CC BY
10
Е. И. Соловьева
К методике определения общего содержания витамина
В! в молоке
Из Государственной контрольной витаминной станции Министерства здравоохранения
СССР
Проведению количественной оценки Bi-витаминной активности молока, как и ряда других пищевых продуктов, препятствует отсутствие сколько-нибудь удовлетворительного химического метода определения связанной формы витамина Bi. В литературе имеются указания, что витамин Bi в молоке содержится не только в свободном виде, но и в форме пирофосфорных соединений тиамина.
Химический (тиохромный) метод определения связанного витамина Bi основан, как известно, на реакции ферментативного гидролиза пиро-фосфата тиамина специальными фосфатазами. В Советском Союзе в качестве такого рода фосфатаз пытались применять специальным образом обработанные дрожжевые вытяжки, но последние оказались мало пригодными ввиду их нестойкости. Поволоцкая (1947) рекомендует применять для этой цели высушенные мицелии пенициллиума. Эти препараты в ряде случаев давали хорошие результаты, но в других случаях пленки из плесени пенициллиума не обнаружили должной активности.
За рубежом в качестве источников фосфатаз применяется ряд патентованных препаратов (клараза, полидаза, милаза), способ изготовления которых является секретом фирм.
В серии опытов по энзиматическому расщеплению пирофосфата тиамина прокипяченных дрожжевых экстрактов мы установили, что пре-ператы из плесеней Aspergillus (oryzae, niger) обладают большой фос-фатазной активностью, которая при сравнении с кларазой оказалась не ниже последней
Плесени Aspergillus в спиртовой промышленности выращиваются в больших количествах в целях изготовления из них амилазы — фермента, употребляемого в технологическом процессе производства спирта; поэтому массовое получение этого продукта для витаминологического анализа является вполне реальным.
При разработке методики определения общего витамина Bi молока мы применяли препараты из плесеней Aspergillus niger, активность которых предварительно была проверена на прокипяченных дрожжевых экстрактах.
Поскольку известно, что в живых организмах пирофосфат тиамина является активной группой ферментов (что указывает на существование связей тиамина с белками), нам представлялось целесообразным, наряду с фосфатазным, проводить также протеолитический гидролиз, тем более что в литературе нам встретилась работа, в которой автор, проводя сравнительную проверку пепсинового и фосфатазного гидролиза связанного витамина В! молока, наблюдал освобождение тиамина также и при пепсиновом гидролизе.
Для установления целесообразности применения того или иного вида гидролиза при освобождении витамина Bi из связанного состояния нами была проведена специальная серия опытов по сравнительной проверке гидролиза пепсинового, фосфатазного и комбинированного (последовательный гидролиз пепсином и фосфатазами).
Опыты сводились к следующему. Брались 4 колбы с 30 мл молока, жир которого был удален центрифугированием. Пробы подкислялись
1 Препараты из плесеней Aspergillus были нам любезно предоставлены зав. Энзи-матической лабораторией Всесоюзного института спиртовой промышленности Министерства пищевой промышленности СССР Р. В. Фениксовой.
крепкой соляной кислотой до рН=1,5—2,0. В первую и третью колбу добавлялось по 50 мг пепсина, растертого в 10 мл 0,2% соляной кислоты, а во вторую и четвертую колбу — то же количество пепсина, растертого в той же кислоте, но предварительно прокипяченного. Все пробы ставились в термостат на 4 часа при 45°. По истечении этого времени пробы извлекались из термостата, содержимое их нейтрализовалось концентрированным раствором соды до рН = 3,5—4,0. В первую и вторую колбу прибавлялось по 50 мг препарата Aspergillus niger, растертую в 7 мл ацетатного буфера (рН = 3,6), а в третью и четвертую колбу добавлялся тот же препарат, но предварительно прокипяченный. Ко всем пробам добавлялся толуол, после чего они ставились в термостат на 16 часов (на ночь).
Утром пробы кипятились с обратным воздушным холодильником для инактивации ферментов, переводились в мерные колбы на 50 мл, доводились водой до метки и фильтровались. В фильтрате производилось определение витамина Bi тиохромным методом (тиохром извлекался бутиловым спиртом). Интенсивность флюоресценции измерялась на аппарате Шипалова в реконструкции Государственной контрольной витаминной станции.
При такой постановке опытов молоко в первой колбе подвергалось последовательному энзиматическому гидролизу пепсином и ферментами Aspegrillus; во второй — воздействию только ферментов Aspergillus (пепсин был инактивирован кипячением); в третьей активен был только пепсин; в четвертой колбе прибавленные ферменты были инактивирова-ны, и молоко могло подвергаться воздействию только собственных ферментов при условии, если специфика данных сред удовлетворяла их природным свойствам.
Данные опытов представлены в таблице, из которой видно, что максимальное содержание витамина Bi в молоке обнаруживалось в тех случаях, когда молоко подвергалось двойной ферментной обработке. При гидролизе только пепсином или одними ферментами Aspergillus niger содержание витамина В| было значдтельно ниже; наиболее низкие величины витамина В! были получены в том случае, когда оба фермента были инактивированы кипячением. Так, при комбинированном гидролизе содержание витамина Bi в большинстве проб составляло около 60 т на 100 мл молока (максимальная величина 103 у, минимальная — 40 у). При гидролизе одним пепсином или одним препаратом плесени Aspergillus содержание витамина Bi в соответствующих пробах равнялось в среднем около 40 т % (максимальная величина 66—60 г %, минимальная 20—25 у %). Наконец, в пробах с инактивированными ферментами содержание витамина Bi в большом числе проб составляло всего около 25у % (максимальная 40 7 %, минимальная 17 у %).
Таким образом, для определения общего витамина Bi в молоке мы считаем необходимым подвергать молоко последовательному пепсиновому и фосфатазному гидролизу; при проведении такого рода процедур удается обнаружить приблизительно вдвое больше витамина Вь чем в пробах без гидролиза. Необходимо также отметить, что в результате двойной энзиматической обработки молока получаются совершенно прозрачные фильтраты, что чрезвычайно существенно для проведения анализа на витамин Bi. Однако, несмотря на то, что при комбинированном энзиматическом гидролизе удается обнаружить наибольшие величины тиамина в молоке, не исключена возможность, что все же в процессе ферментативной обработки некоторая часть витамина теряется, так как препараты из плесеней Aspergillus могут содержать какие-либо ферменты типа тиаминаз, разрушающие молекулу тиамина.
Для выяснения этого вопроса нами была проведена серия опытов, в которой к каждой пробе молока добавлялся раствор синтетического тиамина (20 7 или 30 у), после чего одна половина проб подвергалась
воздействию пепсина и фосфатаз плесеней Aspergillus niger, другая же выдерживалась в термостате тот же срок с инактивированными ферментами. По истечении определенного времени (4 часа с пепсином и 16 часов с препаратами фосфатазы) пробы кипятились с обратным холодильником для инактивации ферментов, переводились в мерные колбы, доводились водой до метки и фильтровались. В фильтрате определялось содержание свободного витамина Вь
Действие ферментных препаратов на энзиматический гидролиз связанного витамина В] молока
Порядковый № опыта Гидролиз пепсином и препаратом Aspergillus Гидролиз препаратом Aspergillus Гидролиз пепсином Ферменты инактиви-рованы
содержание витамина В] в y на 100 мл молока
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 40 40 46 103 75 60 63 57 63 53 33 33 35 66 46 40 43 40 53 26,5 35 20 35 60 53 43 46 43 47 50 17 23 20 20 32 26 30 33 40 26,5
Проведенные опыты показали, что процент обратного нахождения тиамина как в пробах, подвергшихся гидролизу, так и в пробах с инактивированными ферментами приблизительно один и тот же. Так, из 10 опытов для проб с инактивированными ферментами процент обратного нахождения тиамина колебался в пределах + 10 ив большинстве случаев были даже еще меньше (+5). Для проб молока, подвергавшихся комбинированному гидролизу, из тех же 10 опытов всего только один случай вышел за пределы ±10 (—14%), большее же число случаев также находилось в пределах +5.
Таким образом, проведенная серия опытов с прибавлением синтетического витамина В! не дает оснований говорить о каком-либо разрушающем действии комбинированного гидролиза на молекулу тиамина.
Приведенные материалы послужили основой для составления методической прописи по определению общего витамина Bt в молоке, которая приводится ниже.
1. Молоко, освобожденное от жира, тщательно взбалтывают и наливают в две конические колбы по 30 мл в каждую.
2. Обе пробы подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН = 1,5—2,0 (для коровьего молока 0,3—0,4 мл концентрированной соляной кислоты).
3. На аналитических весах отвешивают две навески пепсина по 50 мг и растирают каждую из них в фарфоровых ступках с 10 мл 0,2% соляной кислоты.
4. Растертый в растворе соляной кислоты пепсин приливают к пробам молока и ставят колбы в термостат для инкубации на 3—4 часа при 45°.
5. По истечении этого времени пробы извлекают из термостата и нейтрализуют насыщенным раствором питьевой соды до рН=3,5—4,0.
6. На аналитических весах отвешивают две навески по 50 мт препарата плесени Aspergillus. Навески растирают в фарфоровых ступках
с 7 мл ацетатного буфера (рН около 3,6). Растертый препарат присоединяют к пробам с пепсиновым гидролизатом молока, добавляют по 0,5 мл толуола и ставят колбы в термостат при 45° на ночь (на 16 часов).
7. Колбы извлекают из термостата, кипятят в течение 10 минут с обратным холодильником для инактивации ферментов, остужают, переводят в мерные колбы на 50 мл, доводят водой до метки и фильтруют (фильтры предварительно промывают горячей водой).
8. В фильтрате производят определение свободного витамина В1 тиохромным методом. Интенсивность флюоресценции измеряют на флюо-рометре.
Таким образом производят определение общего витамина В| в продукте; в случае необходимости установить содержание связанного витамина В1 его определяют по разнице между общим содержанием витамина В| и содержанием его в пробах, не подвергавшихся энзиматиче-скому гидролизу.
-й- т*
С. М.Тромбах
Из истории школьной гигиены в России в XVIII веке
Из отдела гигиены Центрального научно-исследовательского педиатрического института Министерства здравоохранения РСФСР
В русской медицинской и педагогической литературе XVIII века значительное внимание было уделено гигиене детей. Интерес этот отнюдь не случаен. Он был обусловлен совершенно конкретными причинами.
Забота о повышении производительности крепостного хозяйства заставляла помещиков беспокоиться о большей численности крестьянского населения. Властно требовала рабочих рук и развивавшаяся в то время мануфактурная промышленность. Нельзя забывать также о непрерывных войнах, вызывавших потребность в большой армии. Стране нужны были люди. Проблема «размножения и сохранения российского народа», как сформулировал ее М. В. Ломоносов, приобретала первостепенное государственное значение.
Между тем в России того времени смертность, особенно детская, была очень высокой. Поэтому основное внимание было, естественно, направлено на борьбу за жизнь и здоровье детей. Этому вопросу посвящены многие книги и сгатьи врачей С. Г. Зыбелина, Н. М. Максимови-ча-Амбодика, С. Ели и др., педагога И. И. Бецкого и выдающегося русского просветителя Н. И. Новикова.
Основным средством сохранения здоровья детей считали правильное их физическое воспитание, и большинство высказываний русских врачей касалось этого вопроса. Мы остановимся на том, как решались вопросы физического воспитания детей дошкольного и школьного возраста.
По мнению большинства русских авторов XVIII века, дети старше 3 лет уже приобрели известную «телесную крепость», и задача физического воспитания заключалась в том, чтобы эту «крепость» усилить. Одним из средств является привычка «сносить жар и стужу, ветер и сырую погоду» не бояться смен погоды и температурных колебаний. Следует избегать слишком теплой одежды и чрезмерной теплоты в помещениях. Этот взгляд последовательно проводил С. Г. Зыбелин. В своей речи «О вреде, проистекающем от содержания себя в теплоте излишней» (1773), он подробно останавливался на вредном, расслабляющем действии чрезмерно высокой температуры в комнатах. Особенно вреден
1 Детское чтение для сердца и разума, ч. VII, 1786.
