CC BY
71
УДК 616.71-007.234:615.22
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ 1-АРГИНИНА И ЕГО КОМБИНАЦИЙ С ЭНАЛАПРИЛОМ И ЛОЗАРТАНОМ НА МОДЕЛИРОВАНИЕ КОСТНОЙ ТКАНИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Д.С.Р. РАДЖКУМАР1 О.С. ГУДЫРЕВ2
e-mail: [email protected]
Известно, что пусковым механизмом манифестации остеопороза является дисбаланс между двумя основными процессами костного ремоделирования: костной резорбцией и костеобразованием [1]. Существенным звеном в патогенезе развития остеопороза, особенно иммобилизационного, является нарушение кровоснабжения кости, приводящее к торможению активности и уменьшению количества остеобластов, а также к усиленной деятельности остеокластов [10, 14]. В последнее время в научной литературе появляется все больше эпидемиологических, экспериментальных и клинических данных, свидетельствующих о взаимосвязи сосудистой патологии и остеопороза [2, 6].
Микрососуды костной ткани представлены монослоем эндотелиоцитов и не имеют мышечного и соединительнотканого слоев, следовательно, именно эндотелий опосредует гуморальную регуляцию обмена между остеоцитами и кровью [14, 16]. Одной из, причин нарушения кровоснабжения костной ткани может быть дисфункция эндотелия сосудов, которая посредством ухудшения микроциркуляции может приводить к нарушению остеогенеза, вызывая тем самым остеопороз.
Современные фармакологические исследования показали положительное остеопротективное действие препаратов, корригирующих дисфункцию эндотелия. К ним, в первую очередь, относятся ингибитор ангиотензинпревращающего фермента эналаприл, блокатор ангиотензиновых рецепторов лозартан и фитоалексин резвератрол [3, 7, 8].
Это указывает на актуальность дальнейшего поиска фармакологических агентов для воздействия на процессы костного ремоделирования, а также обосновывает избранное нами направление исследования.
Цель исследования - сравнительное изучение остеопротективного действия Ь-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном для фармакологической коррекции экспериментального остеопороза.
Материалы и методы. Опыты производились на 120 белых крысах-самках Вистар с массой тела 200-300 г. Все манипуляции в эксперименте выполнялись под наркозом - внутрибрюшинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг. Для моделирования остеопороза у крыс проводили операцию - билатеральную овариэктомию. Через восемь недель у животных развивается остеопороз [3]. Исследуемые препараты и их комбинации вводили с девятой по двенадцатую неделю эксперимента включительно. В качестве групп сравнения использовали «контрольных» животных, которым была проведена ложная операция овариэктомии, а также животных с остеопорозом. Степень выраженности остеопороза оценивали гистоморфометрически через двенадцать недель после начала эксперимента.
Животные были распределены на 6 групп (по 20 крыс в каждой): 1 — контрольная (ложная овариэктомия); 2 — через 8 недель после овариэктомии (модель остеопороза); 3 — через 8 недель после овариэктомии крысам вводился Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг в течение 4 недель; 4 — через 8 недель после овариэктомии вводили комбинацию препаратов, состоящую из Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг и эналаприла в дозе 0,5 мг/кг, в течение 4 недель; 5 — через 8 недель после овариэктомии животные в течение 4 недель получали комбинацию препаратов, состоящую из Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг и лозартана в дозе 6 мг/кг; 6 — через 8 недель после овариэктомии в качестве препарата срав-
А.В. ФАЙТЕЛЬСОН1 М.В. ПОКРОВСКИЙ2 Л.В. КОРОКИНА2
В эксперименте на самках белых крыс линии Вистар изучалось остеопротективное действие Ь-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном на модели экспериментального остеопороза. Ь-аргинин и его комбинации с эналаприлом и лозартаном предотвращают снижение уровня микроциркуляции в костной ткани, что приводит к замедлению истончения костных трабекул и предупреждению возникновения в них микропереломов.
1}Курский государственный медицинский университет
2Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Ключевые слова: остеопороз, микроциркуляция, эндотелиальная дисфункция, эналаприл, лозартан, Ь-аргинин.
нения использовали Kальций-Дз Никомед в дозе 85,7 мг/кг в течение 4 недель. Исследуемые вещества вводили ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в виде суспензии в 1% крахмальной слизи.
Через 12 недель (на 85 сутки) проводилось измерение уровня микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедренной кости. Для этого производили хирургический доступ к проксимальному метафизу бедра крысы. После формирования отверстия в кортикальном слое кости глубиной до 2 мм, вводили в него датчик для исследования состояния регионарной микроциркуляции. Микроциркуляцию исследовали с помощью оборудования производства компании Biopac systems, США: полиграфа MP100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и датчиком TSD144. После измерения уровня микроциркуляции в кости, не изменяя положения датчика, проводили пробы эндотелийзависимой вазодилатации (ЭЗВД) в ответ на болюсное внутривенное введение раствора ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг и эндотелийнезависимой вазодилатации (ЭНВД) в ответ на болюсное внутривенное введение раствора нитропруссида натрия в дозе 30 мкг/кг [3]. Для оценки развития нарушения функции эндотелия сосудов при остеопорозе рассчитывали коэффициент эндотелиальной дисфункции (ГОД) на основании результатов измерения микроциркуляции в костной ткани при проведении функциональных сосудистых тестов. Для этого рассчитывали площади прямоугольных треугольников, сформированных кривыми восстановления уровня микроциркуляции при проведении тестов ЭЗВД и ЭНВД. За меньший из катетов такого треугольника принималась абсолютная величина максимального падения уровня микроциркуляции, за больший - время до нормализации и стабилизации уровня микроциркуляции. ГОД рассчитывали как отношение площади треугольника, формирующегося в ответ на введение нитропруссида к площади треугольника, формирующегося в ответ на введение ацетилхолина [3]. Регистрацию и обработку результатов лазерной допплеровской флоуметрии осуществляли с помощью программы AcqKnowledge версий 3.8.14.2.0, значения микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕ).
Для изучения изменений, происходящих в процессе развития экспериментального остеопоро-за и при его коррекции исследуемыми препаратами и комбинациями препаратов, проводили гистологическое исследование проксимальных метафизов бедренных костей крыс. Предметные стекла с гистологическими препаратами подвергали световой микроскопии при помощи микроскопа Leica CME (увеличение хіоо: объектив хіо, окуляр хіо) и фотографированию цифровым фотоаппаратом. Для морфометрического изучения микроархитектоники костной ткани использовали откалиброванную программу ImageJ версий 1.39-1.43. В качестве количественной меры оценки развития остеопо-роза и эффективности его коррекции использовали ширину костных трабекул проксимального мета-физа бедренной кости.
Статистический анализ первичных данных осуществляли в программе Microsoft Excel. Для групповых значений определяли средние значения (M) показателей и ошибку среднего (m). Оценка статистической значимости различий при межгрупповых сравнениях производилась по двустороннему t-критерию Стьюдента для независимых групп. Различия считали статистически значимыми при значениях p<0,05. Для оценки статистической значимости различий между долями использовали двусторонний вариант точного критерия Фишера [4].
Результаты и их обсуждение. Результаты лазерной допплеровской флоуметрии в костной ткани проксимального метафиза бедра позволили установить статистически значимо более низкий уровень микроциркуляции в костной ткани у крыс с экспериментальным остеопорозом (58,75±3,76 ПЕ) по сравнению с контрольными животными (99,91±3,41 ПЕ). В группе контрольных животных получили ГОД=і,28±0,і8, в группе крыс с экспериментальным остеопорозом ЮД=2,57±0,23.
Остеопоротические изменения в бедренных костях были подтверждены у всех крыс через двенадцать недель после овариэктомии. В ходе исследования в гистологических препаратах крыс с экспериментальным остеопорозом были обнаружены травматические микроповреждения в виде переломов отдельных костных трабекул (рис. і). О том, что микропереломы трабекул возникали не по причине повреждения во время забора биоматериала или изготовления микропрепаратов, а прижизненно, можно судить по прорастанию волокон соединительной ткани в месте микроперелома.
йг 'і
</Л.
*
* Ж’
ш
гк
{:жША- жш Як *
V
Рис. 1. Гистологическая картина микроархитектоники проксимального метафиза бедренной кости у крысы с экспериментальным остеопорозом.
Примечание: * - микроперелом костной трабекулы (окр. гематоксилин-эозином, ув. 800)
Объективной мерой оценки развития экспериментального остеопороза через двенадцать недель после билатеральной овариэктомии стало статистически значимое уменьшение средней ширины костных трабекул в проксимальном метафизе бедренной кости, которая у крыс с остеопорозом была меньше показателя контрольных животных на 43,4% (рис. 2).
120 100 80
мкм 60 40 20 0
Рис. 2. Показатели средней ширины костных трабекул в проксимальном метафизе бедренной кости у крыс без остеопороза и животных с остеопорозом.
Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой контрольных животных
Таким образом, через двенадцать недель после проведения билатеральной овариэктомии у белых крыс-самок Вистар развивается системная дисфункция эндотелия сосудов, частным проявлением которой является нарушение функционирования эндотелиоцитов сосудов микроциркуляторно-го русла костной ткани. Следствием нарушения функционирования эндотелия костных сосудов является снижение показателей регионарной микроциркуляции в костной ткани, приводящее к дисбалансу процессов костного ремоделирования и, следовательно, возникновению и развитию остеопороти-ческих изменений, сопровождающихся истончением костных трабекул и возникновением в них микропереломов. Это позволило нам прийти к заключению о том, что нарушение функции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани играет значительную роль в патогенезе остеопороза.
При выполнении лазерной доплеровской флоуметрии было обнаружено, что у крыс после овариэктомии, которым проводилась терапия Ь-аргинином и комбинациями Ь-аргинина с эналапри-лом и лозартаном, происходит предупреждение снижения уровня микроциркуляции в проксимальном метафизе бедра у крыс через двенадцать недель после овариэктомии (рис. 3). Причем уровни микроциркуляции у животных, получавших комбинацию Ь-аргинина с эналаприлом, превышали показатели животных с остеопорозом, а также крыс, получавших Кальций-Дз Никомед, однако не отличались от результатов в группе с монотерапией Ь-аргинином (р=0,557). Результаты ЛДФ в группе
98,51
55,77*
1
Контроль Остеопороз
крыс, получавших Ь-аргинин и лозартан, превышали значения микроциркуляции в группе с монотерапией Ь-аргинином (р=0,042).
Контроль Остеопороз Кальций-Д3 L-аргинин L-аргинин L-аргинин
Никомед +эналаприл +лозартан
Рис. 3. Результаты влияния комбинаций Ь-аргинина с эналаприлом и лозартаном на микроциркуляцию в проксимальном метафизе бедра у крыс. Примечание: * - р<0,05 по сравнению с группой контрольных животных;
** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с остеопорозом
Также было установлено, что комбинации Ь-аргинина с эналаприлом и лозартаном снижали КЭД до значений 1,б1±0,18 и 1,55±0,1б соответственно. Значения КЭД у крыс, получавших комбинированную терапию, не отличались достоверно от результатов расчета КЭД в группе животных с монотерапией Ь-аргинином (рис. 4).
Контроль Остеопороз Кальций-Д3 Ь-аргинин Ь-аргинин Ь-аргинин
Никомед +эналаприл +лозартан
Рис. 4. Результаты влияния комбинаций Ь-аргинина с эналаприлом и лозартаном на коэффициент эндотелиальной дисфункции, рассчитанный на основании данных лазерной допплеровской флоуметрии в костной ткани Примечание: * - р<0,05 по сравнению с группой контрольных животных;
** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с остеопорозом
В результате изучения гистологических препаратов бедренных костей крыс, получавших Ь-аргинин в комбинациях с эналаприлом и лозартаном, обнаружили сохранную микроархитектонику и большую ширину костных трабекул, чем у крыс с остеопорозом. Обнаружили, что комбинации Ь-аргинина с эналаприлом и лозартаном частично предотвращали истончение костных трабекул, однако средняя ширина трабекул не достигала значений контрольных крыс (рис. 5). Показатели средней ширины костных трабекул в проксимальном метафизе бедра у крыс, получавших Ь-аргинин в комбинации с эналаприлом, достоверно не отличались от показателей крыс, получавших Ь-аргинин в качестве монотерапии (р=0,228), а у крыс, получавших Ь-аргинин в комбинации с лозартаном, статистически значимо отличались не только от значений животных с остеопорозом и крыс, получавших Кальций-Д3 Никомед, но также и от значений крыс, получавших Ь-аргинин в качестве монотерапии (р=0,019).
120 100 80
мкм 60 40 20 0
Контроль Остеопороз Кальций-ДЗ L-аргинин ^аргинин L-аргинин
Никомед +эналаприл +лозартан
Рис. 5. Результаты влияния комбинаций Ь-аргинина с эналаприлом и лозартаном на среднюю ширину костных трабекул в проксимальном метафизе бедренной кости у крыс. Примечание: * - р<0,05 по сравнению с группой контрольных животных;
** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с остеопорозом
Таким образом, Ь-аргинин и комбинации Ь-аргинина с эналаприлом и лозартаном, обладая эндотелиопротективной активностью, предотвращают снижение уровня микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедра. Это позволяет поддерживать на должном уровне нарушенное при остеопорозе протекание процессов костного ремоделирования, свидетельством чего является сохранение микроархитектоники костной ткани, а именно замедление истончения и предотвращение возникновения микропереломов костных трабекул. Наибольшая степень выраженности фармакологической активности на выбранной модели патологии была отмечена у комбинации Ь-аргинина с лозартаном.
В адекватности протекания процессов костного ремоделирования и репаративной регенерации ключевая роль принадлежит правильному функционированию микроциркуляторного русла костной ткани. При ухудшении кровоснабжения кости наблюдаются различные остеологические заболевания, такие как остеонекроз, остеомиелит или остеопороз [11, 15].
В свою очередь, центральным звеном в обеспечении адекватного функционирования зрелой сосудистой сети костной ткани является эндотелий - основной регуляторный момент межтканевых взаимодействий.
Следовательно, от полноценности функционирования эндотелиоцитов, в том числе в микроциркуляторном русле костной ткани, зависит как общее состояние регионарной микроциркуляции кости, так и процессы физиологического ремоделирования костной ткани и результаты репаративной регенерации повреждений. Данные рассуждения подтверждаются результатами работ ряда авторов, свидетельствующих, например, о том, что фактор роста эндотелия сосудов (ключевой регулятор каскада событий, приводящих к формированию и развитию сосудистой системы) играет значительную роль в процессах ремоделирования [12, 17] и репарации повреждений [13] костной ткани.
На основании изложенного в ходе выполнения исследования мы придерживались рабочей гипотезы, согласно которой качество процессов ремоделирования и репаративной регенерации костной ткани находится в прямой зависимости от качества функционирования эндотелия сосудов, определяющего уровень регионарной микроциркуляции в костной ткани.
В настоящее время не прекращается поиск и изучение новых препаратов, обладающих эндо-телиопротективными свойствами. Стоит отметить, что отдельного класса лекарственных средств для специфической коррекции дисфункции эндотелия в настоящее время не выделено, в связи, с чем внимание экспериментаторов привлекают представители различных фармакологических групп препаратов, обладающих плейотропной эндотелиопротективной активностью.
По нашему мнению, наибольшего внимания заслуживает Ь-аргинин - аминокислота, являющаяся в организме субстратом для синтеза оксида азота - основного медиатора функционирования эндотелиальной системы [5, 9]. Кроме того, такие препараты, как представители ингибиторов АПФ и блокаторов ангиотензиновых рецепторов, а именно эналаприл и лозартан [3, 8], обладающие положительным влиянием на функцию эндотелия, способны, на наш взгляд, вступать с Ь-аргинином в положительное фармакодинамическое взаимодействие в отношении остеопротективного эффекта.
Выводы:
1. Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг на модели экспериментального остеопороза обладает выраженным эндотелиопротективным действием, проявляющимся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, предотвращает снижение уровня микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедренной кости, удерживая его на значениях, статистически значимо превышающих показатели в группе крыс с экспериментальным остеопорозом без лечения и получавших Кальций-Дз Никомед в дозе 85,7 мг/кг, а также, увеличивая среднюю ширину костных трабекул по
98,51
55,77* 58ДЗ 60,24** 61,94** 4,01**
•У///Л 'ОООООч ■
- И
сравнению с крысами с остеопорозом и предотвращая возникновение микропереломов, обладает остеопротективным действием.
2. Комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг и эналаприла в дозе 0,5 мг/кг на модели экспериментального остеопороза, обладая выраженным эндотелиопротективным действием, предотвращает повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции; комбинация препаратов эффективно повышает показатели кровотока в костной ткани проксимального метафиза бедра, удерживая их на уровне, статистически значимо превышающем значения в группах крыс с экспериментальным остеопорозом без лечения и получавших Кальций-Дз Никомед в дозе 85,7 мг/кг, и обладает выраженным остеопротективным действием, увеличивая среднюю ширину костных трабекул в проксимальном ме-тафизе бедренной кости.
3. Комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг и лозартана в дозе 6 мг/кг на модели экспериментального остеопороза обладает выраженным эндотелиопротективным действием - значительно снижает коэффициент эндотелиальной дисфункции; комбинация препаратов эффективно предотвращает снижение микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедра, в большей степени, чем монотерапия L-аргинином в дозе 200 мг/кг, приближая ее значения к показателям контрольных животных, и имеет более выраженное остеопротективное действие, чем Кальций-Дз Никомед в дозе 85,7 мг/кг и L-аргинин в дозе 200 мг/кг, достоверно увеличивая среднюю ширину костных трабекул проксимального метафиза бедра.
Исследование выполнено при поддержке гранта Президента Российской федерации МК-3136.2014.4.
Литература
1. Беневоленская, Л.И. Проблема остеопороза в современной медицине / Л.И. Беневоленская // Consilium Medicum. - 2004. - Т. 6, № 2. - С. 8-11.
2. Верткин, А.Д. Распространенность и течение остеопороза у пациентов с сердечно'-сосудистыми заболеваниями / А.Д. Верткин, А.В. Наумов, В.С. Иванов [и др.] // Соврем. ревматология. - 2008. - № 1. - С. 52-59.
3. Гудырев, О.С. Остеопротективное действие эналаприла и лозартана при экспериментальном осте-опорозе и переломах на его фоне : автореф. дис. ... канд. мед. наук : 14.00.25 / О.С. Гудырев ; Курск. гос. мед. ун-т. - Курск, 2009. - 22 с.
4. Плавинский, С.Л. О людях и цифрах. Обучение статистике: чему, кого и как учить? / С.Л. Плавин-ский // Междунар. журн. мед. практики. - 2006. - Вып. 2. - С. 9-16.
5. Покровская, Т.Г. Комбинированная фармакологическая коррекция метаболического пути L-аргинина/NO при моделировании дефицита оксида азота : автореф. дис. ... д-ра биол. наук : 14.00.25 / Т.Г. Покровская ; Курск. гос. мед. ун-т. - Курск, 2009. - 42 с.
6. Скрипникова, И.А. Взаимосвязь сердечно-сосудистых заболеваний, обусловленных атеросклерозом, и остеопороза у женщин в постменопаузе / И.А. Скрипникова / / Соврем. ревматология. - 2008. - № 1. - С. 41-47.
7. Стабровская, Н.В. Исследование эндотелио - и остеопротективных эффектов некоторых антиоксидантов : автореф. дис. ... канд. мед. наук : 14.03.06 / Н.В.Стабровская ; Курск. гос. мед. ун-т. - Курск, 2011. - 22 с.
8. Файтельсон, А.В. Сравнительная оценка остеопротективного действия резвератрола и комбинации резвератрола с эналаприлом при лечении экспериментального остеопороза / А.В. Файтельсон, Н.Ю. Коклина, О.С. Гудырев, [и др.] // Журнал «Экспериментальная и клиническая фармакология». - Москва. - Издательство «Фолиум». - 2012. - том 75, № 5, С 35-38.
9. Acute intravenous L-arginine infusion decreases endothelin-1 levels and improves endothelial function in patients with angina pectoris and normal coronary arteriograms: Correlation with asymmetric dimethy-largininc / P. Piatti, G. Fragasso, L.D. Monti [et al.] / / Circulation. - 2003. - Vol. 107. - P. 429-436.
10. Carano, R.A. Angiogenesis and bone repair / R.A. Carano, E.H. Filvaroff // Drug Discov. Today. - 2003. -Vol. 8. - P. 980-989.
11. Changes in trabecular bone, hematopoiesis and bone marrow vessels in aplastic anemia, primary osteoporosis, and old age: a comparative histomorphometric study / R. Burkhardt, G. Kettner, W. Bohm et al. // Bone. - 1987. -Vol. 8. - P. 157-164.
12. Effect of human endothelial cells on human bone marrow stromal cell phenotype: role of VEGF? / F. Villars, L. Bordenave, R. Bareille, J. Amedee // J. Cell. Biochem. - 2000. - Vol. 79. - P. 672-685.
13. Frost, H. M. The Microdamage (MDx) Connection // Frost H. M. The Utah Paradigm of Skeletal Physiology. - Athens, Greece ; ISMNI. - 2004. -Vol. 1, N 4. - P.208-219.
14. Madeddu, P. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for tissue regeneration / P. Madeddu // Exp. Physiol. - 2005. - Vol. 90. - P. 315-326.
15. Role of vascular factors in osteoporosis / K. Alagiakrishnan, A. Juby, D. Hanley et al. // J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. - 2003. - Vol. 58. - P. 362-366.
16. Streeten, E.A. Biology of bone endothelial cells / E.A. Streeten, M. L. Brandi // Bone Miner. - 1990. -Vol. 10. - P. 85-94.
17. Vascular endothelial growth factor is expressed along with its receptors during the healing process of bone and bone marrow after drill-hole injury in rats / S. Uchida, A. Sakai, H. Kudo [et al.] / / Bone. - 2003. - Vol. 32. -P. 491-501.
THE STUDY OF INFLUENCE OF L-ARGININE AND ITS COMBINATIONS WITH ENALAPRIL AND LOSARTAN ON BONE MODELING IN THE EXPERIMENT
In experiment on white Wistar female rats the osteoprotective action of L-arginine and its combinations with enalapril and losartan was investigated on experimental osteoporosis model. L-arginine and its combinations with enalapril and losartan prevented a microcirculation level depression in an osteal tissue, that leading to retardation of an osteal trabecules thinning and to prevention of occurrence of microfractures.
Key words: osteoporosis, microcirculation, endothelial dysfunction, enalapril, losartan, L-arginine.
e-mail: [email protected]
D.S.R. RAJKUMAR1 O.S. GUDYREV2 A.V. FAITELSON1 M.V. POKROVSKIY2 L.V. KOROKINA2
1)Kursk State Medical University
2)Belgorod National Research University
