CC BY
84
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ п аразитология ♦
УДК 616.002.9
К технологии наработки антигена Echinococcus multicolaris
О.Н. Андреянов, доктор ветеринарных наук (1980oleg@mail.ru), В.К. Бережко, доктор биологических наук, А.А. Хайдарова, кандидат биологических наук, О.В. Руднева, кандидат биологических наук, О.Г. Тимофеева Гэсударственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений им. К.И. Скрябина» (Москва).
Изучены инвазионные свойства возбудителя E. multilocularis (азиатского генотипа), циркулирующего в Центральном регионе России. Исследованы дозы для заражения онкосферами и протосколексами гельминта для получения ларвоцисты. Для получения биомассы личиночного антигена рационально использовать мышей при инвазировании онкосферами (доза 2500) и белых крыс при инвазировании протосколексами (доза 1000). Средняя масса ларвоцист, полученных у мышей, составляет 18,4 г, у крыс 21,7 г.
Ключевые слова: биомасса, доза, инвазия, лабораторные животные, ларвоциста, онкосфера, протоско-лекс, E. multilocularis
Введение
Альвеолярный эхинококкоз (гидатидоз), наряду с бешенством, болезнью Кройцфельда-Якоба и другими, относится к особо опасным заболеваниям человека из-за симптоматической тяжести течения и высокой смертности [5, 6]. Такой статус инвазии в медицине стимулирует проведение научно-исследовательских работ по усовершенствованию диагностических мероприятий, индуцирует разработку системы мер борьбы и профилактики. С момента инвазирования до постановки диагноза может пройти от 5 до 20 лет (продолжительность инкубационного периода). В литературе описан случай, когда латентный период эхинококковой цисты человека составлял 75 лет [2].
Возбудитель альвеолярного гидатидоза — половозрелая цестода Echinococcus multilocularis, которая паразитирует чаще в кишечнике диких плотоядных [1]. Промежуточные хозяева гельминта — человек и большое число видов микромаммалий (грызуны, насекомоядные животные). Волки, лисицы, енотовидные собаки инвазируются, поедая грызунов с эхинококковыми цистами. Содержащиеся в цисте зародышевые элементы (ацефалоцисты, метоцисты с протосколексами) частично перевариваются в желудочном соке и прикрепляются к стенке тонкой кишки хищника, где вырастают во взрослых цес-тод (цепней) размером 1,5...3 мм. Последние чле-
ники цестоды (третий или четвертый), содержащие яйца с онкосферами (150.300), отрываются от стробилы гельминта и с фекалиями плотоядных животных загрязняют яйцами (онкосферами) траву, ягоды, грибы, почву, шкуру самого плотоядного. Посредством трофических связей онкосферы попадают в кишечник промежуточных хозяев, их оболочки растворяются под действием желудочного сока. Высвободившиеся личинки гельминта пробуравливают слизистую оболочку кишечника и через систему воротной вены попадают в печень, реже в легкие и другие органы, где развиваются в зрелую цисту (ларвоцисту).
Диагностика ларвального альвеококкоза нередко представляет собой трудную задачу, что связано с бессимптомным течением заболевания, особенно в раннем периоде его развития. Иммунологические методы в диагностике альвеолярного гидатидоза имеют большое, зачастую решающее значение. Наиболее информативными в последние годы считают реакции латексагглю-тинации, непрямой гемагглютинации, иммуноферме-нтный анализ. Они практически не имеют противопоказаний и применимы для выявления паразита. Научные достижения последних лет кардинально изменили требования к диагностике альвеолярного ги-датидоза, в том числе и к серологическому тестированию больных.
В большинстве случаев для серологических диагнос-тикумов необходимо наличие значительного объема биомассы гельминтного антигена (чаще личиночной формы). Чтобы получить антиген возбудителя E. mul-tilocularis, требуется сложный путь его наработки в ус-
1. Результат инвазирования лабораторных животных путем перорального введения онкосфер возбудителя E. multilocularis
Вид животного Доза онкосфер, экз. Число животных в опыте Результат инвазирования
Мышь 1250 14 Через 3 месяца у трех мышей обнаружены в печени единичные (10...24) ларвоцисты диаметром 1...1,5 мм без инвазионных элементов
лабораторная 2500 17 Отмечена частичная гибель мышей с 28-е по 51-е сутки с наличием незрелых ларвоцист. У погибших животных на 71-й и далее этого срока многочисленные ларвоцисты диаметром 1,5.. .12 мм зарегистрированы в печени с наличием протосколексов
Крысы 2500 8 Через 3 месяца выявлено, что крысы не инвазированы. Во внутренних органах и в брюшной полости ларвоцисты не обнаружены
белые Vistar 5000 9 Заразилось 2 животных, обнаружены у них ларвоцисты диаметром до 2 мм, зародышевые элементы отсутствуют
Кролики Советская шиншилла 8500 2 У одного кролика на 87-е сутки регистрировали в брюшной полости и в печени многочисленные ларвоцисты эхинококка с зародышевыми элементами. Второе животное пало на 12-е сутки без видимых развитых паразитарных узлов
17000 2 Животные пали на 21-е и 51-е сутки после инвазирования. В печени присутствуют лаврвоцисты 14 и 29 штук диаметром 1,5.2 мм без зародышевых элементов
К технологии наработки антигена Echinococcus multicolaris
Рис. 1. Цестоды E. multilocularis из кишечника лисицы, ок. 10, об. 8
Рис. 2. Раздавленная мешковидная матка с яйцами, выделенная из последнего членника половозрелого гельминта, ок. 20, об. 8
Рис. 4. Ларвоцисты E. multilocularis печени крысы (возраст 3 месяца)
Рис. 5. Протосколексы альвеококка, ок. 20, об. 8
Рис. 3. Лабораторная мышь через 3 месяца после инвазирования онкосферами E. multilocularis: а — экспериментальный альвеолярный гидати-доз при жизни, б — альвеолярная циста печени после усыпления животного, возраст 3 мес
ловиях лаборатории [3, 4, 8]. Наработка антигена включает в себя усыпление и вскрытие животных — доноров ларвоцист, получение ларвоцист и их очистку от тканей хозяина, измельчение, отжимание личиночной массы через нейлоновое сито, получение жидкой фракции, ее осаждение, смешивание осадка с антибиотиком, введение взвеси с протосколексами внутри-брюшинно или подкожно лабораторным животным, содержание экспонированных животных.
Цель исследования
Получить из имагинальной стадии гельминта возбудителя E. multilocularis (азиатский генотип), циркулирующего в настоящее время у диких плотоядных животных Центрального региона России, ларвоцисту и отработать технологию наработки инвазионного материала альвеолярного гидатидоза в условиях лаборатории [7].
Материалы и методы
Для изучения некоторых биологических свойств и технологии наработки ларвальной стадии паразита были подвергнуты исследованию половозрелые цестоды E. multilocularis. Цепни (цестоды) альвео-кокка были выделены из тонкого отдела кишечника тушек обыкновенных лисиц (Vulpes vulpes), отстреленных в условиях охотхозяйства Рязанской области Касимовского района в период проведения сезонной лицензионной охоты 2014-2015 гг. При полном гельминтологическом исследовании по К.И. Скрябину (1928) было получено около 60 тыс. половозрелых гельминтов со жизнеспособными онкосферами (рис. 1, 2).
Цисты из печени и легких лабораторных животных препарировали анатомическим пинцетом, глазными ножницами измельчали личинок и освобождали про-
тосколексы из метацист (рис. 3.. .5). Мельничным газом №033 проводили отжим личинок. Протосколексы аль-веококков отмывали, осаждали и фильтровали в стерильном физиологическом растворе. Лабораторных грызунов заражали перорально через металлический зонд и внутрибрюшинно инъекционно с использованием многоразового шприца на 2,0 мл. Онкосферы из последнего членика гельминта подсчитывали на предметном стекле после осветления в 50%-м водном растворе молочной кислоты.
Дозу инвазирования онкосферами гельминта лабораторных грызунов рассчитывали по среднему числу онкосфер, содержащихся в матке 25 цестод. Прото-сколексы альвеококка подсчитывали в камере Мига-чевой-Котельникова (1976), а жизнеспособность проверяли при температуре 38±2 оС в течение 5.10 мин. Микроскопию инвазионных элементов, микро- и фотографирование проводили с помощью медицинского микровизора типа «mVizo 100» и цифрового фотоаппарата «Sony Cyber-shot DSC-W810».
Результаты
Зрелые ларвоцисты возбудителя E. multilocularis из онкосфер цестоды были получены у лаборатор-
2. Результат инвазирования лабораторных животных путем внутрибрюшинного введения протосколексов возбудителя E. multilocularis
Пассирование личиночной стадии E.multilocularis Возраст личинок, Доза, экз., протосколексов гельминта Число животных в опыте Результат инвазирования через 3 мес
Донор Реципиент
Мышь 71 3 +
лабораторная Крысы белые Vistar 92 1000±50 3 +
Кролик Советская шиншилла 96 3 +
87 3 +
Примечание: + — развились ларвоцисты с жизнеспособными протосколексами.
О.Н. Андреянов, В.К. Бережко, А.А. Хайдарова, О.В. Руднева, О.Г. Тимофеева
ных мышей и кроликов при заданных дозах 2500 и 8500 на 3-й месяц опыта (табл. 1). В остальных вариантах инвазирования животных отмечена гибель хозяев или наличие личинок у хозяев без видимых инвазионных элементов гельминта. Инвазионные дозы 1250 онкосфер альвеококка для лабораторных мышей и 2500 для белых крыс не воспроизвели полноценные личинки гельминта. Доза 17000 онкосфер альвеококка для кроликов породы Советская шиншилла оказалась летальной, гибель животных произошла на стадии развития личинки (на 21-е и 51-е сутки опыта). При первичном пассировании полученных личинок из онкосфер альвеококка от животных-доноров (мышь, кролик) к животным-реципиентам (белым крысам Vistar) личиночная форма возбудителя альвеококка проявилась при введении 1000 протосколексов внутрибрюшинно через 3 месяца (табл. 2). Личинки имели полноценно развитые и жизнеспособные протосколексы, размер ларвоцист составлял от 0,5 до 4,8 см в диаметре.
При определении наработанного биологического материала личинок альвеококка, полученных из он-косфер мультилокулярного эхинококка, оказалось, что ларвоцисты лабораторных мышей к 3-му месяцу после инвазирования имели среднюю массу 18,4±2,7 г, а ларвоциста кролика всего 11,3 г. Исследования при заражении белых крыс протосколексами альвеолярного эхинококка дали следующие результаты. Ларвоцис-ты, полученные через 3 месяца от этой лабораторной модели, имели массу 21,7±2,1 г
Таким образом, для наработки антигена в виде личиночной биомассы возбудителя альвеококкоза (азиатского генотипа) рационально использовать онко-сферы цепня при заражении лабораторных мышей или протосколексы ларвоцисты при заражении белых крыс Vistar.
Заключение
При исследовании инвазионных биологических свойств альвеолярного эхинококка было выявлено, что лабораторные мыши, крысы и кролики восприимчивы к изоляту азиатского генотипа возбудителя E. multilocularis, выделенного от обыкновенных лисиц и циркулирующего в настоящее время на территории Центрального региона России. Полноценные ларвоцисты альвеолярного эхинококка с наличием жизнеспособных протосколексов были получены у лабораторных мышей и кроликов породы Советская шиншилла при заданных дозах 2500 и 8500 он-косфер, соответственно. При первичном пассировании протосколексов альволярного гидатидоза в такой лабораторной модели, как белая крыса (внутрибрю-шинная инъекция в дозе 1000±50 экз.) полноценные личинки созревают через 3 месяца после инъекции. Для наработки личиночного антигена альвеолярного эхинококка в экспериментах следует использовать лабораторных мышей при инвазировании их ооцис-тами цепня и белых крыс при инвазировании прото-сколексами. Средняя масса ларвоцист, полученных у лабораторных мышей, составляет 18,4±2,7 г, а у белых крыс 21,7±2,1 г через 3 и более месяца после заражения.
Библиография
1. Андреянов, О.Н. Зараженность диких плотоядных животных Echinococcus multilocularis в Рязанской области / О.Н. Андреянов // Ветеринария. — 2012. — №6. — C. 37-38.
2. Ветшев, П.С. Эхинококкоз: современное состояние проблемы / П.С. Вет-шев, Г.Х. Мусаев, С.В. Бруслик // Украинский журнал хирургии. — 2013. — №3 (33). — C. 196-201.
3. Бережко, В.К. Методика идентификации «клеточных» антигенов эхинококков / / В.К. Бережко, О.В. Руднева // Тр. Всес. ин-та гельмин-тол. —2006. — Т. 42.— С. 389-396.
4. Бережко, В.К. Диагностические свойства антигенов клеточной культуры Echinococcus multilocularis / В.К. Бережко, О.В. Руднева // Материалы докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями». — 2003. — Вып. 4. — C. 76-78.
5. Гузеева, Т.М. Актуальные проблемы малярии и других пара-зитозов человека (Роспотребнадзор РФ). Научный доклад материалов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» / Т.М. Гузеева. — Москва, 2015. — С. 54-58.
6. Коваленко, Ф.П. Заболеваемость гидатидозами (цистным и альвеолярным) населения и сельскохозяйственных животных в Российской Федерации в 1989-2002 гг. / Ф.П. Коваленко, Н.И. Пер-чун, Н.Н. Дарченкова, В.Б. Ястреб, А.С. Бессонов, Е.А. Черникова, Ю.А. Легонкова, Г.Х. Мусаев, Г.А. Шатверян, Л.М. Гудовский,
B.Б. Паршин, О.Н. Андреянов // Труды Всероссийского научно-исследовательского института гельминтологии им. К.И. Скрябина. — 2006. — Т. 41. — C. 192-211.
7. Konyaev, S. Genetic diversity of Echinococcus spp. in Russia / S. Konyaev, T. Yanagida, M. Nakao, G. M. Ingovatova, et al. // Parasitology. — 2013. — No. 140. — P. 1637-1647.
8. Кротов, А.И. Методы моделирования ларвального гидатидозно-го эхинококка // Эхинококкозы. Методы исследования, лечения, профилактики / А.И. Кротов, Ф.П. Коваленко. — М.: Колос, 1990. —
C. 215-221.
9. Мигачева, Л.Д. Рекламации Госагропрома СССР по внедрению достижений науки и практики в производство / Л.Д. Мигачева, Г.А. Котельников // Труды ВИГИС. — 1987. — № 6. — С. 85-87.
10. Скрябин, К.И. Метод полных гельминтологических вскрытий позвоночных, включая человека / К.И. Скрябин. — М.: Изд-во МГУ, 1928. — 45 с.
SUMMARY
O.N. Andreyanov, V.K. Berezhko, A.A. Haydarova, O.V. Rudneva, O. G. Timofeeva
The All-Russian Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants named after K.I. Scriabin (Moscow).
To Technology of the Operating Time of Echinococcus multicolaris Antigen. Invasive properties of the activator E. multilocularis (An Asian genotype) circulating in the Central region of Russia are studied. Doses for infection with eggs and protoscolexes of helminth for receiving cistis larva are investigated. For receiving biomass of a larval anti-gene it is rational to use mice at an invazirovaniye eggs (a dose 2500) and white rats at a protoscolexes invazions (a dose 1000). Average weight a cistic larva received at mice makes 18,4 g, and at rats of 21,7 g.
Keywords: biomass, dose, invazion, laboratory animals, cistic larva, oncosphere, protoscolex, E. multilocularis.
