CC BY
11УДК 632.953
ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРАВАСТАТИНА В ЗАЩИТЕ РАСТЕНИЙ ОТ ГРИБНЫХ И ВИРУСНЫХ ПАТОГЕНОВ
М.И. Карташов, В.Г. Джавахия
Всероссийский НИИ фитопатологии, Московская область, Большие Вяземы e-mail: vniif@vniif.rosmail.com
Изучали влияние правастатина (П) на рост ряда фитопатогенных грибов, а также на устойчивость пшеницы к возбудителю септориоза (Stagonospora nodorum (E. Castell. & Germano) Berk.), табака - к вирусу табачной мозаики (ВТМ) и картофеля - к М-вирусу. Установлено, что П подавляет линейный рост и пигментацию St. nodorum, Bipolaris sorokiniana (Sacc. in Sorokin) Shoem., Alternaria tenuissima (Nees & T. Nees : Fr.) Wiltshire и Colletotrichum atramentarium (Berk. & Broome) Taubenh. Показано, что обработка П листьев пшеницы снижает их поражение грибом St. nodorum. Впервые обнаружено, что П обладает противовирусной активностью. Показано, что он сокращает количество и размер образующихся некрозов ВТМ на листьях табака сорта Xanthi, а также снижает уровень накопления М-вируса в тканях картофеля на естественном инфекционном фоне в полевых экспериментах.
Ключевые слова: пшеница, картофель, возбудители болезней, правастатин, фунгицидная и противовирусная активность.
Одно из направлений биологической защиты растений - создание биопестицидов на основе продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, применение которых, в отличие от большинства современных синтетических пестицидов, не приводит к загрязнению окружающей среды. С другой стороны, во многих исследованиях продемонстрирована возможность использования знаний о характере взаимоотношений паразита и хозяина в защите растений для разработки специфических ингибиторов процессов патогенеза. Одним из направлений таких исследований является изучение влияния изменений уровня биосинтеза фитосте-ринов в растении на жизненный цикл фитостеринзависимых патогенов и вредителей.
Как известно, фитопаразитические нематоды, насекомые и оомицеты не способны к самостоятельному синтезу сте-ринов. Между тем, производные стери-нов необходимы им для роста и развития. Единственным источником стеринов для этих паразитов служит растение-хозяин. В этой связи снижение уровня содержания фитостеринов в растении должно отрицательно сказываться на развитии стеринзависимых патогенов и вредителей (Ходжайова и др., 2000), то
есть ингибиторы биосинтеза фитостери-нов могут рассматриваться как потенциальные средства защиты растений от стеринзависимых паразитов (Инге-Вечтомов, 1997).
Один из ключевых ферментов, участвующих в биосинтезе стеринов, 3-окси-3-метилглютарат-КоА-редуктаза, катализирующая реакцию образования мевало-ната из 3-окси-3-метилглютарат-коэн-зима А (ОМГ-КоА). Известно, что вещества, относящиеся к группе статинов, являются специфическими ингибиторами этого фермента (Шевченко и Шевченко, 2003). Это позволило предположить, что статины, ингибируя ОМГ-КоА-редуктазу и снижая уровень содержания фитосте-ринов в тканях растения, будут препятствовать их поражению стерин-зависимыми патогенами и вредителями. Справедливость этого предположения была подтверждена на примере одного из представителей статинов - компакти-на. Было показано, что компактин обладает фунгицидной активностью против ряда фитопатогенных грибов при тестировании на твердой питательной среде (Украинцева и др., 2008). Опыты на растениях выявили защитные свойства ком-пактина от грибных и вирусных патогенов.
П является производным компактина, но в отличие от последнего широко применяется в медицине как препарат, снижающий уровень холестерина в крови. Можно было предположить, что П, как и компактин, обладает защитными свойствами против патогенов растений.
Целью данной работы было изучение
Методика
Изучали действие правастатина (П) на возбудители гельминтоспориозной корневой гнили озимой ржи и ярового ячменя (B. sorokiniana), альтернариоза зерновых культур (A. tenuissima), септо-риоза пшеницы (St. nodorum), антракно-за томата (С. atramentarium) при культивировании этих патогенов in vitro. A. tenuissima выращивали на среде PCA (морковь - 20 г/л, картофель - 20 г/л, агар 15 г/л, стерилизация при 1 атмосфере в течение 1 часа. Для выращивания грибов St. nodorum, B. sorokiniana и С. atramentarium использовали среду Чапека-Докса с добавлением 1 г/л дрожжевого экстракта (Dhingra and Sinclair, 1986). Кусочки мицелия переносили микробиологической петлей на ага-ризованные среды в центр чашки Петри. Через 7 дней измеряли диаметр колоний грибов. Опыт проводили дважды в 3-кратной повторности. Степень ингибиро-вания роста колоний определяли как отношение диаметра колоний, выращенных на средах с добавлением различных концентраций П, к диаметру контрольных колоний, выращенных на среде без П.
Для изучения влияния П на растения проростки пшеницы выращивали в климатической камере с фотопериодом 16 часов, дневными и ночными температурами - 22°С и 20°С соответственно. Отрезки первых полностью развернувшихся листьев пшеницы помещали на агар с бензимидазолом (40 мг/л) по 10 шт. в каждую чашку. На верхнюю часть восьми отрезков наносили по 10 мкл суспензии спор St. nodorum в растворах права-статина. На нижнюю часть восьми отрезков листьев наносили по 10 мкл суспензии спор гриба в воде. На верхнюю и
Вестник защиты растений, ,3, 2010 в лабораторных и полевых экспериментах влияния П на рост мицелия ряда фитопатогенных грибов и инфекционный процесс, вызываемый этими грибами. Поскольку в ходе выполнения исследований была обнаружена фунгицидная активность П, были предприняты исследования его влияния и на вирусные инфекции.
исследований
нижнюю части последних двух контрольных отрезков наносили по 10 мкл суспензии спор St. пойотит. Концентрация правастатина составляла от 0.001% до 0.1%, концентрация спор в суспензии -2-3x10® спор/мл. Чашки Петри с листьями пшеницы выдерживали в течение суток в темноте, а затем помещали в световую камеру при комнатной температуре на 6 суток. Степень развития септо-риоза определяли по 5-балльной шкале через 6 суток после заражения (Пыжи-кова и др., 1989).
Для оценки действия П на устойчивость табака к вирусу табачной мозаики (ВТМ) использовали отделенные листья табака. По пять растений табака N. tabacum сорта ХаШЫ ^^ выращивали в горшках с почвой до стадии 5-6 листьев. Для одного варианта опыта отбирали по 5 листьев с разных растений и опрыскивали растворами с различной концентрацией П нижнюю сторону каждого листа. Контрольные листья опрыскивали водой. Верхнюю часть листьев через сутки обрабатывали 120 мкл водной суспензии ВТМ. Для заражения использовали сок из листьев табака, инфицированного ВТМ, разбавленный в 10 тысяч раз дистиллированной водой (предварительно подбирали концентрацию иноку-люма так, чтобы при нанесении 100-120 мкл водной суспензии вируса на листе образовывалось от 40 до 80 некрозов). Обработанные листья помещали во влажную камеру при 22°С. Число некрозов, образовавшихся в ответ на инокуляцию ВТМ, подсчитывали отдельно на каждом листе через три-четыре дня после заражения (Djavakhia е! а1., 2000). Повторность опыта 5-кратная, по 3 серии в каждой повторности.
Оценку влияния П на устойчивость картофеля к различным вирусам картофеля при естественном заражении в полевых условиях проводили путем обработки П клубней картофеля сорта Санте и выращиванием их в экспериментальном поле ВНИИ фитопатологии. В каждом варианте было по 20 клубней. Варианты - замачивание клубней в 0.1%; 0.3% и 0.5% растворах П в течение 60 минут, а также опрыскивание листьев растений 0.1% раствором П через неделю после всходов. Первый учет всходов и отбор листьев для анализа проводили через 3 недели после посадки. Второй - через 5 недель после посадки. Листья картофеля растирали до получения сока. Анализируемый сок (10 мкл) тестировали "сэндвич" вариантом иммуноферментного анализа (ИФА). Диагностические наборы для тестирования вирусов были приобре-
0.1% 0.1% 0.1% 0.1%
Правастатин
Stagonospora Bipolaris Alternari Colletotrichum nodorum sorokiniana tenuissima atramentarium
Рис. 1. Рост грибов на твердых питательных средах в зависимости от концентрации правастатина
тены во ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г.Лорха. Уровень ферментативной реакции измеряли с помощью многоканального фотометра «Униплан АИФР-01» .
Результаты исследований
Ингибирующий эффект П на линейный рост колоний был в той или иной степени отмечен у всех исследуемых грибов. Наибольшую устойчивость проявил А. tenuissima (в концентрации 0.1% П на 7-е сутки скорость роста ингибировалась в среднем в 1.7 раза). Менее устойчивыми к П были культуры St. пойотит и В. soтokiniana (ингибирование роста на 7-е сутки в среднем было на 22% выше, чем у А. tenuissima, при концентрации П в среде 0.1%). Максимальный эффект ингибирова-ния был обнаружен для культуры С. atтamentaтium. При концентрации П 0.05% диаметр колоний на 7-е сутки уменьшался на 58.8%, а при концентрации 0.1% рост был полностью подавлен (рис. 1, табл. 1).
Наряду с ингибированием роста грибов, во всех четырех случаях наблюдалось также обесцвечивание их мицелия. Это свидетельствовало о способности П подавлять меланиногенез у патогенов. Поскольку известно, что блокирование биосинтеза меланина у ряда фитопато-генных грибов приводит к потере их па-тогенности (Джавахия и др., 1990; Не^оп
е! а1., 1999), можно предположить, что П помимо контактного фунгицидного действия, возможно, способен оказывать защитное действие против исследованных грибов, снижая их патогенность вследствие подавления меланиногенеза.
Таблица 1. Диаметры колоний грибов, выросших на средах с различным содержанием правастатина (в % к контролю)
Культуры ■ Концентрация правастатина, %
0.0001 0.001 0.01 0.05 0.1
Stagonospora nodorum 98.2 97.5 95.3 78.1 35.7
Bipolaris sorokiniana 99.3 95.4 74.1 50.5 32.8
Alternaria tenuissima 95.7 95.0 95.2 90.6 56.3
Colletotrichum atramentarium 96.3 95.4 92.4 37.5 0.0
Результаты изучения защитного действия П против септориоза на изолированных листьях пшеницы - свидетельство о способности П подавлять развитие септориоза в этих условиях при концентрации П в суспензии спор St. пойотит 0,1%. Концентрации ниже 0,1% не оказывали существенного влияния на развитие септориоза.
Анализ результатов исследования влияния обработок листьев табака показал, что П снижает количество некрозов, вызываемых заражением ВТМ (табл. 2).
Таблица 2. Влияние обработок листьев табака правастатином на количество некрозов
Концентрации тт Защитный эф-
Некрозов, , „ правастатина, срект, % к кон_%_'_тролю_
0.0 (Контроль) 0.% 0.3% 0.5%
52 ± 6.16 17 ± 1.52 14 ± 1.36 8 ± 0.71
0.0
67.3 71.6 84.5
растворах П перед посадкой приводило к достоверному снижению степени развития болезни на естественном инфекционном фоне М-вируса.
При опрыскивании листьев табака 0.1% раствором правастатина число некрозов снижалось в 3 раза, а 0.5% раствор практически полностью подавлял их образование. Особо следует отметить уменьшение размеров некрозов, коррелирующее с концентрацией правастатина. Полученные данные свидетельствуют также об отсутствии фитотоксичности использованных концентраций правастатина по отношению к табаку. Результаты полевых испытаний П по оценке его защитного действия против различных вирусов картофеля показали, что в течение полевого сезона в тканях растений практически не удалось выявить антигены вирусов Б-,Х-,У. Не были обнаружены и антигены вирусов А- и Ь-. Антигены М-вируса картофеля четко выявлялись в процессе обоих учетов (рис. 2).
Замачивание клубней картофеля в
шм
контроль замачивание 0,1% замачивание 0,3% опрыскиван
0,1%
Рис. 2. Влияние обработок клубней картофеля на накопление антигенов М-вируса в растительных тканях. По оси ординат «поглощение при 492 ммк» при 1 и 2 учетах
Следует отметить, что в первом учете все варианты (замачивание в 0.1%, и 0.3%, растворах П, а также в варианте с опрыскивание 0.1%, раствором) показали задержку накопления антигена М-вируса в растениях. Однако во втором учете при замачивании и опрыскивании в 0.1%, растворе развитие болезни было выше, чем в контрольном варианте, в то же время замачивание в 0.3%, растворе П также продолжало сдерживать накопление М-вируса в тканях растения.
Установлено, что правастатин способен подавлять рост мицелия фитопатогенных грибов St. пойогит, В. эсп-оШтапа, С. сй-гатеШагшт, и А. 1епшзз1та. Показана также его способность подавлять мелани-новую пигментацию у этих грибов. Хорошо известно, что нормальная пигментация фитопатогенного гриба является необходимым (но не достаточным) условием реализации его патогенных свойств (Джава-хия и др., 1990). В связи с этим нельзя исключить, что защитный антигрибной эффект П может быть обусловлен двойным действием, а именно: (1) прямым фунги-
цидным действием на рост мицелия гриба и (2) блокированием меланиногенеза, приводящим к снижению его патогенно-сти.
Особый интерес представляет обнаружение антивирусной активности П по отношению к вирусу табачной мозаики на табаке и М-вируса картофеля на картофеле. Это подтверждает наличие у стати-нов активности против вирусов растений, впервые показанной нами для компактина и ловастатина (Украинцева и др., 2008). Несмотря на то что полученные данные трудно поддаются интерпретации, они, по-
видимому, свидетельствуют о новых, пока неизвестных механизмах действия стати-нов и могут в перспективе иметь практическое значение, поскольку в настоящее время существует не так уж много противовирусных препаратов прямого действия. Для выяснения этих механизмов, вероятно, потребуется проведение довольно сложных экспериментов. Однако, показанное в данной работе уменьшение размеров некрозов, скорее всего, свидетельствует о действии П через растение, что позволяет предполагать его способность индуцировать защитные реакции растения на вирусную инфекцию. В пользу этого предпо-
ложения говорит также неспецифичность антивирусной активности П, поскольку М-вирус картофеля и ВТМ относятся к разным типам вирусов и значительно отличаются друг от друга.
Полученные результаты позволяют сделать заключение, что правастатин можно считать потенциальным биопестицидом, обладающим как активностью против вирусов, так и противогрибной активностью, которая направлена не только на подавление роста гриба по типу неспецифического фунгицидного действия, но и на ингибиро-вание меланиногенеза, то есть на специфическое подавление его патогенных свойств.
Литература
Джавахия В.Г., Аверьянов А.А, Минаев В.И., Ермолинский B.C., Воинова Т.М., Лапикова В.П., Петелина Г.Г., Вавилова H.A. Структура и функции меланина клеточной стенки микромицнга Pyricularia oryza cav. - возбудителя пирикулярио-за риса//Журнал общей биологии, 1990, 51,4, с. 528-535.
Инге-Вечтомов С.Г. Метаболизм стеринов и защита растений // Соросовский образовательный журнал, 1997, 11, с. 16-21
Пыжикова Г.В., Санина A.A., Супрун Л.М., Курахта-нова Т.И., Гогаева Т.И., Мепаришвили С.У., Анциферова Л.В., Кузнецов Н.С., Игнатов А.Н., Кузьмичев A.A. Методы оценки устойчивости селекционного материала и сортов пшеницы к септориозу. М., 1989, 44 с.
Украинцева С.Н., Приданников М.В., Джавахия В.Г. Компактин - потенциальный биопестицид // Защита и карантин растений, 2008, 2, с. 63.
Ходжайова Л.Т., Левашина Е.А., Усольцева М.Ю., Бондаренко Л.В., Лутова Л.А. Изменение содержания растительных стеринов как биологический метод борьбы с фитостерин-зависимыми организмами // Генная инженерия и экология. 2000, 1, с. 124-128.
Шевченко О.П., Шевченко А.О. Статины -ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы. М., реафарм, 2003.
Djavakhia V.G., Nikolaev O.N., Voinova Т.М., Battchikova N.A., Korpela Т., Khomutov R.M. DNA sequence of gene and amino acid sequence of protein from Bacillus thuringiensis, which induces non-specific resistance of plants to viral and fungal diseases // Journal of Russian Phytopathological Society, 2000, 1, p. 75-79.
Henson J.M., Butler M.J., Day A.W. The dark side of the mycelium: melanins of phytopathogenic fungi // Annu. Rev. Phytopathol., 1999, 37, c. 447-471.
STUDY OF POSSIBILITY OF PRAVASTATIN USE IN PLANT PROTECTION AGAINST PATHOGENIC FUNGI AND VIRUSES M.I.Kartashov, V.G.Dzhavakhiya The influence of Pravastatin on the growth of several plant pathogenic fungi, and on the wheat, tobacco and potato resistance to leaf blotch agent (Stagonospora nodorum (E. Castell. & Germano) Berk.), tobacco mosaic virus (TMV) and potato M-virus, respectively, was studied. The Pravastatin was shown to suppress linear growth and reduce pigmentation of St. nodorum, Bipolaris sorokiniana (Sacc. in Sorokin) Shoem, Alternaria tenuissima (Nees & T. Nees: Fr.) Wiltshire and Colletotrichum atramenta-rium (Berk. & Broome) Taubenh. Treatment of wheat leaves with Pravastatin protected them against St. nodorum. It was first found that the Pravastatin possessed an antiviral activity, viz it decreased the number and size of TMV lesions formed on tobacco leaves (cv. Xanthi), as well as diminished the content of M-virus in naturally infected field.
Keywords: wheat, potato, disease agent, Pravastatin, fungicide and antiviral activity.
M.M.KapTanioB, h.c., kartashov_m@yahoo.com, B.r.flacaBaxMH, K.6.H., dzhavakhiya@yahoo.com
