методы. Изучение открытия МП проводили на митохондриях нейронов белых крыс линии Вистар массой 120-140 г, полученных из вивария Госучреждения «Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины». Митохондриальную фракцию нейронов головного мозга крыс выделяли методом дифференциального центрифугирования на рефрижераторной центрифуге Sigma 3-30k (Германия) при температуре (4 °С), после чего ее переносили в инкубационную смесь.
Предварительно перед опытом в пробы вносили нанокомпозит ВКНС в концентрации 100 мкМ и инкубировали 2 мин. Red / Oxi-зависимое открытия МП инициировали внесением 50 мкМ Н2О2, а через 2 мин добавляли 50 мкМ СаС12 [1].
Открытие МП определяли при А = 540 нм, 250 °С и постоянном 10-минутном перемешивании по снижению светопоглощения, вызванного набуханием митохондрий. Митопротективную активность исследуемого образца определяли снижением открытия МП, что регистрировалось уменьшением разницы оптической плотности Е за 10 мин.
Защитное действие нанокомпозита ВКНС определяли по уменьшению количества маркеров оксидативного и нитрозирующего стресса митохондрий — альдегидфенилгидразонов (АФГ), кетофенилгидразонов (КФГ) и нитротирозина (НТЗ) [2]. С этой целью митохондрии в пробах разрушали детергентом (1 % Тритон Х-100), а затем центрифугировали 45 мин (10 000 g при 4 °С). Определение вышеперечисленных маркеров проводили в супернатанте. Биохимический метод оценки АФГ и КФГ основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов. При длине волны 274 нм определяли содержание АФГ, а при длине волны 363 нм — КФГ. Содержание АФГ и КФГ выражают в у.е. / г белка. Содержание НТЗ определяли в выделенном супернатанте суспензии митохондрий методом твердофазного иммуноферментного анализа (Nitrotyrosine ELISA KIT, Bycoil biotech). Уровень нитротирозина выражали в нмоль / г белка.
Результаты исследований. Учитывая роль оксидативного стресса в угнетении
активности митохондрий, а также с целью уточнения механизма действия ВКНС проведено исследование при моделировании оксидативного стресса in vitro.
Как известно, одним из перспективных направлений является поиск соединений, тормозящих процессы ОМБ. Исследования АОА по торможению ОМБ показали, что нанокомпозит ВКНС оказывает предвиденную активность по степени снижения АФГ, КФГ, НТЗ и открытия МП в условиях оксидативного стресса in vitro.
Нанокомпозит ВКНС характеризуется значительной митопротективной активностью, которая выражается в снижении степени открытия МП, по сравнению с контрольным образцам на 59,4 % (табл. 1).
Таблица 1
АОА нанокомпозита ВКНС за ингибированием Red / Oxi-зависимого открытия МП в условиях in vitro
Препарат Оптическая плотность, Д АОА, %
Интакт 0,058 ± 0,003 —
Контроль (50 мкМ Н2О2/ 50 мкМ СаС12) 0,360 ± 0,055 # —
ВКНС (100мкМ) 0,146 ± 0,015 * 59,4
Примечание: # — р < 0,05 относительно интакта; * — р < 0,05 относительно контроля
В экспериментах нанокомпозит снижал образование 2,4-динитрофенилгидразонов — АФГ и КФГ, а внесение в инкубационную среду исследуемой субстанции в концентрации 100 мкМ снижало данные показатели на 34,8 и 46 % соответственно (табл. 2). Синтез НТЗ уменьшается на 22,2 % (табл. 2).
Таблица 2
АОА нанокомпозита ВКНС in vitro за ингибированием образования окислительных модификаций белка (M ± m)
Препарат АФГ, у.е./г АОА, % КФГ, у.е./г АОА, % НТЗ, нМ/г АОА, %
Интакт 3,36 ± 0,11 — 1,32 ± 0,28 — 14,8 ± 1,49 —
Контроль (50 мкМ Н2О2, 50 мкМ СаС12, 1% тритон Х-100) 7,50 ± 0,41 # — 4,11 ± 0,34 # — 38,1 ± 4,89 # —
ВКНС (100мкМ) 4,89 ± 0,51 * 34,8 2,22 ± 0,09 * 46,0 29,7 ± 1,82 * 22,2
Примечание: # — p < 0,05 относительно интакта; * — p < 0,05 относительно контроля
Обсуждение результатов. При исследовании свободнорадикальных процессов при острых кишечных инфекций (ОКИ) установлен неоднородный характер активации свободнорадикального окисления. Наиболее тяжелые симптомы и осложнения ОКИ, а также наибольшая продолжительность интоксикационного синдрома наблюдается у больных с гиперактивацией оксидативных процессов в плазме крови. Средние показатели интенсивности свободнорадикального окисления отмечались у большинства больных и коррелируются с наименьшей продолжительностью лихорадки, симптомов интоксикации и определяют в основном умеренное течение инфекции [3].
Однако, методы in vitro отличаются высокой специфичностью, не требуют высоких затрат на реактивы и приборы, позволяющие исключить из модельной системы посторонние
факторы, которые могут влиять на свободнорадикальные процессы, дают возможность количественной оценки АОА исследуемых веществ и одновременно скрининга большого количества соединений [2].
В условиях оксидативного стресса в клетках создаются неблагоприятные условия для их жизнедеятельности: подавляется активность тирозинкиназ и ферментов окислительных реакций (сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы), нарушается фосфорилирование белков, активируются проапоптични факторы транскрипции [8].
Окислительная модификация белковых структур мембраны нейрона в условиях ишемии приводит к нарушению генерации и проводимости нервного импульса, десенситации рецепторов, образованию пор и, как следствие, инициации апоптоза и формированию неврологических нарушений. Одним из ключевых механизмов действия многих известных антиоксидантов-нейропротекторов является их способность тормозить Red / Oxi-зависимое открытия МП [1], процессы окислительной модификации белков и накопления маркерных карбонильных и карбоксильных продуктов — АФГ и КФГ [8], а также НТЗ [2].
Воспроизведенный оксидативный стресс in vitro характеризовался увеличением образования продуктов ОМБ, реагирующих с 2,4-ДНФГ в супернатанте мозга крыс. Было отмечено следующее повышение содержания продуктов ОМБ: АФГ на 123,1 %, КФГ на 211,2 %, НТЗ на 157,7 %. Полученные результаты не противоречат данным других исследований [4], которые показали, что в условиях развития оксидативного стресса усиливается нитрование тиольных групп белковых молекул, низкомолекулярных антиоксидантов, а также образование белковых карбонилов по конечным N^-группам.
Известные на сегодняшний день препараты подтверждают свои антиоксидантные свойства путем снижения образования ОМБ in vitro. Тиотриазолин снижаетRed / Oxi-зависимое образование АФГ на 40 % и КФГ на 45,5 %, а эмоксипин на 30 и 30,5 % соответственно [2]. В экспериментах нанокомпозит снижал образование АФГ и КФГ, а внесение в инкубационную среду исследуемой субстанции в концентрации 100 мкМ снижало данные показатели на 34,8 и 46 % соответственно, что не уступает активности существующих на рынке антиоксидантов.
Следовательно, основываясь на полученных результатах, можно предположить, что нанокомпозит ВКНС будет проявлять антиоксидантные свойства и в условиях in vivo, что требует проведения дополнительных исследований.
Выводы
1. Выраженность проявлений оксидативного стресса in vitro, инициированного перекисью водорода и кальция хлоридом, а также последующим добавлением детергента (тритон Х-100), вызывает увеличение количества окислительных модификаций белка
в супернатанте гомогената мозга крыс.
2. Нанокомпозит высокодисперсного кремнезема с наночастицами серебра уменьшает проявление оксидативного стресса.
3. В условиях оксидативного стресса in vitro нанокомпозит високодисперсного кремнезема с наночастицами серебра способствует уменьшению открытия митохондриальной поры на 50,9 % и синтеза нитротирозина, альдегидфенилгидразонов и кетофенилгидразонов на 22,2; 34,8 и 46 % соответственно.
Список литературы
1. Акопова О. В. Снижение чувствительности митохондрий к Са2+-зависимому открытию
поры в условиях длительной инкубации / О. В. Акопова, В. Ф. Сагач // Укр. биохим. журн. - 2004. - Т. 76, № 35. - С. 61-65.
2. Рациональная нейропротекция / И. Ф. Беленичев [и др.]. — Д. : Издательский дом Заславский, 2009. — 260 с.
3. Ныркова О. И. Состояние свободнорадикальных процессов в острый период бактериальной дизентерии у детей и подходы к направленной патогенетической терапии / О. И. Ныркова, О. В. Тихомирова, Л. В. Говорова // Вестн. Санкт-Петербургской государственной академии им. И. И. Мечникова. — 2005. — № 4.
— С. 35-38.
4. Реутов В. П. Биохимическое предопределение NO-синтазной и нитритредуктазной компонентов цикла оксида азота / В. П. Реутов // Биохимия. — 1999. — Т. 64, № 5. — С. 634-651.
5. Пат. 69526 Украина, МПК (2012.01) А61К 6/00. Способ получения нанокомпозита высокодисперсного кремнезема и кластеров серебра с противомикробными
и сорбционно-детоксикационными свойствами / Савченко Д. С., Чекман И. С., Воронин Е. Ф., Носач Л. В. ; заявитель и патентообладатель НМУ им. А. А. Богомольца.
— № 2011 15221 ; заявл. 22.12.2011 ; опубл. 25.04.2012, Бюл. № 8.
6. Чекман И. С. Нанофармакология: экспериментально-клинический аспект / И. С. Чекман // Врачебное дело. — 2008. — № 3-4. — С. 104-109.
7. Химия поверхности кремнезёма : в 2-х т. / А. А. Чуйко [и др.]. — К. : УкрИНТЭИ, 2001.
— Т. 1. — 736 с.
8. Halliwell B. Free radical in Biology and Medicine / B. Halliwell, M. C. Yutteridge. — Oxford : Clarendon Press, 1999. — 320 p.
9. Use of nanosilver in consumer products / K. W. Lem [et al.] // J. Recent Pat Nanotechnol.
— 2012. — Vol. 6, N 1. — Р. 60-72.
10. The progress of silver nanoparticles in the antibacterial mechanism, clinical application and cytotoxicity // C. You [et al.] // Mol. Biol. Rep. — 2012. — Vol. 39, N 9. — Р. 9193-9201.
STUDYING OF ANTIOXIDATIC PROPERTIES OF NANOCOMPOSITE OF HIGHLY DISPERSIVE SILICON DIOXIDE WITH SILVER NANOPARTICLES
D. S. Savchenko
National medical university n. a. A. A. Bogomolets (Kiev, the Ukraine)
The objective of the research is studying the antioxidatic properties of nanocomposite of highly dispersive silicon dioxide and silver nanoparticles. Expression of implications of oxidative stress of in vitro initiated by H2O2, CaCl2, and subsequent addition of detergent (triton of H-100) causes augmentation of number of oxidizing modifications of protein in supernatant of homogenate of rats brain which decreases under the influence of the studied nanocomposite. Decrease of opening of mitochondrial pore on 50,9%, and nitrothyrosinum synthesis, adelhydfenihydrazones and ketophenylhydrazones on 22,2; 34,8 and 46% respectively is observed.
Keywords: silver nanoparticles, highly dispersive silicon dioxide, nanocomposite, antioxidatic activity.
About authors:
Savchenko Dmitry Sergeyevich — post-graduate student of pharmacology and clinical pharmacology chair at National medical university n. a. A. A. Bogomolets, office phone: +38 044 454 49 24, e-mail: savchenko_ds@ukr.net
List of the Literature:
1. Akopova O. V. Depression of sensitivity of mitochondrions to Ca2±dependent opening of a pore in the conditions of long incubation / Island V. Akopova, V. F. Sagach // Ukr. biochemical journ. — 2004. — V. 76, № 35. — P. 61-65.
2. Rational neuropatronage / I. F. Belenichev [etc.]. — D.: Publishing house Zaslavsky, 2009. — 260 P.
3. Nyrkova O. I. State of free radical processes during the acute period of bacterial dysentery at children and approaches to referred pathogenetic therapy / O. I. Nyrkova,
O. V. Tikhomirova, L. V. Govorov // Bull. of the St. Petersburg state academy of I. I. Mechnikov. — 2005. — № 4. — P. 35-38.
4. Reutov V. P. Biochemical predetermination NO-synthase and nitrite reductase components of cycle of nitrogen oxide / V. P. Reutov // Biochemistry. — 1999. — V. 64, № 5. — P. 634-651.
5. Pat. 69526 the Ukraine, MPC (2012.01) A61K 6/00. Way of receiving nanocomposite of highly dispersive silicon dioxide and silver clusters with antimicrobic and sorption detoxificative properties / Savchenko D. S., Chekman I. S., Voronin E. F., Nosach L. V.; the
applicant and the patent holder of NMU n. a. A. A.
6. Chekman I. S. Nanopharmacology: experimental and clinical aspect / I. S. Chekman//Medical business. — 2008 . — № 3-4. — Page 104-109.Чекман И. С. Нанофармакология: экспериментально-клинический аспект / И. С. Чекман // Врачебное дело. — 2008. — № 3-4. — С. 104-109.
7. Chemistry of a surface of silicon dioxide: in 2 t. / A. A. Chuyko [etc.]. — To. : УкрИНТЭИ, 2001. — T. 1 . — 736 pages.Химия поверхности кремнезёма : в 2-х т. / А. А. Чуйко
[и др.]. — К. : УкрИНТЭИ, 2001. — Т. 1. — 736 с.
8. Halliwell B. Free radical in Biology and Medicine / B. Halliwell, M. C. Yutteridge. — Oxford : Clarendon Press, 1999. — 320 p.
9. Use of nanosilver in consumer products / K. W. Lem [et al.] // J. Recent Pat Nanotechnol. — 2012. — Vol. 6, N 1. — Р. 60-72.
10. The progress of silver nanoparticles in the antibacterial mechanism, clinical application and cytotoxicity // C. You [et al.] // Mol. Biol. Rep. — 2012. — Vol. 39, N 9. — Р. 9193-9201.
