CC BY
87
Химия растительного сырья. 2002. №4. С. 29-33
УДК 577.1
ДЕЙСТВИЕ ТЕРПЕНОИДОВ НА ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ГРИБОВ-ДЕСТРУКТОРОВ ПРОМЫШЛЕННЫХ МАТЕРИАЛОВ
© В. Ф. Смирнов1, Д.А. Кузьмин1, О.Н. Смирнова1, А.Н. Трофимов2
1 Нижегородский государственный университет, пр. Гагарина, 23, Нижний Новгород, 603950, (Россия)
2Государственное унитарное предприятие «Центральный научно-исследовательский и проектный институт лесохимической промышленности», Московское шоссе, 85, ГСП-703, Нижний Новгород, 603603 (Россия) e-mail: tsnilkhi@ncom.ru
Определены фунгицидные свойства лесохимических продуктов при воздействии на 14 видов микроскопических грибов в среде Чапека-Докса, интенсивность дыхания грибов измеряли полярографическим методом с закрытым электродом Кларка. В качестве наиболее активных продуктов определены а-терпинеол и сульфатный скипидар.
Введение
Лесохимические продукты нашли широкий спрос во многих отраслях промышленности. Расширяются исследования биологических свойств компонентов скипидара, смоляных и жирных кислот, экстрактов коры различных деревьев. Известны антимикробные свойства многих компонентов лесохимических продуктов. Системные исследования в этом плане отсутствуют, хотя рассмотрение возможности создания антисептиков, фунгицидов, дезинфектантов представляет значительный интерес. Нередко синергетический эффект за счет лесохимических продуктов превосходит всякие ожидания [1]. Кроме того, в связи с широкими адаптационными возможностями микроорганизмов существует проблема постоянного обновления и поиска новых высокоэффективных биоцидных препаратов [2].
В качестве антимикробных препаратов широко используются продукты лесной химии. Имеющиеся сведения о биологической активности нативных терпеноидов, а также синтетических продуктов на их основе позволяют предположить, что эти продукты могут использоваться в качестве биоцидных соединений, находящих широкое применение в ветеринарии, медицине, технической микробиологии [2].
Большое количество работ посвящено исследованию бактерицидной, фитонцидной, реппелентной, инсектицидной активности терпенов, но мало внимания уделено изучению влияния терпенов на рост микроскопических грибов - деструкторов различных промышленных материалов. Также недостаточно исследованы биоцидные свойства отдельных терпенов и их бинарных смесей [3]. Целенаправленный и планомерный подбор высокоэффективных компонентов, обладающих высокой биоцидной активностью, может быть осуществлен только на базе широких исследований механизма действия соединений на метаболизм живых организмов.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Целью данной работы являлось исследование фунгицидной активности монотерпенов, выявление активных биоцидов лесохимических продуктов и исследование их влияния на метаболическую активность микроскопических грибов. В данной работе был осуществлен скрининг 17 соединений, а именно: камфена, миристиновой кислоты, камфары, абиетиновой кислоты, метилового эфира линленовой кислоты, суммарного экстракта ели, суммарных липидов ОП-11 лиственницы, кислородсодержащих дитерпенов, камфена оптически активного, сесквитерпенновых кислородсодержащих соединений, дипентена, п-цимола, скипидара сульфатного, борнилацетата, Д3-карена, а-терпинеола, а- пинена, Д3-карена + дипентена на предмет обнаружения фунгицидных свойств.
Экспериментальная часть
В качестве тест-культур грибов использовались следующие 14 видов микромицетов, являющихся активными биодеструкторами различных промышленных материалов, как природного так и синтетического происхождения: Asprgillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Alternaria alternata, Fusarium moniliforme, Penicilium martensii, Penicillium chrysogenum, Penicillium funiculosum, Penicillium cyclopium, Penicillium ochro-chloron, Penicillium brevi-compactum, Trichoderma viridae, Chaetomium globosum, Paecilomyces variotii. Культуры грибов были представлены Всероссийской коллекцией микроорганизмов (г. Пущино).
Фунгицидные свойства определяли с использованием чистых веществ на чашках Петри, двумя вариантами: пропитывая веществом бумажные диски и помещая в лунки на агаризованной среде Чапека-Докса. О наличии фунгицидных свойств судили по появлению зоны ингибирования роста тест-грибов.
В качестве объектов исследования фосфатазной активности были выбраны следующие микроскопические грибы: Alternaria alternata и Penicillium chrysogenum, которые наиболее подвержены действию а-терпинеола. Культуры плесневых грибов выращивали на жидкой питательной среде Чапека-Докса, при встряхивании на качалке со скоростью 150 об/мин в течение 7 суток при t = 23 ±3 °С. Затем мицелий отфильтровывали и использовали при определении активности эндогенной кислой и щелочной фосфатаз. Фосфатазную активность определяли по модифицированному методу Калашниковой и Родзевич. [4].
Также определяли влияние фунгицидов на интенсивность дыхания и кислотобразование гриба
Penicillium chrysogenum.
Интенсивности дыхания определяли полярографическим методом с закрытым электродом Кларка. Измерения проводили после 10-минутной экспозиции биоцидом в среде инкубации гриба в интегральной ячейке объемом 1мл. Обработку NaF проводили при концентрации его 10-3 моль/л. После обработки NaF на грибы воздействовали биоцидом.
Органические кислоты определяли методом газожидкостной хроматографии на хроматографе с пламенно-ионизационным детектором на хроматоне N-AW-DMCS зернением 0,2-0,25 мм в культуральной жидкости после 14 суток инкубации.
В коническую колбу объемом 100 см3 помещали 25 см3 анализируемой пробы и 25 см3 спирта. Затем к содержимому в колбе прибавляли 10-12 мг адипиновой кислоты. Полученный раствор титровали гидроокисью тетраметиламмония (ТМА) в присутствии фенолфталеина до ярко розовой окраски, после чего прибавляли еще 2-3 капли ТМА. [5].
Водно-спиртовой раствор солей переносили в делительную воронку, приливали 50 см3 бензола и смесь перемешивали в течение 2 мин. Нижний водно-спиртовой слой отделяли, переносили в коническую колбу и отгоняли водно-спиртовую смесь на кипящей водяной бане. К остатку в колбе приливали 20-25 см3 спирта и содержимое колбы нагревали на водяной бане с обратным холодильником в течение часа. Затем полученный экстракт (спиртовой раствор) переносили в фарфоровую чашку и упаривали до сиропообразного состояния.
Дикарбоновые кислоты анализировали в виде метиловых эфиров. Метиловые эфиры получали путем обработки их ТМА с последующим термораспадом солей тетраметиламмония в испарителе хроматографа при температуре 260-280°С. Для этого использовали газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором при следующих условиях: длина колонки - 3,7 м; внутренний диаметр - 3 мм; сорбент - 15% полифенилметилсиликонового масла ПФМС-4 на хроматоне N-AW-DMCS зернением 0,2-0,25 мм;
температурный режим - программирование температуры колонки от 100 до 170°С со скоростью 3°С/мин; температура испарителя - 270°С; температура детектора - 170°С; расход газа-носителя азота - 60 см3 /мин; расход водорода - 30 см3 /мин; расход воздуха - 300 см3 /мин; объем пробы - 1 - 5 мкл.
Кислоты идентифицировали путем добавления индивидуальных соединений к анализируемой смеси. Количественное определение проводили методом внутреннего стандарта с введением градуировочных коэффициентов. В качестве стандарта использовали адипиновую кислоту. Градуировочные коэффициенты определяли по искусственным смесям, составленным из анализируемых соединений и стандарта. В анализируемой смеси были определены следующие кислоты: щавелевая, яблочная и фумаровая, янтарная, кето-глутаровая, лимонная. Яблочная и фумаровая кислоты не были разделены. Лимонная кислота выходит двумя пиками. Определение проводили при участии группы аналитического обеспечения ФГУП «ЦНИЛХИ».
Результаты и их обсуждение
Нами установлено, что наибольшим фунгицидным эффектом на используемые тест-культуры обладали а-терпинеол и сульфатный скипидар. Показано, а-терпинеол оказывал фунгицидное (ингибирующее) действие на рост всех 14 видов грибов, тогда как сульфатный скипидар - на А. niger, Р. chrysogenum, А. огу2ае. Далее нами была определена минимальная фунгицидная концентрация (МФК) указанных соединений (табл. 1).
Большое значение в метаболизме грибов играют фосфатазы. Известно, что фосфатазы микроскопических грибов играют важную роль в жизнедеятельности [6]. Ряд авторов считает, что данные ферменты играют важную роль в формировании адаптационных механизмов у грибов при действии на последние различных экстремальных факторов [7]. Для выяснения механизмов действия соединений, показывающих максимальную фунгицидную активность, мы определяли изменение фосфатазной активности грибов при действии на них биоцидных препаратов. Полученные данные представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 1. Минимальная фунгицидная концентрация лесохимических продуктов, % масс.
Вид гриба а-терпинеол Сульфатный скипидар
Penicillium chrysogenum >1,0 >5,0
Aspergillus niger >1,0 >5,0
Aspergillus oryzae >1,0 >5,0
Alternaria alternata >1,0 -
Таблица 2. Активность эндо- и экзофосфатаз (мкмоль-Рн-мг белка 1 -час гриба Pénicillium chrysogenum
в присутствии а-терпинеола
Форма фермента рН Экзоформа Экзоформа + а-терпинеол % ингибирования Эндоформа Экзоформа + а-терпинеол % ингибирования
4,5 23,27 35,58 -50,3 178,27 127,33 28,6
7,0 61,67 43,88 29,0 169,78 63,67 62,5
Таблица 3. Активность эндо- и экзофосфатаз (мкмоль-Рн-мг белка 1 -час -1) гриба Alternaria alternata
в присутствии а-терпинеола
Форма фермента рН Экзоформа Экзоформа + а-терпинеол % ингибирования Эндоформа Экзоформа + а-терпинеол % ингибирования
4,5 118,59 161,29 -36,0 146,66 48,87 66,4
7,0 237,19 161,29 32,1 90,42 3,17 96,5
Из таблиц видно, что а-терпинеол вызывает значительное ингибирование нейтральных экзо- и эндофосфатаз у обоих исследуемых видов грибов. В наибольшей степени ингибирующее действие этого вещества проявляется на нейтральную эндофосфатазу, особенно у Alternaria alternata (ингибирование составляет более 96%). а-терпинеол вызывает ингибирование и кислых эндофосфатаз исследуемых грибов и, также как и в предыдущем случае, действие фунгицида на ферменты Alternaria alternata более ярко выраженно. Нами показано, что при действии а-терпинеола имело место значительное увеличение активности (на 50% у Penicillium chrysogenum и на 36% у Alternaria alternata) кислых экзофосфатаз у обоих видов грибов. Такое явление наблюдалось в работах [2] при изучении влияния хлорорганики на Aspergillus niger. Данный эффект авторы объясняли тем, что хлорорганические соединения повышали проницаемость клеточной мембраны, в том числе мембраны вакуолей и лизосом, где в основном были сконцентрированы данные формы ферментов и, как следствие, имел место активный выход фермента в культуральную жидкость. Вследствие этого количество фермента превысило то количество, которое содержалось в культуральной жидкости при определении МФК, и концентрации а-терпинеола оказалось недостаточно для подавления активности фермента. Возможно, в наших экспериментах имеется аналогичный эффект.
Также нами было исследовано действие фунгицидов на интенсивность дыхания гриба Penicillium chrysogenum. Причем исследование проводили на фоне NaF, известного ингибитора гликолиза (Фторид натрия известен как ингибитор фосфатаз, в части ингибирования одного из ключевых ферментов гликолиза - енолазы).
Результаты изучения влияния биоцидов на дыхание представлены на рисунке. Нами показано, что эти вещества способны подавлять интенсивность дыхания по отношению к контролю. Причем в большей степени ингибирование наблюдалось при совместном действии NaF и сульфатного скипидара. Поскольку при совместном действии суммирования не наблюдалось, а т.к. NaF известен как ингибитор енолазы, то биоциды ингибировали и другие ферменты, что косвенно подтверждается влиянием данных соединений на эндофосфатазы.
Тесно с процессом дыхания связан процесс кислотообразования. Известно, что органические кислоты грибов играют существенную роль в деструкции различных промышленных материалов. Основной путь синтеза органических кислот - цикл Кребса [8]. Поэтому в следующей серии экспериментов нами исследовалось действие а-терпинеола и соединений на кислотообразующую деятельность гриба
P.chrysogenum.
Результатами этой серии экспериментов показано, что происходит ингибирование процесса кислотообразования. Сумма кислот снизилась под действием а-терпинеола до 23,23 г/дм3, сульфатного скипидара до 10,62 г/дм3 (контроль - 33,62). При действии биоцидов на процесс кислотообразования нами отмечено, что а-терпинеол наиболее сильно ингибирует синтез кетоглутаровой и янтарной кислот, сульфатный скипидар - щавелевой и янтарной. Это позволило предположить, что данные биоциды блокируют различные ферментативные системы цикла трикарбоновых кислот. Данные представлены в таблице 4.
о о
ш
0 те
1 х
12 2
I Ч
120 100 80 60 40 20 0
100
60,53
54,23 62'9 59,22
33,19
\ 5 6 Вариант опыта
Изменение интенсивности дыхания гриба P.chrysogenum при действии фунгицидов. 1 -контроль, 2 - МаР, 3 - МаР + а-терпинеол, 4 -МаР + сульфатный скипидар, 5 - сульфатный скипидар, 6 - а-терпинеол
Таблица 4. Определение содержания карбоновых кислот в субстратах жизнедеятельности гриба PeniciПium chrysogenum под влиянием биоцидов
Кислота
Массовая концентрация кислот в пробе, г/дм
а-терпинеол сульфатный скипидар контроль
Щавелевая 17,80 5,28 25,57
Фумаровая + яблочная 4,03 3,39 4,38
Кето-глутаровая 0,91 0,82 2,85
Янтарная 0,072 0,028 0,13
Лимонная 0,42 0,56 0,69
Сумма 23,23 10,62 33,62
Выводы
1. Скрининг 17 соединений терпеноидной природы позволил выявить наличие фунгицидной активности у а-терпинеола и сульфатного скипидара. Причем а-терпинеол оказывал фунгицидный эффект на все 14 видов грибов, а сульфатный скипидар - только на грибы A. niger, P. chrysogenum, A. oryzae. МФК составила 1% для а-терпинеола и 5% для сульфатного скипидара.
2. Отмечено, что а-терпинеол ингибирует активность нейтральных экзо- и эндофосфатаз, а также кислых эндофосфатаз и повышает активность кислых экзофосфатаз.
3. а-Терпинеол и сульфатный скипидар подавляют интенсивность дыхания P.chrysogenum на 40,8 и 30,8% соответственно. Возможно, что механизм ингибирующего действия на данный процесс связан с подавлением процесса гликолиза.
4. Показано, что а-терпинеол и сульфатный скипидар ингибируют процесс кислотообразования.
Список литературы
1. Заявка 2000113057. Дезинфицирующее средство «Лесептик» / А. Л. Лозовская, А.Н. Трофимов и др./. Россия. Приоритет от 25.05.2000 г. Положительное решение от 15.05.2002 г.
2. Леонтьева А.Н., Смирнов В.Ф. Влияние хлорорганических соединений на фосфатазную активность гриба Aspergillus niger // Микробиологический журнал. 1990. Т. 52. №6. С. 69-73.
3. Кинтя П.К., Фадеев Ю.М., Акимов Ю.А. Терпеноиды растений. Кишинев, 1990. 151 с.
4. Калашникова Н.А., Родзевич В.И. Активность фосфатаз различных культур плесневых грибов // Прикладная биохимия и микробиология. 1971. Т. VII. Вып. 4. С. 446-450.
5. В.Г. Березин. Аналитическая реакционная газовая хроматография. М., 1996. 185 с.
6. Беккер З.Э. Физиология и биохимия грибов. М., 1988. 230 с.
7. Шнырева М.Г., Егоров С.Н. О возможности существования различных путей секреции кислой фосфатазы у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Микробиология. 1990. Т. 59. Вып. 6. С. 948-955.
8. Ильичев В.Д. Биоповреждения. М., 1987. 352 с.
Поступило в редакцию 4 июля 2002 г.
