CC BY
39
УДК 616.71-007.234:615.22
КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА 0СТЕ0ПР0ТЕКТИВНЫХ ЭФФЕКТОВ ЭНАЛАПРИЛА, ЛОЗАРТАНА, РЕЗВЕРАТРОЛА И ИХ КОМБИНАЦИЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГЕНЕРАЛИЗОВАННОМ 0СТЕ0П0Р03Е
В эксперименте на самках белых крыс линии Вистар (202 животных) изучалось остеопротективное действие эналаприла, лозартана, резвератрола и комбинаций резвератрола с эналаприлом и лозартаном на моделях экспериментального остеопороза. Было выявлено, что после овариэктомии у крыс развивается эндотелиальная дисфункция сосудов микроциркуляторного русла костной ткани, приводящая к возникновению остеопороза. Действие эналаприла, лозартана, резвератрола и комбинированная терапия резвератрола с эналаприлом и лозартаном предотвращают снижение уровня микроциркуляции в костной ткани, что выражалось в замедлении истончения костных трабекул, и предупреждают возникновение в них микропереломов.
Ключевые слова: остеопороз, микроциркуляция, эндотелиальная дисфункция, ингибитор ангиотензин-превращающего фермента, эналаприл, фитоалексин резвератрол, блокатор ангиотензиновых рецепторов, лозартан.
Введение. Остеопороз является мультифакториальным системным заболеванием, в основе которого лежит дисбаланс между двумя процессами костного ремоделирования: резорбцией и регенерацией [4, 7], приводящий к увеличению риска переломов костей скелета. Чрезвычайная распространенность остеопоротических переломов ставит остеопороз в число приоритетных проблем современной медицины. Согласно данным ВОЗ, проблема остеопороза как причина инвалидности и смертности больных от переломов костей занимает четвертое место в мире среди неинфекционных заболеваний, уступая болезням сердечно-сосудистой системы, онкопатологии и сахарному диабету (из реферата).
Значительную роль в процессах костного ремоделирования и репаративной регенерации костной ткани играет кровоснабжение кости [4, 15]. Костные микрососуды имеют только эндотелий и не имеют мышечного и соединительнотканного слоев. Следовательно, именно эндотелий опосредует всю гуморальную регуляцию обмена между остеобластами, остеокластами и кровью [1, 9,13].
В то же время в доступной литературе мы не нашли сведений о том, чтобы кто-либо использовал эндотелий сосудов костной ткани в качестве мишени для целенаправленного фармакологического воздействия при остеопоротических изменениях. По нашему мнению, одной из причин ухудшения регионарного кровоснабжения костной ткани является эндотелиальная дисфункция, которая посредством негативного влияния на микроциркуляцию может приводить к нарушению процессов остеогенеза и остеорепарации, тем самым вызывая остеопороз. Таким образом, все изложенное свидетельствует об актуальности выбранной темы исследования.
Цель исследования: оценка остеопротективных эффектов препаратов, действующих на сосудистый эндотелий при экспериментальном гипоэстрогенном остеопорозе.
Материалы и методы. Опыты проводили на 202 самках белых крыс линии \Vistar массой 250±50 г. Все манипуляции в эксперименте выполнялись под наркозом -внутрибрюшинным введением раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг. Системный остеопороз моделировался путем двухсторонней овариэктомии [16]. Для проведения исследования животные были разделены на 7 групп: I - контрольная (интактные животные) (п = 42); ); II - после овариэктомии (п = 30) - модель остеопороза; III - после овариэктомии, ежедневно внутрижелудочно вводился эналаприл 0,5 мг/кг в течение 8 недель (п = 35); IV -после овариэктомии, в те же сроки и тем же способом вводился лозартан 6 мг/кг (п = 35); V - после овариэктомии, ежедневно внутрибрюшинно в течение 8 недель вводился резвератрол 2 мг/кг (п = 20); VI - животные в те же сроки после овариэктомии получали комбинацию препаратов: внутрибрюшинно вводился резвератрол 2 мг/кг и внутрижелудочно эналаприл
Н.Ю. КОКЛИНА1 Д.В. ФАЙТЕЛЬСОН1 О.С. ГУДЫРЕВ2 1У1.В. ПОКРОВСКИЙ2
Курский государственный медицинский университет
Белгородский государственный национальный исследовательский университет
e-mail: [email protected]
0,5 мг/кг (п = 20); VI - крысам ( п = 20) после овариэктомии проводилась терапия комбинацией резвератрола 2 мг/кг с лозартаном 6 мг/кг.
Для изучения остеопротективного действия нами были выбраны препараты с выраженными эндотелиопротективными эффектами - это ингибитор ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) эналаприл, блокатор ангиотензиновых рецепторов (AT) лозартан и фитоалексин резвератрол, а также исследовались комбинации резвератрола с эналаприлом и лозартаном [5, 6, 8].
С целью подтверждения развития остепоротических нарушений и оценки эффективности исследуемых препаратов через восемь недель (на 57"й день) после овариэктомии проводили гистоморфометрию костной ткани, при этом контрольной группой служили животные, которым выполнялась операция ложной овариэктомии. Морфологически исследовали костную ткань праксимальных метафизов бедренной и плечевой костей, а также тел поясничных позвонков [9].
Перед выведением крыс из эксперимента, через 8 недель после овариэктомии, измерялся уровень микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедренной кости [ю]. После определения внутрикостного уровня микроциркуляции проводились пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию (ЭЗВД) в ответ на однократное внутривенное введение раствора ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг [12] и эндотелийнезависимую вазодилатацию (ЭНВД) в ответ на однократное внутривенное введение раствора нитропруссида натрия в дозе 30 мкг/кг [1]. Для подтверждения роли дисфункции эндотелия в развитии нарушения регионарной микроциркуляции рассчитывался коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) на основании данных ЛДФ. В ответ на системное введение ацетилхолина и нитропруссида наблюдается снижение микроциркуляции с последующей нормализацией показателей кровотока. КЭД определялся как отношение площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение нитропруссида к площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение ацетилхолина.
Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel при помощи средств пакета анализа. «Описательная статистика» применялась для нахождения среднего значения (М) показателей и ошибки среднего (т). «Двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями» использовался для сравнения соответствующих показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними. Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего р<0,05.
Результаты. По результатам лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) было выявлено, что эналаприл, лозартан и резвератрол в качестве монотерапии эффективно предотвращали снижение уровня регионарного кровотока в костной ткани проксимального отдела бедра, сохраняя значения микроциркуляции на уровне интактных крыс. Результаты ЛДФ в группах животных, получавших эналаприл, лозартан и резвератрол, достоверно не отличались от таковых в группе интактных крыс (р=0,252, 0,926 и 0,455 соответственно) и не различались между собой, а также достоверно отличались от показателей в группе крыс с остеопорозом. Было обнаружено, что комбинированная фармакотерапия резвератролом с эналаприлом и лозартаном полностью предотвращала нарушение микроциркуляции в костной ткани, более того, уровень микроциркуляции при использовании лозартана превышал показатели интактных животных, а также показатели в группах животных, получавших лечение резвератролом, эналаприлом в качестве монотерапии (рис. l).
120 ■ 100 80 во 40 20 О
ПЕ
■ Интактные
□ Остеопороз
ЕЗ ОП+Эналаприл 0,5 мг/кг 0 ОП+Лозартан 6 мг/кг
□ ОП+Резвератрол 2 мг/кг
В ОП+Резвератрол 2 мг/кг+Эналаприл 0,5 мг/кг
□ ОП+Резвеоатоол 2 мг/кг+Лозаотан 6 мг/кг
Рис. 1. Влияние эналаприла, лозартана, резвератрола на показатели микроциркуляции в проксимальном метафизе бедренной кости у крыс.
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с группой интактных животных; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.
fcVAf>
Сравнительная оценка результатов функциональных проб показала, что резвератрол, эналаприл и лозартан в качестве монотерапии, а также комбинации резвератрола с эналаприлом и лозартаном приводили пропорции между площадями треугольников над кривыми восстановления уровня микроциркуляции в кости в ответ на внутривенное болюсное введение нитропруссида и ацетилхолина к таковым у интактных животных. Данные препараты и их комбинации статистически значимо снижали коэффициент эндотелиальной дисфункции.
Было выявлено, что эналаприл, лозартан и резвератрол в качестве монотерапии статистически значимо снижали КЭД до значений 1,6±0,1,1,5±0,2 и 1,з±о,2 соответственно. Как и в случае измерения уровня микроциркуляции в костной ткани, значения КЭД у крыс, получавших эналаприл, лозартан и резвератрол, достоверно не отличались от таковых в группе интактных животных (р>од) и не различались между собой.
Также было установлено, что комбинации резвератрола с эналаприлом и лозартаном так же, как и резвератрол, эналаприл и лозартан в качестве монотерапии, статистически значимо снижали КЭД до значений 1,2±о,1 и 1,1±о,1 соотвественно. Как и в случае измерения уровня регионарной микроциркуляции, значения КЭД у крыс, получавших комбинации резвератрола с эналаприлом и лозартаном, достоверно не отличались от таковых в группе интактных животных (р=0,705 и р=о,6б1 соответственно) и не различались между собой (р=0,894). Эти данные дают возможность предположить, что важную роль в поддержании адекватного кровоснабжения костной ткани играет сохранение функции эндотелия сосудов, питающих кость, а также удержание уровня микроциркуляции в кости на значениях, близких к значениям у интактных животных, способствует поддержанию нормального протекания процессов костного ремоделирования и препятствует развитию остеопороза.
Предложенная гипотеза подтверждается результатами гистоморфометрического исследования костей скелета у крыс, получавших в течение восьми недель после овариэктомии исследуемые препараты и их комбинации. При световой микроскопии срезов костей скелета у крыс, получавших лечение указанными препаратами, обнаружили отсутствие микропереломов трабекул, сохранение структуры костной ткани и большую ширину костных трабекул, чем у крыс с остеопорозом, не получавших лечения, во всех исследуемых локализациях (рис. 2).
Рис. 2. Морфологическая картина срезов проксимального метафиза бедренной кости (окр. гематоксилин-эозином, ув. 100).
Примечание: 1 - после овариэктомии; 2 - после овариэктомии, лечение эналаприлом; 3 - после овариэктомии, лечение лозартаном; 4 - после овариэктомии, лечение резвератролом; 5 - после овариэктомии, лечение комбинацией резвератрола с эналаприлом; 6 - после овариэктомии, лечение комбинацией резвератрола с лозартаном.
При гистоморфометрии костной ткани срезов костей скелета у крыс выявили, что эналаприл, лозартан, резвератрол и их комбинации эффективно препятствовали снижению средней ширины костных трабекул в исследуемых локализациях (рис. 3, 4, 5). Данные лекарственные средства и их комбинированное применение статистически значимо
увеличивали среднюю ширину костных трабекул во всех изучаемых локализациях. Эналаприл повышал ширину трабекул в среднем на 22%, лозартан на 45%, резвератрол на 51%, комбинация резвератрола с эналаприлом на 61% и комбинация резвератрола с лозартаном на 57% по сравнению с крысами, страдающими остеопорозом.
Показатели средней ширины костных трабекул в проксимальных метафизах бедренной и плечевой костей и в телах поясничных позвонков у крыс, получавших исследуемые препараты, статистически значимо отличались от значений как у животных с остеопорозом, так и у интактных крыс. Большей активностью обладал резвератрол и комбинированная терапия резвератролом с зналаприлом и лозартаном.
юо 8о во 40 20 О
Я Интактные
□ Остеопороз
Н ОП+Эналаприл 0,5 мг/кг ЕЗ ОП+Лозартан 6 мг/кг
□ ОП+Резвератрол 2 мг/кг ОП+Резвератрол 2 мг/кг+Эналаприл 0,5 мг/кг
□ ОП+Резвератрол 2 мг/кг+ Лозартан 6 мг/кг
Рис. 3. Сравнительная оценка эффективности влияния эналаприла, лозартана, резвератрола и их комбинаций на значение средней ширины костных трабекул в проксимальном метафизе бедренной кости.
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с группой интактных животных; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.
юо ■ 8о 6о 40 20 О
Интактные Остеопороз
ОП+Эналаприл 0,5 мг/кг ОП+Лозартан 6 мг/кг ОП+Резвератрол 2 мг/кг
ОП+Резвератрол 2 мг/кг+Эналаприл 0,5 мг/кг В ОП+Резвератрол 2 мг/кг+Лозартан 6 мг/кг
Рис. 4. Сравнительная оценка эффективности влияния эналаприла, лозартана, резвератрола на значение средней ширины костных трабекул в проксимальном метафизе плечевой кости.
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с группой интактных животных; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.
8о 70 во 50 40 зо 20 Ю О
■ Интактные
□ Остеопороз
□ ОП+Эналаприл 0,5 мг/кг БЭ ОП+Лозартан 6 мг/кг
□ ОП+Резвератрол 2 мг/кг
И ОП+Резвератрол 2 мг/кг+Эналаприл 0,5 мг/кг
□ ОП+Резвератрол 2 мг/кг+Лозартан 6 мг/кг
мкм
м км
мкм
Рис. 5. Сравнительная оценка эффективности влияния, эналаприла, лозартана, резвератрола на значение средней ширины костных трабекул в телах поясничных позвонков.
Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой интактных животных; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.
Обсуждение. Таким образом, эналаприл, лозартан и резвератрол в качестве монотерапии и при комбинированном применении через восемь недель после билатеральной овариэктомии в некоторых случаях накапливают и активируют действие оксида азота в тканях [2, з, 13, 14], тем самым влияют на эндотелий сосудов микроциркуляторного русла, то есть обладают выраженными эндотелиопротективными эффектами, которые сопровождаются снижением коэффициента эндотелиальной дисфункции, по данным лазерной допплеровской флоуметрии, до уровня интактных животных, а также эффективно предотвращают ухудшение регионарного кровотока в костной ткани, что позволяет частично компенсировать нарушения процессов костного ремоделирования при развивающемся генерализованном остеопорозе, свидетельством чего явилось замедление истончения костных трабекул в губчатой костной ткани, сохранение микроархитектоники и предотвращение возникновения микропереломов трабекул. Более выраженным данным эффектом обладал и резвератрол и его комбинации с эналаприлом и лозартаном.
Выводы.
1. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг и лозартан в дозе 6 мг/кг на выбранной модели патологии, обладая выраженными эндотелиопротективными эффектами, проявляющимися в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции до значения 1,6±0,1 и 1,5±о,2 соответственно, по сравнению с 2,4±о,2 у крыс, страдающих остеопорозом, предупреждали уменьшение средних показателей микроциркуляции в костной ткани бедра и удерживали их на значениях, не отличающихся от аналогичных параметров у интактных крыс (93,3±4,5 ПЕ и юо,о±2,з ПЕ соответственно); увеличивали среднюю ширину костных трабекул в среднем на 22% и 45% соответственно, по сравнению с группой крыс с остеопорозом, и предотвращали возникновение микропереломов, то есть обладали остеопротективным действием.
2. Резвератрол в дозе 2 мг/кг обладал выраженным эндотелиопротективным действием на модели гипоэстрогенного остеопороза, эффективно снижал коэффициент эндотелиальной дисфункции до значения 1,з±о,2, при этом предупреждал снижение уровня регионарной микроциркуляции в костной ткани бедра (91,0±12,8 ПЕ по сравнению с 61,5±3,7 ПЕ у крыс с остеопорозом) и предотвращал истончение костных трабекул (средняя ширина костных трабекул превышает показатели животных с остеопорозом на 51%), обладал остеопротективной активностью.
3. Комбинации резвератрола в дозе 2 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и с лозартаном в дозе 6 мг/кг обладали более выраженным, чем монотерапия резвератролом, эналаприлом и лозартаном, эндотелиопротективным действием: коэффициент эндотелиальной дисфункции под влиянием указанных комбинаций снижался до значений 1,2±о,1 и 1,1±о,1 соответственно; при этом наблюдались статистически значимые повышения показателей микроциркуляции в проксимальном метафизе бедра до ю8,6±19,0 ПЕ и Ю9,5±7,4 ПЕ соответственно, а также отмечались увеличения параметров средней ширины костных трабекул на 61% и 57% соответственно, что выявляло выраженный остеопротективный эффект.
Литература
1. Брошусь, В.В. Оксид азота как регулятор защитных и гомеостатических реакций организма / В.В. Брошусь // Укр. ревматол. журн. - 2003. - № 4. - С. 3-11.
2. Майчук, Е.Ю. Современные представления об использовании ингибиторов ангиотензин -превращающего фермента для лечения артериальной гипертензии / Е.Ю. Майчук, И.В. Воеводина // Рус. мед. журн.: Кардиология. - 2005. - Т. 13, № 19. - С. 1287-1291.
3. Марков, Х.М. Оксидантный стресс и дисфункция эндотелия / Х.М. Марков // Патол. физиология и эксперим. терапия. - 2005. - № 4. - С. 5-9.
4. Насонов, Е.Л. Вторичный остеопороз: патогенез и клиническое значение при воспалительных заболеваниях суставов / Е.Л. Насонов // Остеопороз и остеопатии. - 1998. - № 3. - С. 18-20.
5. Корокин, М.В. Путь фармакологической коррекции патогенетических нарушений метаболизма оксида азота при моделировании эндотелиальной дисфункции : автореф. дис.... д-ра мед. наук (14.00.25) / М.В. Корокин; Москва, 1-МГМУ. - М., 2012. - 48 с.
6. Кочкаров, В. И. Резвератрол и его комбинации с основными антигипертензивными препаратами в фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции : автореф. дис. ... д-ра биол. наук (14.00.25) / В.И. Кочкаров; Курск, КГМУ. - Курск, 2009. - 46 с.
7. Руководство по остеопорозу / под ред. Л.И. Беневоленской. - М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003. - 524 с.
8. Стабровская, Н.В. Исследование эндотелио- и остеопротективных эффектов некоторых антиоксидантов : автореф. дис. ... канд. мед. наук (14.03.Об) / Н.В. Стабровская; Курск, КГМУ. - Курск, 2011. - 22 с.
9. Остеопротективное действие эналаприла, лозартана и резвератрола при экспериментальном остеопорозе / О.С. Гудырев, А.В. Файтельсон, М.В. Покровский и др. // Научные ведомости Белгородского государственного университета. - 2011. - № 22 (117), вып. 16/2. - С. 9~14-
10. Фармакологическая коррекция экспериментального остеопороза и переломов на его фоне / А.В. Файтельсон, Г.М. Дубровин, О.С. Гудырев и др. // Вестник травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова. - 2010. - № 3. - С. 47-51.
11. Эндотелиопротективные эффекты резвератрола и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота / В.И. Кочкаров, М.В. Покровский, М.М. Корнеев и др. // Кубан. науч. мед. вестн. - 2006. - № 9 (90). - С. 150-152.
12. Changes in trabecular Ъопе, hematopoiesis and bone marrow vessels in aplastic anemia, primary osteoporosis, and old age: a comparative histomorphometric study / R. Burkhardt, G. Kettner, W. Bohm et al. // Bone. - 1987. - Vol. 8. - P. 157-164.
13. Laursen, J.B. Role of superoxide in angiotensin II-induced but catecholamine-induced hypertension / J.B. Laursen, S. Rajagopalan, Z. Galis et all. // Chirculation. Laursen. - 1997. - Vol. 95. - P. 588-593.
14. Resveratrol a red wine constituent polyphenol, prevents superoxide-dependent inflammatory responses induced by ischemia/reperfusion, platelet-activating factor, or oxidants / S. Shigematsu, S. Ishida, M. Hara et al. / Free Radic. Biol. Med. - 2003. - Vol. 34. - P. 810-817.
15. Role of vascular factors in osteoporosis / K. Alagiakrishnan, A. Juby, D. Hanley et al. //J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. - 2003. - Vol. 58. - P. 362-366.
16. Stimpel, M. Impact of antihypertensive therapy on postmenopausal osteoporosis: effects of the angiotensin converting enzyme inhibitor moexipril, l7beta-estradiol and their combination on the ovariectomy-induced cancellous bone loss in young rats / M. Stimpel, W.S. Jee, Y. Ma et al. //J. Hypertens. - 1995. - Vol. 13. -P. 1852-1856.
COMPREHENSIVE ASSESSMENT OF OSTEOPROTECTIVE EFFECTS OF ENAIAPRIL LOSARTAN, RESVERATROL AND THEIR COMRINATIONS IN EXPERIMENTAL GENERALIZED OSTEOPOROSIS
N.U. KOKLINA1 A.V. FAITELSON1 O.S.GUDYREV2 M.V. POKROVSKIY2
Kursk state medical university
*' Belgorod state national research university
e-mail: [email protected]
In experiment on white Wistar female rats (202 animals) the osteoprotective after ovariectomy the endothelial dysfunction of microcirculation vessels of osteal tissue develops, resulting in occurrence of an osteoporosis. Enalapril, losartan, resveratrol and combination resveratrol with enalapril and losartan prevented a microcirculation level depression in an osteal tissue, that has shown in retardation of an osteal trabecules thinning and in preventing the occurrence of microfractures.
Keywords: osteoporosis, microcirculation, endothelial dysfunction, angiotensin converting enzyme inhibitor, enalapril, fitoalexine resveratrol, angiotensin receptors blocker, losartan.
