CC BY
27
УДК 574.5; 572.1/.4; 532; 533; 536; 538.9
Б. П. Николаев, канд. физ.-мат. наук Л. Ю. Яковлева, ст. науч. сотр.
ФГУП «ГосНИИ особо чистых биопрепаратов» ФМБА России
Концепция гипобиоза и проблема биобезопасности наноматериалов
Ключевые слова: гипобиоз, наночастица, токсикология, мембранный потенциал, биобезопасность
Рассмотрены общие вопросы учета мета-болитной депрессии клеток (гипобиоза) в оценке потенциальной токсичности искусственно синтезируемых наноматериалов и конструирования клеточных биосенсоров. Обсуждается регуляторная роль мембранного потенциала в управлении физиологическим состоянием клетки, находящейся в контакте с наночас-тицами. Измерение мембранного потенциала клетки является удобным интегральным показателем гипобиотического состояния клетки. Индукция гипобиоза химическими индукторами повышаетрезистентность микробиоты к стрессовым факторам биоцидных наночас-тиц, что необходимо учитывать при выработке критериев безопасного обращения в производстве и применении наноматериалов.
Появление в начале XXI в. в экосистеме человека разнообразных видов наночастиц искусственного происхождения поставило ряд острых вопросов биобезопасности наноматериалов для человека и окружающего живого мира. Благодаря малым размерам и высокой химической активности поверхностных структур наноразмерных объектов на-ночастицы способны внедряться в клетки, внося существенные трансформации на фено- и геноти-пическом уровне организации организма. Новое научное направление — нанотоксикология — изучает вопросы токсического воздействия наночастиц, оценивает пороги безопасного обращения, длительность циркуляции наночастиц в организме и возможные пути их выведения в природном биоценозе. Было установлено, что наряду со сравнительно безопасными нанодисперсными материалами, такими как, например, окись титана, мел, в экосистему в последние годы стал поступать новый вид потенциально опасных для здоровья человека прямых и побочных продуктов электронной промышленности, фармацевтики и новых химических технологий. В ряде исследований была показана токсичность соединений группы А3В5 и редкоземельных металлов в нанодисперсной форме [1]. Многообразный и сложный характер воздействия
наночастиц на протеомном, метаболомном и гено-типическом уровне функционирования клеток требует оценки биологического влияния антропогенных наночастиц на здоровье человека и развития системного подхода. Дополнительным аргументом в пользу привлечения системных представлений являются результаты исследований в области технологических разработок биосенсоров, использующих в качестве аналитического элемента отдельные эукариотические и бактериальные клетки [2]. Встраивание отдельной клетки в сочетании с на-норазмерным элементом в единую биосенсорную систему невозможно без учета всех особенностей физиологии клетки в присутствии нанодисперс-ного материала.
Контакт клетки с наночастицами дисперсного материала может развиваться по нескольким вариантам морфофизиологических изменений:
• полная биосовместимость с отсутствием адгезии наночастиц на клеточной поверхности и отсутствием морфофизиологических изменений;
• эндоцитоз наночастиц и последующее включение метаболических путей расщепления нанодис-персного материала в лизосомах без повреждения внутриклеточных структур;
• нарушение целостности клетки с последующим летальным исходом при специфическом контакте с наночастицами, способными вступать в координационное химическое взаимодействие;
• индукция механизмов апоптоза;
• индукция гипобиоза, т. е. сохранение жизненных функций клетки с фенотипическим подавлением интенсивности метаболических процессов, тесно связанных с транспортом клеточных мембран.
Полной биосовместимостью, как правило, обладают наночастицы, сформированные из натуральных белков и липидов клеток-хозяина. Благодаря низкой токсичности и совместимости белковые наночастицы из альбумина используют при конструировании систем целевой доставки онкологических препаратов в злокачественные опухоли. При формировании наноматериала из чужеродных источников и попадании таких наночастиц в организм через дыхательные пути или желудочно-ки-
Вода, пища
Рис. 1 Пути выведения наноматериала из организма человека при интоксикации
шечный тракт, как показано на рис. 1, включаются механизмы иммунологического узнавания на-ночастицы как нового антигена и макрофагально-го выведения наночастичного ксенобиотика по механизму эндоцитоза. Эндоцитоз, как форма неспецифической защиты организма от микродисперсного токсиканта, осуществляется в организме специализированными клетками ретикулоэндотели-альной системы и весьма эффективен против вторжения в организм микронизированных агентов любого химического состава. Однако эффективность макрофагального захвата частицы резко снижается при уменьшении дисперсного размера до 10 нм, а прокариоты вообще не имеют специальной функции удаления микро- и нанодисперсных частиц. Следует заметить, что опсонизированные клетки способствуют агломерации наночастиц в микрочастицы, которые являются мишенью для макрофагального поглощения. При сильной нагрузке мак-рофагальных клеток наноматериалом уничтожение наночастиц ксенобиотика сопровождается гибелью макрофагов, которая компенсируется притоком новых клеток и искупается поддержанием общего гомеостаза организма.
Однако большинство неорганических наночастиц металлов и их окислов не относятся к инертным материалам. Они оказывают биоцидное воз-
действие на про- и эукариотические клетки и различаются только дозой токсического эффекта. Мониторинг жизнеспособности клеток грамм-отрицательных и грамм-положительных бактерий Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Thamnocephalus platyurus, Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna в присутствии нано-размерных частиц порошков и суспензий Al, Si, Ag, Au, Cu, Cd, Ni, Ti, Fe, Zn, CdSe, ZnO, Si02, CuO продемонстрировал их выраженное бактерицидное и бактериостатического действие [1, 3, 4]. Антибактериальная активность была также установлена для синтетических наночастиц углерода в форме фуллеренов С60, нанотрубок и разнообразных нанокристаллов полупроводников [5]. Цито-токсическое действие таких неорганических наночастиц связано с нарушением проницаемости мембраны и окислительным стрессом, вызванным генерацией активных форм кислорода.
Токсические свойства наночастиц металлов сильно зависят от размера, заряда, типа кристаллической структуры ядра и способности выщелачивания растворимых координационно ненасыщенных ионов во внешнюю среду. Некоторые нано-дисперсные формы окислов металлов, в частности магнетита, отличаются слабой токсичностью и даже
используются в качестве диагностических препаратов в клинических исследованиях. Тем не менее такие наночастицы подавляют метаболическую активность клеток, вызывают апоптоз, что в перспективе может вести к хроническим побочным явлениям при долговременной аппликации.
Принимая во внимание сложный и многовариантный исход взаимодействия наночастицы на уровне отдельной клетки, в исследование биобезопасности наноматериалов необходимым образом включают доклинические этапы исследования на клеточных моделях. На доклиническом уровне исследования оказываются полезными общебиологические представления, полученные в рамках биотехнологии изготовления и хранения микробных препаратов. Применение микробных культур вместо дорогостоящих культур клеток тканей человека в качестве клеточных моделей упрощает и снижает стоимость доклинических исследований токсичности наночастиц. При этом приобретают ценность такие концептуальные понятия, как концепция гипобиоза.
Концепция клеточного гипобиоза как стадия предварительного защитного торможения главных метаболических процессов в клетке перед переходом в анабиоз получила в западной литературе распространение под названием метаболитной депрессии [6]. Зона гипобиоза характеризуется состоянием временного снижения жизнедеятельности, при котором интенсивность важных метаболических реакций оказывается сниженной, но неполностью. Гипобиоз, т. е. обратимое снижение общего метаболизма клеток в ответ на неблагоприятные условия внешней среды, считается общим проявлением адаптации биосистем различной степени сложности. Многие животные (рептилии, амфибии) при сезонном и даже кратковременном (дни, часы) снижении температуры, влажности, голодании и гипоксии могут регулировать уровень метаболизма, впадая в состояние зимней спячки, оцепенения, которое снимается при возвращении нормальных условий жизни.
В нормальных условиях обитания многоклеточные организмы характеризуются стандартным метаболическим состоянием (СМС), в котором энергия окисления пищевых субстратов покрывает расходы на поддержание теплового баланса с внешней средой, синтез низкоэнтропийных макромолеку-лярных соединений, макроэргов и поддержание электрохимического потенциала мембран. В СМС устанавливается гомеостаз по ряду ключевых параметров: энергетический заряд, концентрация аденозин три- и дифосфата (АТФ, АДФ), значение мембранного потенциала Ду.
Центральным местом энергетического гомеоста-за клетки как одного из главных признаков жизни является накопление энергии в форме разделения зарядов на клеточной мембране. Передача электронов от ряда восстановленных интермедиатов до конечного пункта окисления кислорода в дыхатель-
ной цепи сопровождается энергозатратным выбросом протонов наружу и установлением электрохимического потенциала протонов ДцН, который для большинства эукариот находится в пределах от -200 до -220 мВ в CMC [7]. Согласно хемиосмоти-ческой теории установление стационарного ДцН тесно сопряжено с образованием энергетически насыщенных (содержащих макроэргические фосфатные связи) соединений АТФ, АДФ, стимуляцией активного транспорта веществ, работой АТФаз. Сопряжение процессов окисления — восстановления в дыхательной цепи и фосфорилирования в эука-риотах не характеризуется 100%-ной эффективностью вследствие существования «обратной» утечки протонов внутрь клетки или митохондриально-го транспорта, частичного выхода внутриклеточного К+, Са+ из-за остаточной ионной проводимости (leakage) плазматической мембраны. Перечисленные процессы «холостого» хода протонных и ионных насосов снижают эффективность анаболизма, способствуют переходу в CMC химической энергии питательных субстратов (в первую очередь глюкозы) в теплоту без совершения механической работы.
При отклонении от CMC, вызванном ограничением поступления субстратов питания, кислорода или повышением энергетических потребностей организма, встречей с наноразмерным ксенобиотиком, клетка привлекает внутренние резервы, расщепляя АТФ, и тем самым поддерживает ионный баланс за счет стимуляции электрохимического потенциала ДцН. Потери АТФ в ходе энергетического голодания частично возмещаются гликоли-тическим синтезом АТФ в так называемом «обращенном» эффекте Пастера, но только на конечное время. При продолжительном глубоком стрессе недостаток АТФ, АДФ приводит к деполяризации мембраны, неконтролируемому выходу ионов К+ с одновременным поступлением Na+ и последующим серьезным повышением Са2+ внутри клетки с провоцируемой активацией лизосомальных фос-фолипаз и Са2+-зависимых протеаз, что в конечном итоге приводит к необратимым повреждениям мембраны и смерти клетки. Рассматривая акт взаимодействия клетки с наночастицей чужеродного материала как потенциально стрессовый фактор, индуцирующий гипобиоз, можно оценить снижение метаболизма в клетке с помощью чувствительного интегрального параметра — мембранного потенциала Ду.
Мембранный потенциал Ду цитоплазматических мембран очень удобный объективный показатель энергизации, поскольку является конечной результирующей многих первичных метаболических реакций клеток. Электрохимические исследования клеток посредством измерения мембранного потенциала получили признание в качестве эффективного методологического приема в изучении физиологии нервных процессов, транспорта ионов в растительных клетках, явления лекарственной устой-
чивости у бактерий. Время измерения потенциала Ду составляет не более 5-7 мин. Методические вопросы измерения мембранного потенциала клеток с помощью микроэлектродов, проникающих синтетических ионов и флуоресцентных зондов рассмотрены в литературе [9, 10].
Электрический потенциал на мембране Ду возникает за счет перераспределения концентраций носителей заряда между цитоплазмой клетки и внешней средой, обусловленного наличием как не-диффундирующих, так и диффундирующих ионов. Перекачка ряда ионов по электрогенному механизму за счет прямого разделения зарядов приводит к появлению дополнительной составляющей мембранного потенциала. Этот вклад в мембранный потенциал возникает при прохождении электронов по дыхательной цепи, функционировании различных протонных помп, мембраносвязанной АТФазы, цитохромоксидазы, пирофосфатазы и трансгидро-геназы. В формирование мембранного потенциала вносит вклад асимметричное распределение ионов К+, Ма+, С1~ между клеткой и внешней средой. Каждый из факторов, играющих роль в формировании потенциала, зависит от метаболического состояния клетки.
Существует обратная регуляторная связь между мембранным потенциалом Ду и метаболическим
состоянием клетки, которая имеет принципиально важное значение. При уменьшении мембранного потенциала наблюдается снижение интенсивности процессов синтеза АТФ и переноса электронов против градиента редокс-потенциала, трансмембранного переноса вещества против концентрационного (осмотического) градиента и теплопродукции, при которой уменьшение энергии, вырабатываемой биомембранами при переносе электронов или гидролизе АТФ, приводит и к уменьшению доли энергии, рассеиваемой в виде теплоты. Обширный список функциональных клеточных характеристик, зависящих от энергизации мембранного аппарата клеток, указывает на принципиально значимое положение электрохимического мембранного потенциала в определении метаболической реактивности и его универсальность как в отношении вида клеток, так и в отношении типа химического регулятора. Можно полагать, что мембранный потенциал активно участвует в формировании определенной резистентности клеток при атаке ксенобиотическими наночастицами. Гипотетическая схема молекулярного воздействия нано-частиц на эукариотические клетки представлена на рис. 2. Исследование мембранного потенциала клеток в присутствии наночастиц инородного материала может служить способом доказательства.
Рис. 2
Место гипобиоза в системе защиты клеток организма при интоксикации наночастичным материалом
В основе стандартного метода определения мембранного потенциала клеток бактерий обычно используется способность синтетического липофиль-ного катиона тетрафенилфосфония (ТФФ+) или флуоресцирующих ионов-индикаторов проникать через биологические мембраны и распределяться по обе стороны мембраны под действием разности электрических потенциалов на мембране [10]. Концентрацию проникающих ионов в клеточной суспензии измеряют ионселективным мембранным электродом, спектрофотометрически, методами флуоресцентной микроскопии или проточной цито-флуорометрии, причем в качестве электрода сравнения используют стандартный хлорсеребряный электрод [9]. Поглощение ионов-индикаторов клетками микроорганизмов определяют по уменьшению содержания иона во внеклеточной среде. Потенциал электрода прямо пропорционален логарифму концентрации ТФФ+ в исследуемом растворе. Мембранный потенциал, мВ, рассчитывают согласно уравнению Нернста:
Ay = -RT/zF х 1п(ТФФ+вну/ТФФ+вне),
где R — газовая постоянная; Т — температура; z - заряд иона; F — постоянная Фарадея; ТФФ+вну и ТФФ+вне — внутри и внеклеточная концентрация иона ТФФ+.
С помощью указанных методов оценки мембранного потенциала на примере большого числа микроорганизмов было показано, что существуют химические индукторы гипобиоза (разобщители окислительного фосфорилирования, ингибиторы дыхания, дейтерозамещенная вода, экзометаболи-ты и др.), при контакте с которыми происходит снижение мембранного потенциала, сопровождаемое метаболитной депрессией основных клеточных химических реакций. Обнаружена взаимосвязь между явлением искусственного химического гипобиоза клеток бактерий Escherichia coli и явлением повышения устойчивости к неблагоприятным физическим факторам среды, которая справедлива для многих классов микроорганизмов. Элементы гипобиотического поведения клеток под действием наночастиц серебра наблюдались при измерении мембранного потенциала митохондрий альвеолярных макрофагов, которые коррелировали с эндоцитозом и зависели от размера поглощаемой микрочастицы [11]. Особую важность представляет сочетанное применение индукторов химического гипобиоза и нанодисперсного материала. Перевод клеток в гипобиотическое состояние повышает их резистентность по отношению к био-цидным наночастицам, что ведет к изменению интервала предельно допустимых концентраций бактерицидного действия. Концепция гипобиоза дает основание более внимательно отнестись к данным оценки безопасности нанодисперсных материалов, полученных при скрининге на клеточных культурах в нормальных условиях, которые
не являются достаточными для корректных выводов о безопасности материала. Исследование биобезопасности нанодисперсного материала необходимым образом должно включать исследования с клетками в гипобиотическом состоянии, так как только в этом случае можно гарантировать справедливость заключений о безопасных дозах нанодисперсного материала для человека и окружающей среды.
Измерение мембранного потенциала позволяет контролировать степень гипобиоза клетки в динамике взаимодействия с нанодисперсным материалом. Последнее обстоятельство является существенным при конструировании клеточных биосенсоров, в которых эукариотическая клетка находится в непосредственном контакте с наночасти-цами, выполняющими функцию передачи изменения электрического потенциала с мембраны клетки трансдьюсеру. Погружение клетки в гипобиоз повышает стабильность и тем самым увеличивает время жизни чувствительного элемента биосенсора. Для перевода в гипобиоз могут быть использованы химические индукторы в составе жидкой среды микроэлектрода или микроплаты с иммобилизованными клетками. Изотопное замещение протонов воды на дейтоны является одним из способов индукции гипобиоза клеточного элемента биосенсоров для расширения технического диапазона работы сенсорного устройства в области повышенных температур.
Таким образом, привлечение концепции гипобиоза имеет практическую ценность при разработке вопросов бионанотехнологии в двух аспектах: научно обоснованного биобезопасного обращения с новыми формами наноматериалов и симбио-тического использования наночастиц в молекуляр-но-клеточных конструкциях в составе конкретных технических устройств сенсорного типа. Междисциплинарный характер концепции гипобиоза при ее применении обещает в ближайшем будущем появление новых интересных результатов в области экологии, медицины и нанотехнологии.
| Л и т е р а т у р а |
1. Oberdö rster G., Maynard A., Donaldson К., Castranova V., Fitzpatrick J., Ausman К., Carter J., Karn В., Kreyling W., Lai D., Olin S., Monteiro-Riviere N., Warheit D., Yang H. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy// Particle and Fibre Toxicology. 2005. Vol. 2, N 8. P. 1-35.
2. Сафронова О. Г., Химченко В. И., Штарк М. Б.
Тканевые и клеточные биосенсоры. Возможности клинического применения (обзор)//Мед. техника. 1995. № 6. С. 39-46.
3. Nel A., Xia Т., Madler L., Li N. Toxic potential of materials at the nanolevel// Science. 2006. Vol. 311. P. 622-627.
4. Weir Е., Lawlor A., Whelan A., Regan F. The use of 8.
nanoparticles in anti-microbial materials and their characterization//Analyst. 2008. Vol. 133, N 7. P. 835-45. 9.
5. Kang S., Herzberg M., Rodrigues D.F., Elimelech M. Antibacterial effects of carbon nanotubes: size does 10. matter!//Langmuir. 2008. Vol. 24, N 13. P. 64096413.
6. Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимической адаптации. М.: Мир, 1977. С. 398. 11.
7. Boutilier R. G., Donohoe P. H., Tattersall G. J., West T. G. Hypometabolic homeostasis in overwintering acquatic amphibians//J. Exp. Biol. 1997. Vol. 200. P. 387-400.
Padan E., Shimon S. Intracellular pH and membrane potential as regulators in the procaryotic cell// J. Membrane Biol. 1987. Vol. 95, N 3. P. 189-198. Камман К. Работа с ионселективными электродами. М.: Мир, 1980. 283 с.
Miratsugy М., Kamo N., Kobatake Y. Monitoring cell potential of E. coli with use of an electrode sensitive to TPP+. Change by addition of various sugars// Bioelectrochem. Bioenerget. 1982. Vol. 9, N 3. P. 325-331. Carlson C., Hussain S. M., Schrand A. M., Braydich-Stolle L. K., Hess K. L., Jone R. L., Schlager J. J. Unique Cellular Interaction of Silver Nanoparticles: Size dependent Generation of Reactive Oxygen Species//J. Phys. Chem. B. 2008. Vol. 112, N 43. P. 13608-13619.
В издательстве «Горячая линия-Телеком» вышли в свет и имеются в продаже книги
Биофизика для инженеров. Учебное пособие. В 2 томах. Том 1. — Биоэнергетика, биомембранология и биологическая электродинамика/ Е. В. Бигдай, С. П. Вихров, Н. В. Гривенная и др. Под ред. С. П. Вихрова и В. О. Самойлова. — М.: Горячая линия-Телеком, 2008. — 496 с.: ил. ISBN 978-5-9912-0048-6.
Биофизика для инженеров. Учебное пособие. В 2 томах. Том 2. - Биомеханика, информация и регулирование в живых системах / Е. В. Бигдай, С. П. Вихров, Н. В. Гривенная и др. Под ред. С. П. Вихрова и В. О. Самойлова. — М.: Горячая линия-Телеком, 2008. — 456 с.: ил. ISBN 978-5-9912-0049-3.
В учебном пособии систематизированы сведения о физических и физико-химических процессах, лежащих в основе жизнедеятельности организмов на всех уровнях их организации, необходимые для инженеров и специалистов, занимающихся разработкой и обслуживанием биомедицинской техники.
В первом томе двухтомного пособия изложены основы биоэнергетики и термодинамики биологических процессов, рассмотрены структура, свойства и функции биологических мембран и биоэлектрогенез. Второй том посвящен биофизическим основам двигательной активности человека, информационных и регуляторных процессов в биологических системах, а также общим принципам функционирования сенсорных систем.
Для студентов, обучающихся по направлению «Биомедицинская техника», будет полезна инженерам и специалистам, занимающимся моделированием физиологических процессов и разработкой аналитической, диагностической и лечебной аппаратуры.
Биомедицинское материаловедение. Учебное пособие для вузов / С. П. Вихров, Т. А. Холомина, П. И. Бегун, П. Н. Афонин. — М.: Горячая линия-Телеком, 2006. — 383 с.: ил. ISBN 5-93517-230-5.
Изложены на современном уровне основные разделы материаловедения. Проведен анализ свойств и особенностей применения в медицине и приборостроении проводниковых, полупроводниковых и диэлектрических материалов. Сформулированы и обоснованы требования, предъявляемые к материалам, предназначенным для биомедицинского применения: биологическая совместимость с живыми организмами, стабильность функциональных свойств, возможность стерилизационной обработки термическим, химическим или радиационным методами. Рассмотрены особенности применения различных материалов для внутритканевого протезирования. Предпринята попытка представления живого организма в качестве объекта материаловедения.
Книга рекомендована УМО по образованию в области радиотехники, электроники, биомедицинской техники и автоматизации в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению подготовки дипломированных специалистов 653900 — «Биомедицинская техника», может быть полезна аспирантам, инженерам, медицинским и научным работникам, специализирующимся в области биомедицинского материаловедения.
Взаимодействие естественных и искусственных полей и излучений с биологическими объектами. Учебное пособие для вузов / С. П. Вихров, Т. А. Холомина, Н. В. Гривенная. — М.: Горячая линия-Телеком, 2009. — 308 с.: ил. ISBN 978-5-9912-0088-2
Проведен анализ особенностей взаимодействия живых организмов с физическими полями и излучениями. Рассмотрены возможности применения полей и излучений различной природы в диагностике и лечении заболеваний.
Предназначено для самостоятельной работы студентов и аспирантов, обучающихся по направлению «Биомедицинская техника», а также для студентов медицинских вузов.
Рекомендовано учебно-методическим объединением вузов Российской Федерации по образованию в области радиотехники, электроники, биомедицинской техники и автоматизации в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлениям подготовки 200400 «Биомедицинская техника» и «Биомедицинская инженерия».
Справки по телефону: (495) 737-39-27 www.techbook.ru E-mail: [email protected]
