CC BY
108
Статья
суб- и целлюлярном уровнях с перепадами уровня Т4 и Т3, сохраняющимися 3 недели после воздействия ЭМП (рис. 3-4).
Эффекты ЭМП влияют на репродуктивную функцию животных: выявлен рост среднего числа детенышей у одной самки в опытной группе (до 9) по сравнению с контролем (до 7).
Рис. 5. Емкостная плотность пинеалоцитов (Уур) у контрольных особей и у подвергавшихся воздействию ЭМП в течение 3-х месяцев в зимнем и летнем периодах
masa tela povrsma masa tela povriina
1 ' I pocetno m| posle 4 ned.
Puc. 6. Прирост телесной массы и площади (povrsina - площадь; pocetno -исходно; posle 4 ned. - через 4 недели; ogled - опыт)
2 sata 24 sata
Рис. 7.Выделение солей и воды после нагрузки (sata - часы)
□tgc
□ chol
"З 600,00 íg 400, 00 ü 200,00 Ja 0,00
Рис. 8. Концентрация триглицеридов и холестерола в сыворотке (А) и телесная масса крыс (В)
Воздействие ЭМП на крыс-самцов в возрасте половой зрелости в течение 3 месяцев (50 Н7, 50-500 цТ) в зимний и летний периоды вызывает статистически значимое уменьшение емкостной плотности пинеалоцитов (рис. 5).
Изменениями нейроэндокринных структур под воздействием ЭМП можно объяснить отставание в приросте телесной массы в опытной группе животных (рис. 6). Используя тест нагрузки
водой и солью для функционального исследования почек, обнаружили различия в диурезе и салурезе (рис. 7). Под воздействием ЭМП наблюдаются статистически различия в обмене липидов в контроле и в экспериментальной группах животных (рис. 8).
Морфологические изменения в ЦНС крыс под воздействием низкочастотного ЭМП имеют признаки деструктивных (сосудистые нарушения, кровотечения, атрофии нейронов) и репаративных процессов (гиперплазия диффузной и перицеллю-лярной глии). Эти данные и эпидемиологические научные труды и указывают на возможную роль ЭМП в возникновении неинфекционных массовых заболеваний, каковыми являются сердечно-сосудистые, нейроэндокринные, злокачественные, распространенность которых приобретает глобальный характер.
NONIONIZING RADIATION AS A POSSIBLE FACTOR FOR MASS NONINFECTIONS
B. LAZHETICH, I.M. MATAVUL, S. POPOVICH
Summary
Cardiovascular, neuroendocrine and malignant diseases may have an electromagnetic field in their pathogenesis as an initial cause Key words: nonionizing radiation, electromagnetic field
УДК 628.9.037; 616.155.1
К ВОПРОСУ О ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ ФОРМЫ, УЛЬТРАСТРУКТУРЫ И ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИХСЯ В ЭХИНО-ЦИТЫ
В.Н КИДАЛОВ*, Н.И. СЯСИН*, А.А. ХАДАРЦЕВ**
Эритроциты обладают уникальной способностью к изменениям размеров и формы, что позволяет им свободно проходить через микроциркуляторное русло, обеспечивая газообмен, информационную и другие функции. Большая роль в поддержании формы этих клеток приписывается белковому цитоскелету мембран и внутриклеточному содержимому эритроцитов [18].
При ряде заболеваний необратимые и обратимые изменения эритроцитов имеют диагностическую значимость [3, 8]. Пока недостаточно исследован вопрос об особенностях строения обратимо трансформированных форм - эхиноцитов (Эхин)[1, 11].
При воздействии на организм различных факторов и при развитии патологии изменение конфигурации эритроцитов часто идет параллельно с изменением их размеров (макро- и микроци-тоз), увеличением дисперсии размеров (анизоцитоз), сдвигами в содержании внутриклеточного гемоглобина (МСН) в эритроцитах (гипер- и гипохромия), и ростом дисперсии его внутриклеточного распределения (анизохромия).
Подобные изменения накладывают характерные «отпечатки» на ультраструктурную организацию этих клеток. В мазках крови, в которых клетки обычно фиксируются спиртами или альдегидами, Эхин составляют 0-6% от всех разновидностей эритроцитов, что описывается в работах [5, 15].
Обычно Эхин описывается как сферическая клетка, на поверхности которой достаточно регулярно располагается до 30-50 спикул. Типичной для Эхин считается форма колючки с шипами. Между дискоцитом и такой формой существует ряд промежуточных форм, в которых отношение поверхности к объему остается нормальным. Образование эхиноцитов часто происходит также суспендировании эритроцитов в изотонической среде. Помещение в нормальные условия может вернуть клетки к дискоцитной форме. Превращение (трансформация) дискоцитов (Диск) в Эхин в начальной стадии обратимо. При этом было показано [14], что спикулы вновь появ ляются на поверхности клетки каждый раз в одном и том же месте.
Санкт-Петербург, ВЦЭРМ МЧС России,
** ТулГУ
А
В
В.Н Кидалов, Н.И. Сясин, А.А. Хадарцев
Приближая на расстояние 1-2 мкм, и удаляя от клетки, стеклянный стержень, можно до 40 раз вызывать появление и исчезновение спикулы. Близость любой стеклянной поверхности способствует образованию Эхин. Этим даже объясняли ранние опыты Ponder, наблюдавшего среди отмытых эритроцитов в стеклянной камере трансформацию дискоцит ^ эхиноцит ^ сфероцит. Обратимый переход Диск в Эхин и обратно может вызывать изменение pH среды от нейтрального до щелочного и обратно - эквилибр pH (РН эритроцитов несколько сдвинут в кислую сторону: 7,09-7, 27, по сравнению с плазмой крови, pH которой обычно колеблется в пределах 7,35-7,43 [20]. При этом сдвиги рН меняют мембранный потенциал клетки, в то время как снижение уровня рО2 таким действием не обладает [10]. Образование Эхин часто происходит при суспендировании эритроцитов в изотонической среде. Помещение в нормальные условия может вернуть Эхин к дискоцитной форме [11].
Существенное значение для перехода Диск ^ Эхин имеет временной фактор. При хранении крови до 10 суток наблюдаются изменения среднего объема и диаметра эритроцитов, увеличиваются гематокрит и вязкость крови, одновременно увеличивается число эхиносфероцитов, что сопровождается нарушением кислородной емкости крови. Эхин оказываются основной формой эритроцитов консервированной крови при длительном ее хранении. Однако in vivo, в свежих пробах крови, они обнаруживаются редко, обычно в тех случаях, когда в клетках низко содержание АТФ или нарушен состав плазмы. Трансформацию Диск — Эхин, по данным J.Jolly [16], можно разделить по степеням на Эхин1, -II, -III. Если клетка долго пребывает в состоянии эхиноцита, то возникает процесс потери липидного компонента мембраны и изменения формы становятся необратимыми (переход эхиноцита в сфероцит). При этом сканирующая электронная микроскопия все еще выявляет у этого сфероцита существование очень тонких спикул [6]. Одновременно можно наблюдать пойкило- и сферо-эхиноцитные формы, отражающие наступление прегемолиза и превращение клетки в настоящий сфероцит. Эти шиповидные формы клеток относят к подгруппе Эхин -IV [7]. В свежих дегидратированных препаратах для исследования феномена выстраивания краевой линии (ВКЛ) в части мазка с редким расположением клеток эритроциты принимают особые конфигурации. Но и здесь есть клетки с признаками эхиноцитной трансформации [9].
В жидких средах (клеточных взвесях) обратимые формы образуются в результате релаксации параллельно с изменениями ионного состава среды, окружающей эритроцит, а также при старении и повреждении клеток [14—15]. При всех подобных воздействиях на сами эритроциты, при действии стресс-факторов на весь организм, а также при заболеваниях изменяется характер расположения различных молекул внутри клетки, в том числе и тех, которые обладают свойствами жидких кристаллов [8]. In vitro Эхин образуются как под действием изменившегося pH, так и при наличии в окружающей клетки среде непроникающих анионов, катионных детергентов. Поэтому одной из причин эхи-ноцитоза считают повышенную проницаемость мембран клеток для натрия и калия. Шипы на поверхности эритроцтитов могут появляться при заболеваниях в результате цитотоксического действия на клетки протаз и других энзимов, в т.ч. и бактериальных [6]. Похожие изменения эритрона могут наблюдаться при воздействии на организм ионизирующих и неионизирующих излучений и других патогенов. У больных вибрационной болезнью доля измененных форм эритроцитов в мазке возрастает до 15% (при норме не более 3%) за счет стоматоцитов (Стом), эхи-ноцитов и дегенеративных форм. Изменения морфологии эритроцитов и увеличение их размеров при этой болезни приводили к снижению способности клеток к деформации и нарушениям микроциркуляции [5]. У больных, находящихся на парентеральном питании подсчет числа Эхин и Стом позволяет ориентироваться в изменениях концентрации в крови свободных жирных кислот, что может быть жизненно важно. Число Эхин в крови возрастает при онкологических заболеваниях, поэтому эхиноцитарную трансформацию пытались использовать в диагностике развития опухоли. Функционально-физиологическое значении эхиноцито-за пока недостаточно ясны. Причиной такого положения является то, что исследования ультраструктурных изменений Эхин до сих
пор не проводилось. Установлено, что если клетка долго пребывает в состоянии обратимой трансформации, то даже при световой микроскопии заметен процесс потери липидного компонента мембраны. При достижении критического уровня этой потери, изменения формы могут стать необратимыми [12-13]. Появление в эритроцитах гетерогенных включений коррелирует со снижением их резистентности к воздействиям разного рода [1-2]. Агрегаты гемоглобина часто обнаруживают в примембранных областях при действии физических факторов. При этом часть эритроцитов подвергаются лизису, претерпевая фазу сжатия, в результате эти клетки могут терять воду и уменьшаться в объеме. В этом случае гемоглобин образует частицы различной дисперсности, а при спектрофотометрии клеток появляется максимум на 630 нм в спектре поглощения. Это связывают с переходом гемоглобина в метгемоглобин внутри клетки и с агрегацией гемоглобина. Таким образом гемоглобин может агрегировать при действии теплового фактора, причем такая агрегация предшествует гемолизу клеток. Рост в окружающей среде концентрации соли также может вести к увеличению микровязкости цитозоля и изменению дисперсии гемоглобина Крайним выражением усиленной агрегации гемоглобина может стать появление внутри клеток телец Гейнца.
При появлении в крови или добавлении во взвесь клеток эхиноцитогенных веществ, в Эхин трансформируются (подобно нормальным Диск) эллиптоциты, превращающиеся в эхиноэллип-тоциты. Такая трансформация смешанного типа при заболеваниях часто ведет к пойкилоцитозу с деструктивными изменениями клеток, которые идут с перераспределением гемоглобина внутри клеток, перестройкой их мембран и цитоскелета [24, 30].
Стресс-факторы физической и химической природы вызывают повреждения мембраны клеток и концентрации гемоглобина (HDW). При этом изолированная липидная мембрана может быть прочной (нагруженные гемоглобином липосомы могут быть устойчивыми, циркулируя в крови в течение 2-3 дней) [12].
Мембрана эритроцита - композитная структура, в основе которой - фосфолипидный матрикс, пронизанный интегральными белками. На внутренней, цитоплазматической, поверхности липидного бислоя локализована прочная эластичная сеть, формируемая белками и называемая цитоскелетом. Структурными компонентами цитоскелета являются различные белки - субъединицы спектрина; анкирины; актин и тропомиозин [18-19]. Введение спектрина вовнутрь дефектных клеток может приводить к нормализации механических свойств эритроцитов [19].
Цитоскелет выявляется при обработке патологических эритроцитов (эллиптоцитов и пиропойкилоцитов) тритоном, при этом такие эритроциты дают скелеты с формой тех клеток, из которых они получены. Скелеты Эхин, образованных за счет изменения ионной силы, имеют нормальную форму [18]. При серповидно-клеточной анемии и абеталипопротеинемии цитоскелеты из патологических клеток, близки к нормальной форме [17].
Цитоскелеты Эхин, образовавшиеся за счет изменения ионной силы, могут иметь нормальную форму [18]. Эти опыты доказывают: при обратимых трансформациях клетки форма цитоскелета явно не меняется. Но в имеющихся данных нет сведений об изменении ультраструктуры клеток, подвергшихся обратимой трансформации. Восполнение этого пробела в отношении Эхин послужит для расшифровки механизмовадаптации, эритрона.
Материалы и методы. Исследование ультраструктуры и аутофлуоресценции велось методами, описанными ранее [2, 3]. Исследовалась периферическая кровь практически здоровых мужчин среднего возраста (п = 62) и половозрелых белых беспородных крыс-самцов (п = 32). Кровь забиралась, фиксировалась глутаровым альдегидом [4] и подвергалась просвечивающей электронной микроскопии. В этих же препаратах крови исследовалась форма клеток с помощью световой телевизионной микроскопии и аутофлуоресценция эритроцитов при помощи УФ-спектрофотометрической насадки СФН-10 к бинокулярному микроскопу ЛЮМАМ-Р1. Наблюдали также за трансформацией Диск в Эхин. Квантитативная эритрограмма, и в ее рамках - эхи-ноцитограмма с разделением эхиноцитов на 4 подгруппы (рис. 1), оценивались по признакам, описанным в [7-9]. Статобработка велась методами Стьюдента и Вилкоксона - Манна - Уитни с помощью компьютерной программы «Статистика-6».
*Здесь и далее сокращения «в т.ч.» означает «в том числе»; «т.к.» - «так как»
В.Н Кидалов, Н.И. Сясин, А.А. Хадарцев
і
V
эритроцитов в течение того же временного интервала претерпевала эхиноцитную или смешанную трансформацию (рис. 3)
Рис. 1. Эхиноцитограмма: распределение эхиноцитов на 4 подгруппы.
1- Эхин—1, 2 - Эхин—II , 3 - Эхин—III, 4 - формирующиеся сфероэхиноциты и пойкилоэхиноцит из подгруппы Эхи —IV.
Результаты. Установлена близость распределения эритроцитов в рамках квантитативной эритрограммы в свежих жидких препаратах периферической крови у здоровых мужчин и животных. Распределение трансформированных эритроцитов во взвеси (аутоплазма) по группам квантитативной эритрограммы у здоровых мужчин и белых беспородных крыс-самцов (после фиксации формы клеток глутаровым альдегидом, через 10 минут после эксфузии венозной крови показало, что у здоровых людей (и у крыс) число эхиноцитов <8%: у людей ср. число этих форм - 5% (1-8%), у крыс - 4,1% (0-7%), Р<0,05. При световой и просвечивающей электронной микроскопии в пробах крови мужчин и крыс-самцов (во взвеси сразу после эксфузии) преобладают Диск, План и Стом І-ІІІ (82,1-83,8%) с характерной, близкой к равномерной, ультраструктурой мембран и внутриклеточного содержимого. Среди эхиноцитов здоровых лиц в плазме их крови выявлялись единичные Эхин—! и Эхин — II, в форме клеток с извилистой наружной линией тора либо с наличием единичных крупных выпячиваний клеточной оболочки («крупношиповые» эхиноци-ты), либо с малым числом заостренных - до 10 - шипов. У соматических больных ср. число эхиноцитов среди эритроцитов было выше 5%, чаще - ЭхинШ и. Эхи^У (рис. 2).
3
Рис 2. Форма и ультраструктура эритроцитов во взвеси. Световая микроскопия, ув.300. 1- Эхин1 - клетка с волнистой наружной частью тора и двумя средними по величине клеточными шипами. 2 - то же , «крупношиповый» эхиноцит с тремя шипами; 3. ЭхинЛ - с 10 шиповидными выпячиваниями в тороидальной области клетки. 4. ЭхинШ - с заостряющимися «шипами» в области тора и пеллора клетки. 5. Эхин1У- формирующийся сфероэхиноцит (клетка покрыта большим числом крупных заостренных спикул).
4
Рис.3. Эхиноциты в солевых средах, световая микроскопия, ув.350. 1 и 2 -эритроциты, претерпевающие смешанную - планоцитарную и эхиноци-тарную трансформацию; 3 и 4 - в Эхин, фиксированных глютаровым альдегидом, через 2 недели после фиксации обнаруживаются новые вздутия клеточной мембраны по типу пузырьков. 5 - сферуляция ЭхинШ в солевой среде для постановки реакции стимулированного эритродиереза; 6 - смешанный тип трансформации эритроцита: дискоцит трансформируется в анулоцит с крупными шипами
В крови, помещенной в изотоническую среду осмоляльно-стью около 282 мосмоль/кг Н2О (раствор натрия хлорида), число Эхин быстро нарастало со временем хранения и выросло в 2, 5 раза через 48 часов, по сравнению с исходным уровнем. Часть
Рис.4. Ультраструктурные изменении клеток в районе клеточных шипов.
Электронная микроскопия.
1. А - ультраструктура зоны выпячивания «крупношипового» Эхин1 с примембранной концентрацией гемоглобина .Ув.8 000 ; Б - часть эхино-пойкилоцита, ув. 10 000; В - различные формы спикул пойкилоэхиноцита, ув. 12 000; Г - неравномерная оптическая плотность различных участков спикулы пойкилоэхиноцита, ув 14.000; Д - разрыхление острой концевой части спикулы, ув 14 000; Ж - зона отшнуровки части спикулы ЭхинШ в гиперосмотичной солевой среде, ув. 8 000; З -- концентрация гемоглобина в виде крупной гранулы в зоне выпячивания Эхин11, ув. 12 000. 2 - разрыхление наружного слоя клеточной мембраны ЭхинЛ в зоне сформировавшегося выпячивания, ув. 15000; 3 - А - эндовезикуляция Эхин IV в гиперос-мотичной солевой среде, с концентрацией гемоглобина возле везикулы, ув. 18 000. Б - повреждение мембраны вследствие процессов эндо- и экзове-зикуляции и выход гемоглобина в окружающую Эхин- III солевую среду, ув. 18 000.
Подобные эффекты связаны со способностью натрия хлорида в растворе играть роль экстрактора белков из клеток [2]. В растворах натрия хлорида содержание ионов хлора всегда в избытке, окружающая среда имеет превалирование кислых свойств, что сможет играть роль эхиноцитогенного фактора. Эхиноцитар-ную трансформацию более легко проходят зрелые эритроциты -дискоциты, нежели ретикулоциты, клетки с более высокой оптической плотностью содержимого протоплазмы и менее равномерным распределением гемоглобиновых гранул на срезах клеток. Этот процесс в отношении ретикулоцитов задерживается наличием в них внутриклеточных органелл, которых почти нет в зрелых эритроцитах. Это связано с тем, что в отличие от зрелых эритроцитов, в них еще продолжается процесс самосборки белкового цитоскелета и структуризации гемоглобина, и эти клетки еще более ригидны, чем зрелые Диск [1]. При электронной микроскопии установлено, что ультраструктура обычных дискоид-ных эритроцитов характеризуется практически равномерной, с небольшими вариациями, клеточной мембраной, малым числом ее локальных повреждений, более равномерным внутриклеточным распределением гемоглобина в Диск и менее равномерным в План, практическим отсутствием складок (дупликатур) и слабой выраженностью у практически здоровых особей экзо- и эндове-зикуляции эритроцитов. В Эхин, находившихся в плазме крови, при световой микроскопии признаки деструкции имеются очень редко. На электронно-микроскопических снимках зоне формирующихся шипов есть утолщение клеточной мембраны и разрыхление ее гликокаликсного слоя (рис. 4-1). В солевых средах в Эхин и в др. клетках имеется расширение пространства между наружным и внутренним слоем оболочки клетки, разрыхление и частичная деструкция гликокаликсной зоны - наружного слоя 2-
В.Н Кидалов, Н.И. Сясин, А.А. Хадарцев
слойной клеточной оболочки. Имеется неравномерность уровня гемоглобина в примембранных слоях (рис. 4-2 и 4-3).
Как показано на рис. 3, трансформация Диск в Эхин у некоторых клеток сопровождалась выходом наружу гемоглобина и, вообще, части внутреннего содержимого через небольшие участки деструкции бислойной клеточной оболочки. Это могло быть связано с тем, что при агрегации гемоглобина в примембранных слоях наступает дестабилизация внутренней части бислоя мембран. Отрыв (отшнуровка ) или клазматоз мембраны сопровождается нарушением биохимизма энергетических внутриклеточных обменных процессов и освобождением в кровь аутоантител. Известно также, что если концентрация гемоглобина в эритроците снижается, то он легче деформируется. Потеря гемоглобина при этом увеличивает гетерогенность эритроцитарного пула по уровню гемоглобина [10]. Сочетание этих процессов повреждает клеточную оболочку и стимулирует локальный внутриклеточный диерез. При этом часть агрегатов гемоглобина выходят в суспензионную среду. По данным [17], перемена конфигурации эритроцитов в аномальных клетках сопровождается изменением в клетке и ее мембране аминокислот, активности ферментов и НАДН.
При спектрофотометрии эритроцитов-дискоцитов максимум интенсивности их аутофлуоресценции приходился на длины волн 480-495 нм у человека и у крыс. Общая интенсивность свечения Эхин в УФ-лучах оказалась до 1, 5-3 раз ниже, чем в Диск. При этом в ЭхинШ имеет место сдвиг максимума интенсивности флуоресценции на 5-10 нм в коротковолновую область (рис. 5).
Рис. 5. Различный уровень аутофлуоресценции эритроцитов в УФ-лучах. 1- яркое (I max er=2,30 e) свечение наружной тороидальной части эритроцита; 2- свечение (I max er=1,75 e) внутренней тороидальной части и зоны пеллора эритроцит; 3 - общий уровень интенсивности (I max er=1,35 e) свечения ЭхинШ..
При видеозаписи препаратов с использованием чернобелой и цветной видеокамер был установлен особый характер свечения отдельных участков этих клеток. При общем меньшим (по сравнению с Диск) уровнем светимости Эхин выявлены существенные отличия в характере аутофлуоресценции клеток, относящихся к различным подгруппам эхиноцитограммы (рис. 6).
Рис. 6. Неоднозначность картины аутофлуоресценции эхиноцитов. Телевизионная микрскопия. Ув. х300. 1 - свечение Эхин1 - области крупного шипа.2 и 3 - яркое свечение шиповидных выпячиваний Эхин11.
Дополнительная информация получена при оценке характера свечения эритроцитов при возбуждении аутофлуоресценции УФ и видимым светом (рис.7):
Характер испускаемого клеткой света зависел от способа возбуждения аутофлуоресценции, а ее цветовая гамма в УФ-лучах характеризовалась белым, желтым, розовым и синефиолетовым светом. При увеличении осмотичности жидкой среды, в которую помещались пробы крови усиливалась интенсивность флуоресценции крупных шипов Эхин1. При этом максимально интенсивность свечения возрастала в период полного испарения воды вокруг клетки (рис. 7 - 1 и 2).
Рис. 7. Аутофлуоресценция эритроцитов при ее возбуждении УФ и видимым светом. Ув. х300.
3
Рис. 8. Аутофлуоресценция эхиноцитов при ее возбуждении УФ и видимым светом. Ув. х300. 1 - свечение Диск при возбуждении аутофлуоресценции УФ и синим светом. 2 - свечние Эхин11 при аналогичном возбуждении аутофлуоресценции. 3 и 4 - интенсивная аутофлуоресценция Эхин1 при возбуждении аутофлуоресценции УФ и зеленым светом в период высыхания парепарата.
Рис. 9. «Послойная» оценка аутофлуоресценции Эхин11 при ее возбуждении УФ- и зеленым светом. Телевизионная микроскопия, ув.320. 1 - свечение поверхностного участка трансформирующейся области тора ЭхинЛ, 2 - фокусировка светового потока на более глубокую часть трансформирующегося тора ЭхинЛ. 3 и 4 - фокусировка светового потока на поверхностную часть клеточной мембраны в зоне пеллора Эхин11.5 - глубокая фокусировка светового потока на центральную часть зоны пеллора ЭхинЛ.
В период эхиноцитарной трансформации зона пеллора флюоресцировала слабее, чем «бывшая» зона клеточного тора. Такое положение сохранялось даже в случае формирования в этой зоне крупных шиповидных выпячиваний (рис. 7 - 3, 4, 5 и 6). Установлена неоднозначность ответной реакции шиповидных участков клеток на УФ-облучение. В Эхин часть шипов флуоресцировала слабо, а отдельные шипы или их группы обладали мощной флуоресценцией (рис. 7 - 7, 8, 9). При возбуждении флуоресценции УФ в комбинации с синем и зеленым светом подтвержден повышенный флуоресцентный ответ при изменении
7
1
1
Статья
условий инкубации клеток (рис. 8). Фокусирование возбуждающего флуоресценцию клеток света удобно для оценки послойного свечения клеток, что позволило вести послойную «томографию» Эхин (рис. 9.). Полученные данные подтвердили морфологическое, ультраструктурное и функциональное (по ответу на возбуждающее свечение возбуждение) Эхин. Процесс трансформации Диск — Эхин зависит от ряда факторов, в т.ч., малоизученных. Многогранный процесс изменения дискоидной формы эритроцита на эхиноцитную сопровождается перестройками внутриклеточного содержимого и наружной клеточной мембраны, а также изменениями их спектра аутофлуоресценции.
Литература
1. Алексеева Г.А. Морфо-функциональные характеристики эритроцитов периферической крови при вибрационной болезни: Дис.. .канд. мед. наук.- М., 1996.- 256 с.
2. Бирюзова В.И. и др. Электронно-микроскопические методы исслед-я биообъектов.- М.: Изд-во АН СССР, 1963.- 205 с.
3. Еделькин А.М., Кидалов В.Н. // Акт. вопросы хирургии внепеченочных желчных путей: Тез. науч. конф.- Новгород, 1988.- С. 62-63.
4. Зайцева К.К., Кидалов В.Н. // Бюл. эксперим. биол. и медицины.- 1986.- Т.11.- №7.- С. 112-114.
5. Истаманова Т.С. и др. Функциональная гематология.-Л., 1974.- 355 с.
6 . Ионов Б.В., Чернух А.М. // Бюл. эксперим. биол. и мед.-1981.- № 12.- С 749-752.
7. Кидалов В.Н.,ЛысакВ.Ф. // Лаб. дело.- 1989.- №8.- С. 36.
8. Кидалов В. Н. и др. // Современные аспекты оценки влияния малых доз радиации: Мат-лы конф.- Томск: ВМФ при ТГМИ.- 1966 .- С. 40-41.
9. Кидалов В.Н. и др. // Межакадемич. информ. бюл.-2001.- № 16.- С. 82-84.
10. Лебедева Н.Б. и др.// Клин. лаб .диагн.- 1995.- №6.-
С.72-73.
11. Муромцев В.А., Кидалов В.Н. Медицина в 21 веке.- СПб: ИНТАН.- 1998.- 131 с.
12. Сороковой В.И. и др. // Вест. РАМН.- 1996.- № 9.-
С. 35.
13. Шишканова З.Г., Мещерякова ЛМ. // Рос. научн. симп.: Экологические факторы и кроветворение.- М., 1992.- С. 4-48.
14. Bessman J.D. // The John Hopkins Medical J.- 1980.-Vol. 144.- Р. 226.
15. Bessis M. // Nouv Rev Fr Hematol.- 1972.-Vol. 12.- Р. 721.
16. Goodman S.R., Shiffer K. // Am.J.Physiol.- 1983.- Vol. 244, №3.- P. 121-141.
17. KiesslingK.et al. // The HematologyJ.- 2000.- B. 3.- S.243.
18. Lux S.E., Glader B.E. / In: Hematology of Infancy and Childhood (2-nd ed.) / ed. by L.S. Nathan, F.S.Oski.- Philadelphia, PA:Saunders.- 1981.- Р.456-565.
19. SIRES: Cell Image Retrieval and Evaluation System / SIRES User’s Manual.- Release 2.0 August 1993.
20. Policard A., Bessis M. Elements de Patologie cellulaire// Masson et Cie editeurs.- Paris, 1968.- P 200-220.
ON THE QUESTION CONCERNING THE PHYSIOLOGICAL SIGNIFICANCE OF CHANGES OF THE FORM, ULTRASTRUCTURE AND FLUORESCENCE OF ERYTHROCYTES OF PERIPHERAL BLOOD DURING THEIR TRANSFORMATION INTO ECHYNOCYTES
V.N. KIDALOV, N.I. SYASIN, A.A. KHADARTSEV Summary
The ultrastructural organization of erythrocytes can give an important information for the diagnostic. In a number of diseases convertible changes of erythrocytes - transformation disco-torus cells -discocytes (Disc) in echynocytes (Echyn) have the diagnostic importance. The data received in the given research testify that convertible transformation of the Disc ^ Echyn and back (Echyn ^ the Disc) cannot have absolutely identical character as transformation stomacytes in discocytes and will demand curing of local destructive changes in cells that is possible only after creation of optimum conditions for that purpose.
Key words: ultrastructural organization, echynocytes
УДК 616. 831-009.11-053.2-079
БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ЭРИТРОЦИТАХ, ВЫЗВАННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕМ С ВИРУСОМ КОКСАКИ А18. ВЛИЯНИЕ L-АРГИНИНА И ФОСФОНФОРМИАТА
М.И. БАКАНОВ*, Е.М. ВАСИЛЬЕВА*, И.А. ЕЛАГИНА*, И.В. ЗУБКОВА*, Л.С. ЛОЗОВСКАЯ**, Т.А. МАТКОВСКАЯ*
Введение. Вирусная инфекция часто является пусковым механизмом патологического процесса. Клетку можно поразить вирусом, даже если у неё нет адекватных рецепторов. Это возможно для вирусов полиомиелита, Коксаки и др. [1]. Известно, что оксид азота (NÜ) обладает противовирусным действием против ряда вирусов, в т.ч. против вируса гепатита А, вируса японского энцефалита, вируса инфлюэнции, вируса стоматита, вакцинных вирусов. Редуктазу ингибирует фермент, нужный для синтеза ДНК, NO' - РНК, [2]. А субстрат для синтеза NO' - L-аргинин - эффективно повышает иммунологические реакции. Кроме нейрональной и эндотелиальной форм NOS (являющихся кальций-кальмодулин зависимыми) существует индуцибельная форма NOS (iNOS), которая является кальций-кальмодулин независимой и активируется в ответ на эндотоксины, различные ци-токины. При многих поражениях, вызываемых вирусами, в т.ч. вирусами полиомиелита, в ЦНС происходит быстрая индукция iNOS. В эксперименте при вирусной инфекции активация iNOS в мозге наблюдалась за 4-5 дней до видимых патологических изменений [3]. Клеточные элементы крови, в т.ч. и эритроциты, являются активными в метаболизме NO. [4].
Цель работы - изучение влияния вируса на клетку (эритроцит) и участие в этом процессе оксида азота. Параллельно исследован эффект противовирусного препарата - фосфонму-равьиной кислоты (ФМК). Ряд веществ, в т.ч. и фосфонформиат, нарушают обратную транскрипцию онковирусов и ВИЧ [3], действуя как конкурентный ингибитор ДНК полимеразы [5]. Предполагают, что хелаты металлов, а к ним относятся и фосфоновые кислоты, могут инактивировать вирус, заняв на его поверхности активные центры, в нормальных условиях используемые для инициации процесса в клетке хозяина.
Методы исследований. Эксперименты проводились на эритроцитах доноров-добровольцев (в возрасте 25-56 лет, второй или третьей групп крови), исследовались: влияние вируса Коксаки А-18 на активность ион-транспортирующих АТФ-аз; содержание свободного внутриклеточного Mg; уровень общих липидов и фосфолипидов в эритроцитах. Кровь собирали в гепаринизиро-ванные пробирки, плазму отделяли центрифугированием 20 мин. при 1500g. Осадок эритроцитов суспендировали в 10 объемах 0,85% NaCl, и вновь центрифугировали. Эту процедуру повторяли дважды для удаления следов плазмы и др. форменных элементов крови. Отмытые эритроциты суспендировали в физиологическом растворе. Конечная концентрация эритроцитов в среде составила 2,8-3,0х1012 . В пробирки, содержащие 1,2 мл суспензии эритроцитов, вводили: 1 группа - контроль - раствор Хенкса, применяемый для разведения вируса, физраствор (для разведения ФМК), инкубировали 10 минут при комнатной температуре; 2 группа - добавляли 50 ЦП (цитопатических) доз вируса Коксаки А-18 и физиологический раствор, инкубировали 10 мин.; 3 группа - вводили 50 ЦП доз вируса Коксаки А-18, инкубировали 10 мин, затем вносили 0,5% раствор ФМК; 4 группа - вносили сначала раствор ФМК и после инкубации - вирус; 5 группа - 0,5% ФМК и раствор Хенкса, инкубировали 10 мин.
Последующая инкубация продолжалась 50 минут при 37о С. Затем часть (0,4 мл) суспензии клеток подвергалась прогреванию в течение 30 минут при 56о С для инактивации вируса. В этих клетках исследовалось содержание свободного внутриклеточного Mg, содержание общих липидов и общих фосфолипидов с помощью стандартных наборов реактивов фирмы Ла Хема.
В оставшейся части клеток (0,8 мл) определялась активность АТФ-аз. Одновременно исследовалось влияние L-аргинина, добавляемого на этом этапе к среде инкубации эритроцитов. В среду инкубации вводили 0,1 мл L-аргинина (в концентрации 100 мкмоль/л, так что конечная концентрация его составила 10 мкмоль/л), в контрольную пробу добавляли равный объем физраствора. Время инкубации эритроцитов для определения
**ГУ НИИ педиатрии Научного центра здоровья детей РАМН Институт Фармацевтических реактивов «РЕФАРМ», Москва
