CC BY
171
УДК 577.152.1:546.215:632.4:633.11
ПЦР-диагностика гриба Septoria nodorum Berk. в тканях пшеницы
Г.Ф. ХАЙДАР, аспирант
Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН И.В. МАКСИМОВ, заведующий лабораторией А.Ш. ВАЛЕЕВ,
младший научный сотрудник e-mail: phyto@anrb.ru
Септориоз - одна из наиболее распространенных болезней зерновых культур, вызывающая нередко недобор 30-40 % урожая. Из представителей р. Septoria на пшенице активно развивается гриб S. nodorum Berk. (син. Stagono-spora nodorum Caste!!. et Germano; телеоморфа: Leptosphaeria nodorum E. Mu!!., син. Phaesphaeria nodorum (E. Mu!!.) Hedjar.). Пораженные семена внешне не отличаются от здоровых, а заболевание становится заметным на стадии всходов по снижению роста пораженных побегов и бурым узлам на первых листьях проростков [2].
Наиболее активно патоген развивается на взрослых растениях пшеницы, где в начальные периоды инфицирования его крайне трудно обнаружить и идентифицировать. В связи с этим разработка относительно доступной современной диагностики этой болезни, например, с использованием в качестве маркеров патогена его ДНК, особенно актуальна. Проблему усугубляет наличие у возбудителя септориоза штаммов, отличающихся по степени агрессивности друг от друга. Существующие методы ДНК диагностики могут определить наличие патогена в тканях, но о степени его агрессивности можно судить только по характеру развития некрозов. Мы считаем это одним из важных
показателей, определяющих впоследствии степень развития того или иного штамма патогена. В связи с этим нами изучена возможность использования молекулярно-биологических методов для диагностики степени агрессивности гриба Э. nodorum [1, 4].
4 штамма гриба Э. nodorum использовали для заражения листьев мягкой пшеницы сорта Жница [2]. Симптомы проявлялись через 3 суток в виде узких бурых штрихооб-разных некрозов в случае штаммов 6ВД и 4ВД и четко заметных округлых бурых пятен при заражении штаммами 9МН и Ваэ1. Различались также скорость развития сеп-ториоза на отрезках листьев пшеницы, инфицированных отмеченными штаммами гриба, и характер проявления инфекционных пятен. Через 6 суток после нанесения ино-кулюма размер септориозных пятен на листьях, инфицированных штаммами 9МН и Ваэ1, был в 2 раза больше, чем при заражении слабоагрессивным штаммом 4ВД. Штаммы 9МН и Ваэ1 характеризовались более коротким латентным периодом и формированием спорулиру-ющих органов (пикнид со спорами) гриба на листьях пшеницы уже через 6 суток, тогда как 6ВД и 4ВД -только через 12 и 14 суток соответственно. Можно считать, что штаммы 9МН и Ваэ1 проявили себя более агрессивными, чем 6ВД и 4ВД.
Известно, что в процессе роста и развития патогенных грибов на растениях значительно изменяется состав их клеточных стенок. Так, у возбудителя ржавчины пшеницы при проникновении в ткани растений происходит заменахитина клеточных стенок инфекционных гиф
на хитозан [3]. Выдвигались предположения, что это связано с выделением патогенными грибами ферментов, дезацетилирующих хитин. Эти ферменты, как оказалось, важны при проявлении патогеном агрессивности, способствуя успешному проникновению его в ткани растений. Штаммы гриба с высокой агрессивностью (9МН и Bas1) снижали степень ацетилирования хитина сильнее, чем слабоагрессивные. Так, если степень ацетили-рования хитина до опыта была 85 %, то после обработки культу-ральным фильтратом гриба S. nodorum Berk. она составила у штамма Bas1 67 %, 9МН - 68,5, 6ВД - 73 и 4ВД - 80,7 %.
ПЦР-анализ был проведен с использованием праймеров, специфичных к гену хитиндезацетилазы (CDA) и ДНК из мицелия гриба S. nodorum. Результаты представлены на рисунке 1. Для подтверждения высокой специфичности прай-меров именно к гену CDA гриба S. nodorum были изучены ДНК, выделенные из мицелия грибных патогенов пшеницы (Tilletia caries, Ustilago tritici, Fusarium culmorum, Bipolaris sorokiniana, Septoria tritici) и непатогенного гриба Beauveria
12 3456789M
1. Результаты амплификации фрагментов гена хитиндезацетилазы на ДНК грибов S. tritici (1), B. bassiana (2), U. tritici (3), B. sorokiniana (4), F. culmorum (5), T. caries (6), S. nodorum (7) и ДНК участка гена CDA штаммов гриба S. nodorum, выделенного из листьев инфицированных (8) и неинфи-цированных (9) растений пшеницы через 24 ч после заражения. М — маркер молекулярных масс ДНК
0,9 0,8
<Ь
CL.
* 0,6 ■о
(D
3 0.5 %
'Э ft 4
■О
5:
I 0,3 I
I 0,2
о 0,1
12 3 4
2. Экспрессия гена СШ штаммов 4МН (1), 6ВД (2), 9ВД (3), Bas1 (4) через 24 ч после инфицирования
bassiana, вызывающего микозы насекомых. На рис. 1 видно, что амплификация с праймерами к гену CDA происходила только с ДНК, выделенной из мицелия S. nodorum, а размер полученного продукта соответствовал теоретически рассчитанным для участка гена CDA гриба S. nodorum - 387 п.н. (рис. 1, трек 7). В тканях инфицированной пшеницы ген CDA обнаруживали уже через 23 ч после инокуляции (рис. 1, трек 8). В то же время при использовании в качестве матрицы ДНК из неинфицированных листьев пшеницы, образование искомого ампликона не происходило (рис. 1, трек 9). Отсутствие в треках 1-6 и 9 ампликона свидетельствует о специфичности праймеров только к гену CDA гриба S. nodorum.
Таким образом, метод ПЦР с использованием праймеров к гену CDA позволяет высокоспецифично диагностировать гриб S. nodorum в инфицированных тканях пшеницы. Так как септориоз начинает визуально проявляться через 4 суток после инокуляции и только на листьях, то с помощью разработанной ДНК-диагностики, как мы предполагаем,
можно идентифицировать скрытые формы болезни в растениях пшеницы, например, в ранние фазы развития гриба при отсутствии в местах поражения спороношения, а также в зерновках.
К сожалению, только по фрагментам ДНК гриба сложно говорить о степени агрессивности отдельных его штаммов, но, судя по активности фермента хитиндезацетилазы, которая была выше у агрессивного штамма, чем у слабоагрессивного, активность фермента должна быть тесно связана с последующим проявлением агрессивности. Вероятно, в этих условиях целесообразно применить модифицированный метод обратно транскрипционного ПЦР (от-ПЦР) с последующей фиксацией данных в режиме реального
времени [5] или по конечной точке амплификации. На рис. 2 представлены данные по экспрессии гена CDA у штаммов 4МН, 6ВД, 9ВД и Bas1 гриба S. nodorum. У агрессивных штаммов транскрипционная активность гена CDA была выше, чем у слабоагрессивных.
Полученные данные позволяют сделать вывод о важности фермента хитиндезацетилазы в инфекционном процессе и эффективности метода ПЦР-диагностики не только для выявления патогенного гриба в тканях растений, но и для определения степени его агрессивности. Выявление зараженности семян грибом S. nodorum позволит своевременно спрогнозировать развитие эпифитотии и принять меры по ее устранению.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абрамова С.Л., Рязанцев Д.Ю., Воинова Т.М. и др. Диагностика фитопатогенных грибов Septoria tritici и Stagonospora nodorum методом FLASH-ПЦР. // Биоорганическая химия, 2008, т. 34, с. 107-113.
2. Пыжикова Г.В., Карасева Е.В. Методика изучения возбудителя септориоза на изолированных листьях пшеницы. // Сельскохозяйственная биология, 1985, № 12, с. 112-114.
3. El Gueddari N.E., Rauchhaus U., Moerschbacher B.M., Deising H.B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. // New Phytologist, 2002, vol. 156, p. 103-112.
4. Gubis J., Hudcovicova M., Slikova S., Vanco B. Molecular detection of Stagonospora nodorum and Septoria tritici - casual agent of septoria leaf spot diseases in wheat. // Biologia, Bratislava, 2005, vol. 60, p. 681-684.
5. Oliver R.P., Rybak K., Shankar M., Loughman R., Harry N., Solomon P.S. Quantitative disease resistance assessment by real-time PCR using the Stagonospora nodorum- wheat pathosystem as a model // Plant Pathol., 2008, vol. 57, p. 527-532.
Аннотация. Септориоз, вызываемый грибом Septoria nodorum Berk., одна из самых распространенных болезней зерновых культур. Обсуждается возможность использования метода ПЦР-диагностики ДНК для идентификации гриба S. nodorum в тканях растений пшеницы и определения степени агрессивности его штаммов. В зависимости от агрессивности патогена между штаммами гриба наблюдались различия в экс-прессионной активности гена хитиндезацетилазы.
Ключевые слова. Септориоз, Septoria nodorum Berk., штаммы, пшеница, ПЦР-диагностика, агрессивность.
Abstract. The Septoria nodorum Berk. is one of the most significant plant pathogen caused diseases of wheat and other cereal crop. Identifications in the wheat plant tissues of the S. nodorum and its aggressiveness degree with use of PCR-diagnostic were discussed. Differences in the gene expression activity among fungal strains in depends on the aggressiveness of the pathogen were observed.
Keywords. Septoria nodorum Berk., strain, wheat, PCR-diagnostic, aggressiveness.
