CC BY
90
УДК 616.71-007.234:615.22
ПРОТЕКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭНАЛАПРИЛА И ЛОЗАРТАНА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ
ОСТЕОПОРОЗЕ
©Гудырев О.С., Файтельсон А.В., Покровский М.В., Дубровин Г.М., Иванов А.В., Павлова Т.В.,
Коклина Н.Ю., Корокин М.В., Белоус А.С.
Кафедра фармакологии, НИИ экологической медицины Курского государственного медицинского университета, Курск; кафедра патологии Белгородского государственного университета, Белгород
E-mail: gudyrev@mail.ru
В результате исследования было продемонстрировано, что через восемь недель после проведения овариэктомии у самок белых крыс линии Вистар развивается нарушение функции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани и ухудшение регионарного кровотока в кости, приводящее к возникновению генерализованного осте-опороза. Эналаприл и лозартан, обладая эндотелиопротективным действием, эффективно предотвращали снижение уровня регионарной микроциркуляции в костной ткани, сохраняя его на уровне интактных крыс. Это позволило поддержать на адекватном уровне процессы костного ремоделирования, что проявилось в замедлении истончения костных трабекул и предотвращении возникновения в них микропереломов.
Ключевые слова: остеопороз, микроциркуляция, эндотелиальная дисфункция, ингибитор ангиотензин -превращающего фермента, эналаприл, блокатор ангиотензиновых рецепторов, лозартан.
PROTECTIVE ACTION OF ENALAPRIL AND LOSARTAN AT EXPERIMENTAL OSTEOPOROSIS Gudyrev O.S., Faitelson A. V., Pokrovskiy M. V., Dubrovin G.M., Ivanov A. V., Pavlova T. V., Koklina N. Yu., Korokin M. V.,
Belous A.S.
Pharmacology Department, SRI of Environmental Medicine of the Kursk State Medical University, Kursk;
Pathology Department of the Belgorod State University, Belgorod
During an investigation it has been shown, that in eight weeks after ovariectomy at females of white Wistar rats the disturbance of an osteal tissue endothelium function and deterioration of regional blood flow in a bone develops, resulting to occurrence of a generalized osteoporosis. Enalapril and Losartan, possessing the endothelioprotective action, effectively prevented a regional microcirculation level depression in an osteal tissue, conserving it at level of intact rats. It has allowed to sustain at adequate level processes of an osteal remodeling, that has shown in retardation of an osteal trabecules thinning and prevention of microfractures occurrence in them.
Keywords: osteoporosis, microcirculation, endothelial dysfunction, angiotensin converting enzyme inhibitor, Enalapril, angiotensin receptors blocker, Losartan.
В основе развития остеопороза лежит дисбаланс между двумя основными процессами костного ремоделирования: костной резорбцией и костеобразованием [1, 3]. Важным звеном в патогенезе остеопороза является снижение кровоснабжения кости [8], приводящее к торможению активности остеобластов, а также к усиленной деятельности остеокластов.
Как известно, строение микроциркуляторного русла костной ткани существенно отличается от морфологии сосудистого русла остальных тканей организма. Костные микрососуды имеют только эндотелий и не имеют мышечного и соединительнотканого слоев. Следовательно, именно эндотелий опосредует всю гуморальную регуляцию обмена между клетками костной ткани и кровью. В то же время в доступной литературе отсутствуют сведения о том, чтобы кто-либо использовал эндотелий сосудов костной ткани в качестве мишени для целенаправленного фармакологиче-
ского воздействия при остеопоротических изменениях.
По нашему мнению, одной из причин ухудшения регионарного кровоснабжения является эндотелиальная дисфункция (ЭД), которая посредством негативного влияния на микроциркуляцию может приводить к нарушению процессов остеогенеза и остеорепарации, вызывая остеопо-роз.
Увеличение частоты остеопороза и его осложнений показывает, что в настоящее время нет надежных методов медикаментозного лечения и профилактики этого заболевания. В современной патогенетической терапии остеопороза не уделяется должного внимания препаратам, обладающим положительным влиянием на кровоснабжение костной ткани. Это указывает на актуальность изучения остеопротективного действия препаратов с доказанными положительными эн-дотелиотропными эффектами: эналаприла и ло-
зартана, в чем и заключалась цель данного исследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводили на 142 самках белых крыс линии Вистар массой 250±50 г. Для моделирования системного остеопороза крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг и проводили операцию билатеральной овариэктомии [10]. Развитие генерализованного остеопороза оценивали через восемь недель (на 57-й день) после проведения операции.
Уровень микроциркуляции оценивали в ткани проксимального метафиза бедренной кости. Для этого животное фиксировали на столике для хирургических манипуляций [7] и после засверли-вания в бедре отверстия глубиной 2,5-3 мм в него с целью стабилизации датчика, используемого для измерения микроциркуляции в кости, вводили стержень-кондуктор [6]. Для получения данных микроциркуляции в кости использовали оборудование компании Biopac systems: полиграф MP100 с модулем лазерной допплеровской фло-уметрии (ЛДФ) LDF100C и датчиком TSD144.
После измерения внутрикостного уровня микроциркуляции проводили пробы на эндоте-лийзависимую вазодилатацию (ЭЗВД) в ответ на болюсное внутривенное введение раствора аце-тилхолина в дозе 40 мкг/кг [9] и эндотелийнеза-висимую вазодилатацию (ЭНВД) в ответ на болюсное введение раствора нитропруссида натрия в дозе 30 мкг/кг [2]. Регистрация результатов ЛДФ производилась программой AcqKnowledge версии 3.8.1., значения микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕ).
Для подтверждения развития генерализованного остеопороза и в комплексной оценке эффективности исследуемых препаратов проводили морфологическое исследование проксимальных метафизов бедренной и плечевой костей, а также тел поясничных позвонков. Предметные стекла с гистологическими препаратами подвергали световой микроскопии (увеличение х100: объектив х10, окуляр х10) и фотографировали костные балки путем сопоставления объектива фотокамеры и окуляра микроскопа.
Для проведения гистоморфометрии костной ткани использовали программу ImageJ версии 1.39, предварительно откалиброванную следующим образом. Используя то же оборудование, что и для получения фотографий костных трабекул, сфотографировали «линейку» длиной 1 мм. Измерив в программе ImageJ «линейку» в пикселях, приняли расстояние в 1425 пикселей равным
1 мм. В дальнейшем программно измеряли ширину костных трабекул и выражали ее в микрометрах.
Для изучения остеопротективного действия нами были выбраны препараты, эндотелиопро-тективное действие которых было доказано в ходе ранее проведенных исследований в лаборатории кардиофармакологии НИИ экологической медицины КГМУ: эналаприла малеат и лозартан калия. Ингибитор АПФ эналаприла малеат и бло-катор АТ1-рецепторов лозартан калия («Ре-ниприл» и «Блоктран» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск) использовали в дозах 0,5 мг/кг и 6 мг/кг соответственно, что соответствует данным доступной литературы и выявляет эффективное эндотелиопротективное действие данных препаратов в экспериментах, ранее проведенных в нашей лаборатории. При изучении влияния препаратов на течение осте-опороза последние вводили ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно на 1% крахмальном клейстере в течение восьми недель.
Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel. «Описательная статистика» применялась для нахождения среднего значения (M) и ошибки среднего (m). «Двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями» использовался для сравнения показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними. Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего p<0,05. Зависимость между различными параметрами внутри одной группы оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона (r).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты ЛДФ позволили констатировать достоверно более низкий уровень микроциркуляции в костной ткани у крыс через восемь недель после овариэктомии (61,5±3,7 ПЕ; n=42) по сравнению с интактными животными (100,5±4,4 ПЕ; n=30).
В ответ на системное введение ацетилхолина и нитропруссида наблюдали снижение микроциркуляции с последующей нормализацией показателей кровотока. Так, уменьшение уровня микроциркуляции при проведении пробы ЭЗВД в группе интактных животных в среднем составило 46,7±3,8% от исходных показателей, в группе крыс с экспериментальным остеопорозом -38,9±3,8%. При проведении реакции ЭНВД уровень микроциркуляции в группе интактных крыс снизился в среднем на 29,0±3,5% от исходного
значения, в группе животных с генерализованным остеопорозом - на 27,3±5,3%.
Основным недостатком оценки результатов данных проб явилось то, что степень снижения микроциркуляции во многом определяется исходным уровнем кровотока в метафизе бедренной кости. Поэтому для объективной оценки развития нарушения функции эндотелия при генерализованном остеопорозе рассчитывали коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) на основе данных ЛДФ в кости. Для этого определяли площади прямоугольных треугольников над кривыми восстановления микроциркуляции после проведения реакций ЭЗВД и ЭНВД. При этом за меньший из катетов треугольника принимали абсолютную величину падения уровня микроциркуляции, за больший - время восстановления и стабилизации показателя микроциркуляции. КЭД рассчитывался как отношение площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение нитропруссида к площади треугольника над кривой восстановления мик-
роциркуляции в ответ на введение ацетилхоли-на [4].
В группе интактных животных получили КЭД=1,3±0,2, в группе крыс с экспериментальным остеопорозом КЭД=2,4±0,2.
Генерализованные остеопоротические изменения в костях скелета были гистологически подтверждены у всех крыс через восемь недель после овариэктомии: наблюдалось истончение костных трабекул и расширение межтрабекулярного пространства (рис. 1). Кроме того, в отдельных гистологических препаратах отмечались микропереломы костных трабекул. О прижизненном возникновении микропереломов судили по прорастанию соединительной ткани в месте перелома трабекулы.
Объективной мерой оценки развития генерализованного остеопороза через восемь недель после билатеральной овариэктомии стало достоверное уменьшение средней ширины костных трабекул во всех изучаемых локализациях (рис. 2).
Рис. 1. Морфологическая картина срезов костей скелета (окр. гематоксилин-эозином, ув. 100).
Примечание. 1, 2 - проксимальный метафиз бедра у интактной крысы и крысы с остеопорозом; 3, 4 - проксимальный метафиз плеча у интактной крысы и крысы с остеопорозом; 5, 6 - тело поясничного позвонка у интактной крысы и крысы с остеопорозом.
12O
1OO
BO
мкм 6O 4O 2O O
65,0
50,1*
Бедро
□ Интактные
Плечо
■ Остеопороз
Тело позвонка
Рис. 2. Средняя ширина костных трабекул у интактных крыс и животных с остеопорозом в различных локализациях.
Примечание: * - p<0,05 по сравнению с группой интактных животных.
Так, средняя ширина костной трабекулы у крыс с экспериментальным остеопорозом в проксимальном метафизе бедра была меньше показателя интактных животных на 36,8%. Та же тенденция наблюдалась в проксимальном метафизе плеча: средняя ширина костной трабекулы у ин-тактных животных превышала таковую у крыс с остеопорозом на 37,8%. Наиболее ярко патологические процессы были выражены в телах поясничных позвонков крыс с генерализованным остеопорозом: различие между группами животных в средней ширине костной трабекулы в данной локализации составило 43,7%.
Изучая индивидуальные показатели микроциркуляции и средней ширины костной трабекулы в проксимальном метафизе бедренной кости в обеих группах животных, обратили внимание на наличие определенной зависимости между двумя указанными параметрами. Для подтверждения наличия таковой зависимости рассчитали коэффициент корреляции Пирсона (r) между уровнем микроциркуляции и средней шириной костной трабекулы в обеих группах. Получили следующие значения: в группе интактных животных r=0,7, в группе крыс с остеопорозом r=0,6. Данные значения коэффициента свидетельствуют о наличии достаточно тесной прямой зависимости между уровнем микроциркуляции и средней шириной костной трабекулы в проксимальном метафизе бедра у крыс в обеих группах.
При анализе активности изучаемых препаратов было обнаружено, что эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан 6 мг/кг эффективно предотвращали снижение уровня регионарного кровотока в костной ткани бедра, сохраняя значения микроциркуляции на уровне интактных крыс: результаты ЛДФ в группах крыс, получавших эналаприл (93,3±4,4; n=35) и лозартан (100,0±2,3; n=35), не отличались от таковых у интактных животных (p=0,252 и p=0,926 соответственно) и не различались между собой (p=0,181), а также достоверно
отличались от показателей в группе крыс с осте-опорозом.
Было выявлено, что эналаприл и лозартан приводили пропорции между площадями треугольников над кривыми восстановления уровня микроциркуляции в кости в ответ на введение нитропруссида и ацетилхолина к таковым у ин-тактных животных. Тем самым изучаемые препараты достоверно снижали КЭД до значений 1,6±0,1 и 1,5±0,2 соответственно.
При световой микроскопии срезов костей скелета у крыс, получавших лечение, обнаружили сохранение структуры костной ткани и большую ширину костных трабекул, чем у крыс с остеопо-розом, не получавших лечения, во всех исследуемых локализациях. Выявили, что эналаприл и ло-зартан препятствовали снижению средней ширины костной трабекулы до уровня животных с экспериментальным остеопорозом в исследуемых локализациях, однако средняя ширина трабекул не достигала значения интактных крыс (рис. 3).
Эналаприл и лозартан оказывали статистически значимое влияние на среднюю ширину костных трабекул во всех изучаемых локализациях: эналаприл увеличивал ширину трабекул в среднем на 29,5%, лозартан - на 45,9% по сравнению с крысами, страдающими остеопорозом.
В группах крыс, получавших исследуемые препараты, нами также было выявлено и подтверждено наличие прямой зависимости между уровнем микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедра и средней шириной костной трабекулы в данной зоне. Коэффициент корреляции Пирсона (r) между указанными параметрами у крыс, получавших эналаприл, составил
0,4, у получавших лозартан - 0,8.
Таким образом, через восемь недель после проведения билатеральной овариэктомии у самок белых крыс линии Вистар развивается системная эндотелиальная дисфункция [5], частным проявлением которой является нарушение функции
80 70
60
50
мкм 40 30 20 10 0
□ Интактные ■ Остеопороз 0 ОП+Эналаприл 0,5 мг/кг И ОП+Лозартан 6 мг/кг
Рис. 3. Влияние эналаприла и лозартана на значение средней ширины костной трабекулы через 8 недель после билатеральной овариэктомии.
Примечание. 1 - в проксимальном метафизе бедренной кости;
2 - в проксимальном метафизе плечевой кости;
3 - в телах поясничных позвонков;
* - p<0,05 по сравнению с группой интактных животных;
** - p<0,05 по сравнению с группой крыс с остеопорозом.
эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани. Свидетельством этого является увеличение коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного по результатам проведения ЛДФ в костной ткани по сравнению с интакт-ными животными. Как следствие, отмечается значительное ухудшение регионарного кровотока в костной ткани, приводящее к дисбалансу процессов костного ремоделирования и, в конечном счете, возникновению и развитию генерализованного остеопороза, сопровождающегося истончением костных трабекул и возникновением в них микропереломов. Подтверждением данному положению служит наличие прямой тесной зависимости между уровнем микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедренной кости и шириной костных трабекул в данной локализации у крыс.
Это позволило нам прийти к выводу о значительной роли нарушения функции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани в развитии генерализованного остеопороза. Следовательно, подтвердилась актуальность исследования остеопротективного действия наиболее часто применяемых в настоящее время препаратов с доказанной эндотелиотропной активностью.
В ходе эксперимента было установлено, что эналаприл в дозе 0,5 мг/кг и лозартан в дозе 6 мг/кг через восемь недель после билатеральной овариэктомии, обладая эндотелиопротективным действием, что выражалось в усилении эндоте-лийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции по данным ЛДФ до уровня интактных животных, эффективно предотвращали снижение уровня регионарной микроциркуляции в костной ткани, сохраняя его на уровне интактных крыс.
Это позволило поддержать на адекватном уровне процессы костного ремоделирования при развивающемся генерализованном остеопорозе, свидетельством чего явилось замедление истончения костных трабекул в губчатой костной ткани и предотвращение возникновения микропереломов трабекул. При этом достоверно более выраженным остеопротективным действием обладал лозартан, что может объясняться большим, нежели у эналаприла, сродством препарата к ренин-ангиотензин-альдостероновой системе.
В свете указанного представляются перспективными возможности разработки и изучения различных моделей остеопороза (гипоэстроген-индуцированной, глюкокортикоидной, гиперго-
моцистеинемической, ЛБЫЛ-опосредованной, комбинированной), поиска новых патогенетических звеньев развития остеопоротических изменений костей, а также путей их эндотелий-опосредованной фармакологической коррекции препаратами различных групп, в том числе и при остеопоротических переломах костей скелета.
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Через восемь недель после билатеральной овариэктомии у самок крыс линии Вистар развивается нарушение функции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани, свидетельством чего является увеличение коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного по результатам лазерной допплеровской фло-уметрии в костной ткани, до 2,4±0,2 по сравнению с 1,3±0,2 у интактных животных. Значительно ухудшается регионарный кровоток в костной ткани (61,5±3,7 ПЕ по сравнению с 100,5±4,4 ПЕ у интактных крыс), что приводит к развитию генерализованного остеопороза, сопровождающегося истончением костных трабекул в среднем на 39,4% и возникновением в них микропереломов.
2. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг на модели билатеральной овариэктомии имеет выраженное эндо-телиопротективное действие, проявляющееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции до 1,6±0,1, предотвращает снижение уровня микроциркуляции в костной ткани бедра, удерживая его на значениях, не отличающихся от интактных крыс (93,3±4,5 ПЕ), а также увеличивая ширину костных трабекул в среднем на 29,5% по сравнению с группой крыс с остеопорозом и предотвращая возникновение микропереломов, обладает остеопротективным действием.
3. Лозартан в дозе 6 мг/кг на модели билатеральной овариэктомии, обладая выраженным эн-дотелиопротективным действием, снижает коэффициент эндотелиальной дисфункции до 1,5±0,2; препарат эффективно предотвращает снижение показателей кровотока в костной ткани бедра, удерживая его на уровне интактных животных (100,0±2,3 ПЕ), и имеет более выраженное остеопротективное действие, чем эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, увеличивая ширину костных трабекул в среднем на 45,9%.
ЛИТЕРАТУРА
1. Беневоленская Л.И. Руководство по остеопорозу.-М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003. — 524 с.
2. Галаган М.Е., Широколова А.В., Ванин А.Ф. Гипотензивное действие оксида азота, продуцируемого из экзо- и эндогенных источников // Вопр. мед. химии, - 1991. - Т. 37, № 1. - С. 67-70.
3. Насонов Е.Л. Вторичный остеопороз: патогенез и клиническое значение при воспалительных заболеваниях суставов // Остеопороз и остеопатии. -1998. - № 3. - С. 18-20.
4. Покровский М.В., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И. и др. Пат. 2301015 Российская Федерация, МПК7 А61В 5/02. Способ оценки эндотелиальной дисфункции / заявители и патентообладатели Покровский М.В., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И. -№ 2005113243/14; заявл. 04.05.2005; опубл.
20.06.07, Бюл. № 17. - 7 с.: ил.
5. Способы экспериментального моделирования эндотелиальной дисфункции / М.В. Корокин, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова и др. // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9., № 3. -С. 327.
6. Файтельсон А.В., Гудырев О.С., Дубровин Г.М. и др. Пат. 62505 Российская Федерация, МПК7 А61В 17/68. Канюлированный стержень-кондуктор для проведения экспериментальных измерений / заявители и патентообладатели Фай-тельсон А.В., Гудырев О.С. - № 2006144474/22; заявл. 13.12.06; опубл. 27.04.07, Бюл. № 12. - 3 с.: ил.
7. Файтельсон А.В., Гудырев О.С., Дубровин Г.М. и др. Пат. 62512 Российская Федерация, МПК7 А6Ш 3/00. Стол для хирургических манипуляций на мелких лабораторных животных / заявители и патентообладатели Файтельсон А.В., Гудырев О.С. - № 2006144475/22; заявл. 13.12.06; опубл.
27.04.07, Бюл. № 12. - 4 с.: ил.
8. Alagiakrishnan K., Juby A., Hanley D. et al. Role of vascular factors in osteoporosis // J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. - 2003. - Vol. 58. - P. 362-366.
9. Laursen J.B., Rajagopalan S., Galis Z. Role of superoxide in angiotensin Il-induced but not catecholamine-induced hypertension // Circulation. - 1997. -Vol. 95. - P. 588-593.
10. Stimpel M., Jee W.S., Ma Y. et al. Impact of antihypertensive therapy on postmenopausal osteoporosis: effects of the angiotensin converting enzyme inhibitor moexipril, 17beta-estradiol and their combination on the ovariectomy-induced cancellous bone loss in young rats // J. Hypertens. - 1995. - Vol. 13. -P. 1852-1856.
