CC BY
478
Для корреспонденции
Тышко Надежда Валерьевна - кандидат медицинских
наук, заведующая лабораторией оценки безопасности
биотехнологий и новых источников пищи
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14
Телефон: (495) 698-53-64
E-mail: [email protected]
Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Тимонин А.Н., Шестакова С.И., Мустафина О.К., Сото С.Х.
Изучение влияния интоксикации кадмием на модели витаминно-минеральной недостаточности у крыс
Research of the cadmium intoxication effect on the model of vitamin-mineral deficiency in rats
Tyshko N.V., Sadykova E.O., Timonin A.N., Shestakova S.I., Mustafina O.K., Soto J.C.
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва
Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety,
Moscow
В статье представлены результаты исследований, направленных на подтверждение эффективности модели снижения адаптационного потенциала крыс в условиях токсического воздействия солями кадмия. Эксперимент длительностью 65 дней проведен на самцах и самках крыс линии Вистар. Животные были разделены на 6 групп - 3 контрольные и 3 опытные по 30 самцов и самок в каждой. Всего в эксперименте было использовано 360 крыс (180 самок и 180 самцов). Животные 1-й контрольной группы получали рацион с оптимальной (75% от уровня стандартного полусинтетического рациона) дозировкой витаминов В1, В2, В3, В6 и минеральных веществ - ¥е3+ и Mg2+, животные 2-й и 3-й контрольных групп - рационы с маргинальной (30% для самцов и 28% для самок) и субмаргинальной (19% для самцов и 18% для самок) дозировками эссенциальных пищевых веществ. Животные 1-3-й опытных групп получали с кормом Сй2+ на фоне оптимальной, маргинальной и субмаргинальной обеспеченности эссенциальными микронутриентами. Были изучены гематологические, биохимические, морфологические показатели, а также состояние антиоксидантного статуса крыс. Анализ полученных результатов позволил выявить закономерности усиления эффекта токсического действия кадмия на фоне снижения обеспеченности эссенциальными микро-нутриентами (в ряду от оптимальной до субмаргинальной). Такие изменения демонстрировали эритроцитарный и тромбоцитарный профили крови, а также комплекс показателей системы антиоксидантной защиты и перекис-ного окисления липидов крови и печени. Так, активность ферментов антиокси-дантной защиты эритроцитов (глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, каталазы и супероксиддисмутазы) у крыс 1-й опытной группы была в среднем на 23% выше, чем у животных 1-й контрольной группы, у крыс 2-й и 3-й опытных групп - выше соответственно на 62 и 67%. Содержание продуктов перекисно-го окисления липидов в крови и печени самцов и самок крыс демонстрировало сходную динамику: повышение на 5% в 1-й опытной группе, на 9 и 25% - во 2-й и в 3-й опытных группах соответственно. Таким образом, предложенная модификация витаминно-минерального состава рационов может быть использована
Для цитирования: Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Тимонин АН., Шестакова С.И., Мустафина ОК., Сото С.Х. Изучение влияния интоксикации кадмием на модели витаминно-минеральной недостаточности у крыс // Вопр. питания. 2018. Т. 87. № 1. С. 63-71. doi: 10.24411/0042-88332018-10007.
Статья поступила в редакцию 24.07.2017. Принята в печать 18.12.2017.
For citation: Tyshko N.V., Sadykova E.O., Timonin A.N., Shestakova S.I., Mustafina O.K., Soto J.C. Research of the cadmium intoxication effect on the model of vitamin-mineral deficiency in rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (1): 63-71. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10007. (in Russian)
Received 24.07.2017. Accepted for publication 18.12.2017.
в качестве модели снижения адаптационного потенциала крыс в токсикологических исследованиях при изучении объектов с неизвестной токсичностью, в частности новых видов пищевой продукции.
Ключевые слова: нагрузочный тест, дефицит витаминов, адаптационный потенциал, витаминно-минеральный состав рационов, лабораторные животные, токсическая нагрузка солями кадмия
The article presents the results of the study aimed at confirmation of the effectiveness of the rats' adaptive potential reduction under conditions of cadmium salt toxic effects. The 65-days experiment was conducted in male and female Wistar rats. Animals were divided into 6 groups of 3 control and 3 experimental, 30 males and females in each. In total 360 rats were used in the experiment (180 females and 180 males). Rats of the 1st control group received a diet with optimal (75% of the standard semi-syntethic diet content) dosage of vitamins B1, B2, B3, B6 and mineral substances, Fe3+ and Mg2+, the rats of the 2nd and the 3rd control group - diets with marginal (30% for males and 28% for females) and submarginal (19% for males and 18% for females) doses of essential micronutrients. Animals of the 1-3th experimental groups received Cd2+ on the background of optimal, marginal and submarginal providing of essential micronutrients. The hematological, biochemical and morphological parameters and the antioxidant status of rats have been studied. The obtained results allowed to identify patterns of cadmium toxic effect strengthen on the background of essential nutrients reducing (in the row from optimal to submarginal). These changes showed erythrocyte and platelet blood profiles, and a set of indicators of the antioxidant defense system and lipid peroxidation of blood and liver. Thus, the activity of erythrocyte antioxidant enzymes - glutathione reductase, glutathione peroxidase, catalase and superoxide dismutase in rats of the 1st experimental group were on average by 23% higher than in animals of the 1st control group, the rats of the 2nd and the 3rd experimental groups by 62 and 67% higher, respectively. The content of lipid peroxidation products in blood and liver of male and female rats showed a similar trend: an increase by 5% in the 1st experimental group by 9 and 25% in the 2nd and 3rd experimental groups respectively. Thus, the modification of the diets' vitamin-mineral composition may be used as a model of adaptive potential reduction in rats in the toxicological research of objects with unknown toxicity, in particular novel food products.
Keywords: loading test, vitamin deficiency, adaptive potential, vitamin-mineral diet composition, laboratory animals, cadmium toxic impact
^✓снижения адаптационного потенциала организма лабораторных животных является использование рациона, дефицитного по содержанию эссенциальных пищевых веществ [1]. Данное исследование было направлено на подтверждение эффективности модели дефицита витаминов группы В (тиамина, рибофлавина, ниацина и пиридоксина), солей железа и магния, биологическая роль которых к настоящему времени хорошо известна, для использования в токсикологических исследованиях: поскольку дефицит эссенциальных веществ и связанные с ним метаболические нарушения приводят к снижению адаптационных возможностей организма [2, 3], есть все основания предполагать, что вследствие этого может повыситься чувствительность к токсическому воздействию.
О
дним из наиболее простых и эффективных способов
мени экспозиции [6] была использована доза кадмия, токсическое действие которой установлено - 1-2 мг на 1 кг массы тела в зависимости от возраста крыс (в пересчете на Сс12+).
Цели настоящей работы - подтверждение эффективности модели последовательного снижения адаптационного потенциала крыс в условиях токсического воздействия солями кадмия, а также выявление наиболее чувствительных физиолого-биохимических показателей.
Материал и методы
В качестве токсического фактора был выбран кадмий -токсический агент, действие которого на физиолого-биохимические показатели организма млекопитающих не вызывает сомнения и подробно охарактеризовано [4, 5]. На основании данных о характере проявления токсического действия в зависимости от дозы и вре-
Эксперимент длительностью 65 дней проводили на самцах и самках крыс линии Вистар, исходный возраст ~30 дней. Животные были разделены на 6 групп -3 контрольных и 3 опытных по 30 самцов и самок в каждой. Всего в эксперименте было использовано 360 крыс (180 самок и 180 самцов). Животные 1-й контрольной группы получали рацион с оптимальной (75% от уровня стандартного полусинтетического рациона) дозировкой эссенциальных микронутриентов (витаминов В1, В2, В3,
В6 и минеральных веществ - Fe3+ и Mg2+), животные 2-й и 3-й контрольных групп - рационы с маргинальной (30% для самцов и 28% для самок) и субмаргинальной (19% для самцов и 18% для самок) дозировками эссенциаль-ных веществ. Животные 1-3-й опытных групп получали с кормом Cd2+ (в виде CdCl2) на фоне оптимальной, маргинальной и субмаргинальной обеспеченности эс-сенциальными пищевыми веществами соответственно. Экспериментальные рационы, представляющие собой полусинтетический казеиновый рацион [7, 8] с модифицированным составом витаминно-минеральных смесей (табл. 1), крысы получали на протяжении всего срока исследований.
Доза кадмия различалась в зависимости от возраста крыс и составляла 1 мг на 1 кг массы тела с 0-го по 35-й день эксперимента и 2 мг на 1 кг массы тела с 36-го по 65-й день эксперимента. Для данного эксперимента были выбраны заведомо действующие дозы кадмия, не вызывающие острого токсического ответа [6]. Исходя из длительности исследования суммарная доза кадмия, которую получило каждое подопытное животное, составляла 19,1-24,3 мг у самцов и 17,2-18,9 мг у самок (в зависимости от массы тела).
Крыс содержали в пластиковых клетках (по 2 особи в клетке) с древесной подстилкой в отапливаемом (температурный режим +21-23 °С) и вентилируемом помещении с естественным освещением, доступ к корму и воде ad libitum. В течение эксперимента вели наблюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных. Массу тела измеряли еженедельно, постмор-тальную некропсию и отбор материала для гематологических и биохимических исследований проводили на 65-й день эксперимента.
Для определения гематологических показателей использовали гематологический анализатор «Coulter AcTTM 5 diff OV» и реактивы («Beckman Coulter», США). Биохимические показатели сыворотки крови определяли на биохимическом анализаторе («Konelab 20i», Финляндия) с использованием реактивов фирмы «Thermo Fisher Scientific». Активность супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы определяли спектрофотометрическим методом, содержание малонового диальдегида (МДА) в крови и печени - спек-
трофотометрическим методом по [9-17]. В статье приведены только те показатели, которые демонстрировали значимые отличия от контроля.
Результаты приведены в виде М±т, где М- выборочное среднее измеряемых величин, а т - стандартная ошибка, а также в долях (в %) или в абсолютных числах.
Полученные данные обработаны методами параметрической статистики: характер распределения количественных признаков определен с помощью х2-критерия Пирсона, равенство дисперсий - с помощью Р-крите-рия Фишера. Достоверность различий средних величин, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсии, оценивали с помощью критерия Стьюдента. Критический уровень значимости (р) принят равным 0,05 [18]. В соответствии со структурой исследования сравнивали количественные признаки опытных групп с соответствующими им контрольными группами.
Результаты и обсуждение
Общее состояние крыс контрольных и опытных групп было удовлетворительным, по внешнему виду, поведению и качеству шерстного покрова различий между группами не выявлено. Поедаемость корма самцами контрольных и опытных групп составляла ~14 г/сут на одно животное в начале эксперимента и ~21 г/сут в конце эксперимента, самками ~14 и ~16 г/сут соответственно. При анализе динамики массы тела экспериментальных животных было отмечено, что масса тела самцов и самок 1-3-й опытных групп была во всех случаях ниже, чем у соответствующих животных 1-3-й контрольных групп (в диапазоне от 3 до 12% у самцов и от 1 до 9% у самок) (см. рисунок). Следует отметить, что различия массы тела животных в контрольных группах были более выражены у самцов и варьировали от 5 до 18% и менее выражены у самок - от 9 до 11%.
При сравнении относительной массы внутренних органов самцов 1-й опытной группы с соответствующими показателями 1-й контрольной группы отмечены достоверные различия массы селезенки и легких; у животных 2-й опытной группы были выявлены различия в массе печени, почек, селезенки, сердца, мозга, семен-
Таблица 1. Модификация витаминно-минерального состава рационов
Компонент Группа, % от обеспеченности некоторыми эссенциальными веществами относительно стандартного полусинтетического казеинового рациона [7, 8]
оптимальная 75% (для самцов и самок) маргинальная субмаргинальная
30% (для самцов) 28% (для самок) 19% (для самцов) 18% (для самок)
Витамины, г на 1 кг витаминной смеси
Тиамин (В!) 3 1,2 1,12 0,76 0,72
Рибофлавин (В2) 2,25 0,9 0,84 0,57 0,54
Ниацин (В3) 11,3 4,5 4,2 2,85 2,7
Пиридоксин (В6) 3,75 1,5 1,4 0,95 0,9
Минеральные вещества, г на 1 кг солевой смеси
Магния окись 18 7,2 6,72 4,56 4,32
Железо лимоннокислое 4,545 1,818 1,6968 1,1514 1,0908
450 400 350 300 | 250 | 200 Л 150 100 50 0
0 21 42
Дни эксперимента
□ Контроль 19% □ Опыт 19% ■ Контроль 30% ■ Опыт 30% а Контроль 75% И Опыт 75%
А
Динамика массы тела самцов (А) и самок (Б)
300 250
. 200
а
тел150
а с
! 100
50 0
I
-
0 21 42
Дни эксперимента
□ Контроль 18% □ Опыт 18% □ Контроль 28% ■ Опыт 28% а Контроль 75% И Опыт 75%
Б
63
* - статистически значимые отличия (р<0,05) показателя животных опытной группы от показателя крыс соответствующей контрольной группы.
Таблица 2. Относительная масса внутренних органов крыс (в граммах на 100 г массы тела) (М±т)
Орган Группа
контрольная опытная
3-я группа субмаргинальная 2-я группа маргинальная 1-я группа оптимальная 3-я группа субмаргинальная 2-я группа маргинальная 1-я группа оптимальная
Печень & 2,934±0,042 2,808±0,039 3,019±0,053 3,192±0,037* 2,944±0,050* 2,907±0,044
? 2,950±0,040 2,950±0,045 2,918±0,056 3,320±0,065* 3,320±0,075* 2,968±0,042
Почки & 0,665±0,012 0,612±0,008 0,615±0,009 0,722±0,014* 0,647±0,010* 0,604±0,007
? 0,668±0,011 0,638±0,008 0,601 ±0,014 0,674±0,008 0,673±0,011 * 0,643±0,010*
Селезенка & 0,392±0,015 0,374±0,016 0,439±0,019 0,465±0,020* 0,453±0,024* 0,387±0,027*
? 0,448±0,015 0,466±0,015 0,458±0,017 0,470±0,015 0,493±0,021 0,426±0,012
Сердце & 0,321 ±0,010 0,298±0,006 0,301±0,011 0,396±0,011* 0,367±0,007* 0,312±0,009
? 0,342±0,006 0,327±0,011 0,319±0,005 0,394±0,006* 0,376±0,007* 0,336±0,006*
Легкие & 0,528±0,019 0,443±0,030 0,525±0,041 0,614±0,027* 0,558±0,027* 0,495±0,024*
? 0,546±0,010 0,543±0,011 0,548±0,015 0,589±0,012* 0,602±0,018* 0,529±0,010
Мозг & 0,614±0,012 0,520±0,011 0,511 ±0,011 0,737±0,027* 0,578±0,012* 0,522±0,009
? 0,824±0,016 0,768±0,015 0,741 ±0,014 0,870±0,015* 0,843±0,019* 0,780±0,018
Семенники & 0,986±0,033 0,838±0,024 0,812±0,029 1,235±0,042* 0,938±0,036* 0,865±0,023
Надпочечники & 0,011±0,001 0,010±0,001 0,014±0,002 0,014±0,001* 0,012±0,001* 0,010±0,001
? 0,018±0,001 0,0195±0,0008 0,0194±0,008 0,022±0,001* 0,023±0,001* 0,020±0,0006
Гипофиз & 0,0026±0,0001 0,0026±0,0001 0,0026±0,0001 0,0031±0,0001* 0,0030±0,0001* 0,0026±0,0001
? 0,0056±0,0001 0,0052±0,0001 0,0134±0,0005 0,0053-0,0001 0,0051 ±0,0002 0,0053±0,0001
П р и м е ч а н и е. Здесь и в табл. 3-5: * - статистически значимые отличия (р<0,05) показателя животных опытной группы от показателя крыс соответствующей контрольной группы.
ников, надпочечников, гипофиза по сравнению с животными 2-й контрольной группы; у животных 3-й опытной группы - различия в массе печени, почек, селезенки, сердца, легких, тимуса, мозга, семенников, надпочечников, гипофиза по сравнению с животными 3-й контрольной группы. При сравнении массы внутренних органов самок 1-й опытной группы с соответствующими показателями 1-й контрольной группы отмечены достоверные различия массы печени, почек, сердца, легких; у животных 2-й опытной и 2-й контрольной групп выявлены
различия массы печени, почек, сердца, легких, тимуса, мозга, надпочечников, гипофиза; у животных 3-й опытной и 3-й контрольной групп - различия в массе печени, сердца, легких, мозга, надпочечников, гипофиза (табл. 2). Следует отметить, что все отмеченные изменения массы внутренних органов находились в пределах физиологических колебаний (от 1 до 27%), характерных для крыс линии Вистар, и поскольку массы внутренних органов у животных опытных групп в большинстве случаев были выше, чем у животных соответствующих
ш
о
"О
о о
О"
ш
оо
ю о
Таблица 3. Биохимические показатели крови крыс (М±т)
Показатель Группа Норма по[20-22]
контрольная опытная
3-я группа субмаргинальная 2-я группа маргинальная 1-я группа оптимальная 3-я группа субмаргинальная 2-я группа маргинальная 1-я группа оптимальная
Глобулин, г/л 27,68±0,69 31,63±0,54 33,97±0,69 28,29±0,67 29,71 ±0,64* 31,66±0,48 12-57
¥ 32,02±0,67 31,22±0,50 33,67±0,77 31,62±0,48 31,74±0,44 31,60±0,54*
Триглицериды, ммоль/л 0,744±0,046 0,851 ±0,042 1,061 ±0,064 0,560±0,040* 0,689±0,054* 0,833±0,065 0,3-1,6
¥ 0,519±0,034 0,641 ±0,049 0,707±0,054 0,407±0,025* 0,483±0,028* 0,511 ±0,047*
Общий билирубин, мкмоль/л 3,339±0,124 4,088±0,250 4,922±0,249 3,027±0,157 3,060±0,164* 3,596±0,182 1-4
¥ 3,326±0,140 3,563±0,148 3,746±0,169 2,785±0,222* 2,544±0,081* 3,058±0,150*
Креатинин, мкмоль/л 46,31 ±1,62 51,77±150 51,65±1,80 52,48±1,48* 52,16±1,65 51,07±1,43 13-92
¥ 48,53±1,74 52,03±1,45 49,66±1,84 51,90±1,26 51,27±1,63 50,20±1,15
Глюкоза, ммоль/л 7,20±0,20 7,48±0,17 7,46±0,19 6,64±0,19* 7,16±0,15 7,25±0,16 4,5-10,0
¥ 7,16±0,24 6,74±0,18 7,04±0,18 6,86±0,21 7,03±0,17 7,22±0,18
Холестерин, ммоль/л 1,346±0,051 1,453±0,045 1,645±0,045 1,267±0,038 1,231 ±0,042* 1,390±0,047 0,6-4,3
¥ 1,346±0,067 1,359±0,047 1,341±0,054 1,200±0,044 1,237±0,035* 1,253±0,049
Лактатдегидрогеназа, Е/л 914±51 907±51 1240±84 1150±62* 1147±48* 1372±138 До 5800
¥ 1102±60 1228±163 1287±55 1331±86* 1184±79 1196±97
Креатинфосфокиназа, Е/л 6159±491 5331±326 8632±618 6937±386 7701±467* 8769±577 4001
¥ 8841±498 8608±548 9371±424 9083±611 9126±531 8905±587
Щелочная фосфатаза, Е/л 231,6±20,3 211,0±7,8 206,9±8,6 212,7±22,3 218,2±9,5 200,5±8,1 112-814
¥ 149,7±9,3 152,0±9,1 143,5±8,7 176,8±18,6 151,3±9,3 139,8±10,1
АЛТ, Е/л 23,40±1,69 33,75±1,92 41,04±2,04 30,90±2,02* 43,22±2,05* 42,46±2,46 33-120
¥ 21,32±1,24 36,91 ±1,88 27,94±1,40 28,81 ±1,24* 29,38±2,95* 37,23±1,55*
ACT, Е/л 133,5±5,4 142,0±4,2 182,4±8,8 146,0±5,6 174,1 ±5,2 195,8±8,8 60-236
¥ 142,6±4,3 160,1 ±6,4 174,3±5,3 163,0±5,8* 171,8±6,4 181,2±7,2
Кальций, ммоль/л d" 2,547±0,037 2,674±0,026 2,618±0,033 2,578±0,041 2,560±0,034* 2,578±0,032 1,1-6,6
¥ 2,374±0,040 2,404±0,034 2,380±0,041 2,391 ±0,031 2,545±0,021 2,370±0,038
Магний, ммоль/л d" 0,525±0,012 0,629±0,014 0,707±0,016 0,595±0,016* 0,623±0,010 0,661 ±0,016 1,0-1,5
¥ 0,469±0,016 0,533±0,012 0,624±0,013 0,495±0,011 0,552±0,013 0,622±0,040
Железо, мкмоль/л 18,75±1,13 19,33±0,96 25,65±0,95 6,957±0,58* 7,983±0,50* 22,35±2,18 17,4-61,0
¥ 38,40±2,65 42,53±2,39 49,33±2,29 12,53±1,27* 15,55±1,76* 35,75±3,00*
Фосфор, ммоль/л !927±0,039 2,051 ±0,052 2,202±0,050 2,069±0,048* 2,131 ±0,042 2,317±0,045 1,3-2,7
¥ 1,784±0,062 1,723±0,051 1,845±0,037 1,922±0,075 1,904±0,054* 1,883±0,060
О)
Е
ж о
IE ГО
О Ш Хэ о-
ш U
1 Допустимые колебания значений,
да оо
Таблица 4. Клинические показатели крови крыс (М±т)
Показатель Группа Норма по данным ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» [19] Норма по [20-22]
контрольная опытная
3-я группа субмаргинальная 2-я группа маргинальная 1-я группа оптимальная 3-я группа субмаргинальная 2-я группа маргинальная 1-я группа оптимальная
Общее количество эритроцитов, 1012/л 9,124±0,116 8,902±0,082 8,219±0,090 6,873 ±0,234* 6,879±0,193* 9,010±0,138* 7,24-9,22 4,4-8,9
¥ 9,012±0,115 8,614±0,115 8,202±0,096 7,529±0,214* 7,754±0,186* 9,063±0,130*
Концентрация гемоглобина, г/л 136,0±2,0 134,8±1,8 148,0±1,5 80,7 ±2,8* 82,8±2,3* 121,7±3,4* 137-164 86-173
¥ 138,9±2,4 142,5±1,4 154,6±1,6 94,58±2,60* 98,37±2,89* 132,7±2,8*
Гематокрит, % 42,10±0,52 41,50±0,46 44,20±0,40 23,49 ±0,94* 24,33±0,82* 37,63±1,05* 40,10-47,40 31,4-51,9
¥ 41,40±0,73 42,05±0,40 44,86±0,48 26,70±0,99* 28,89±1,02* 39,71 ±0,82*
Средний объем эритроцита, мкмз 45,55±0,86 46,84±0,73 53,77±0,32 34,47± 0,34* 35,48±0,25* 41,00±0,85* 48,00-61,00 50,6-93,8
¥ 45,28±0,70 48,93±0,63 54,79±0,38 35,19±0,33* 36,93±0,67* 43,12±0,94*
Среднее содержание НЬ в эритроците, пг 14,71±0,35 15,22±0,28 18,05±0,13 11,77 ±0,12* 12,06±0,10* 13,29±0,28* 16,60-20,70 13,4-26,1
¥ 15,31 ±0,26 16,37±0,35 18,89±0,14 12,58±0,12* 12,62±0,19* 14,47±0,36*
Средняя концентрация НЬ в эритроците, г/л 323,2±2,0 324,6±1,3 335,4±1,4 341,4 ±4,3* 340,4±3,8* 324,3±1,3* 331-360 247-368
¥ 337,7±1,2 339,1 ±1,2 344,8±1,1 358,4±4,9* 343,0±3,4 335,2±1,8*
Лейкоциты, 109/л 10,57±0,69 10,27±0,64 11,79±0,96 10,61 ±0,74 10,28±0,65 9,43±0,58* 4,30-26,70 1,4-34,3
¥ 11,65±0,92 9,76±0,52 11,41 ±0,74 11,12±0,95 9,35±0,60 9,86±0,55
Эозинофилы, % d" 2,004±0,164 2,080±0,143 1,957±0,159 1,077±0,075* 1,287±0,080* 1,650±0,110 1,00-6,10 0,0-5,5
¥ 2,970±0,332 3,010±0,287 2,783±0,286 2,294±0,206 2,187±0,176 2,526±0,159
Тромбоциты, 109/л d" 632,9±22,9 626,4±17,0 558,2±15,9 1280,1 ±55,3* 1197,6±53,2* 894,9±44,5* 453-948 409-1250
¥ 668,4±24,1 614,0±27,4 573,8±13,0 1114,9±73,9* 1086,7±59,5* 805,0±34,4*
Средний объем тромбоцита, мкм3 6,852±0,063 7,000±0,075 6,833±0,076 8,657± 0,253* 8,538±0,129* 7,760±0,171* 6,00-8,10 5,0-8,0
¥ 6,900±0,068 6,727±0,091 6,703±0,083 8,654±0,232* 8,072±0,249* 7,261 ±0,145*
Тромбокрит, % 0,435±0,016 0,438±0,014 0,380±0,010 1,116±0,075* 1,028±0,056* 0,710±0,049* 0,33-0,60 0,2-0,5
¥ 0,462±0,018 0,417±0,025 0,384±0,009 0,982±0,083* 0,898±0,069* 0,596±0,035*
>
=1 s
ш
о
~о
о о
оо
ю о
Таблица 5. Активность ферментов системы антиоксидантной защиты и содержание продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах крыс (M±m)
Показатель Группа
контрольная опытная
3-я группа субмаргинальная 2-я группа маргинальная 1-я группа оптимальная 3-я группа субмаргинальная 2-я группа маргинальная 1-я группа оптимальная
Глутатионредуктаза, мкмоль/минхг НЬ 41,32±1,07 42,28±0,72 37,23±0,76 48,82±1,89* 69,21±2,30* 47,03±1, 42*
? 35,42±0,97 34,93±0,52 32,07±0,50 37,61 ±1,33 52,92±1,51 * 37,91 ±1,06*
Глутатионпероксидаза, мкмоль/минхг НЬ 63,54±1,69 59,92±1,01 52,57±1,21 126,81 ±4,47* 102,74±3,17* 72,39±2,59*
? 59,14±1,48 57,35±1,07 52,17±1,04 99,79±2,50* 93,20±3,24* 62,34±1,88*
Каталаза, ммоль/минхг НЬ 620,1 ±15,2 608,2±15,0 550,8±12,7 1342,7±57,3* 986,3±33,2* 699,3±20,3*
? 604,0±11,1 592,5±13,1 522,7±12,5 1095,8±33,7* 961,0±32,6* 570,8±17,3*
Супероксиддисмутаза, ЕД/минхг НЬ 2042±35 1976±30 1771±21 3721 ±150* 3320±87* 2222±60*
? 2013±39 1941±31 1807±22 3226±86* 3008±100* 2144±52*
Содержание продуктов перекисного окисления липидов
МДА эритроцитов, нмоль/мл 5,381 ±0,082 5,522±0,066 5,331 ±0,060 6,661 ±0,104* 5,770±0,101* 5,565±0,106
? 5,116±0,078 5,118±0,084 5,113±0,091 6,898±0,086* 5,953±0,081* 5,482±0,110*
МДА сыворотки, нмоль/мл 8,465±0,161 8,139±0,121 7,708±0,108 9,859±0,140* 8,089±0,093 7,735±0,105
? 8,195±0,125 7,730±0,160 7,765±0,201 9,339±0,126* 7,897±0,167 7,611 ±0,117
МДА печени, нмоль/г 326,9±4,9 324,4±3,1 324,2±4,7 440,5±5,2* 393,7±5,3* 369,6±4,5*
? 318,4±5,0 326,9±4,4 318,4±4,9 398,4±5,0* 362,6±8,8* 337,1 ±7,1 *
контрольных групп, можно сделать вывод, что различия обусловлены снижением массы тела животных опытных групп (см. рисунок), а это повлияло на расчетный показатель относительной массы внутренних органов. Таким образом, выявленные различия нельзя расценивать как свидетельство негативного влияния токсического фактора.
Биохимические показатели сыворотки крови у самцов 1-й опытной группы не имели достоверных отличий от контроля. Животные 2-3-й опытных групп демонстрировали целый ряд статистически значимых различий с аналогичными показателями у крыс соответствующих контрольных групп [концентрация глобулина, уровни триглицеридов, общего билирубина, мочевины, креати-нина, глюкозы, холестерина, активности лактатдегид-рогеназы, креатинфосфокиназы, аланинамино-транс-феразы (АЛТ), содержание кальция, магния, железа, фосфора]. Выявленные различия находились в диапазоне физиологических колебаний и варьировали от 4 до 63%, что, согласно опыту наших предыдущих исследований, не является однозначным свидетельством присутствия негативного воздействия, поскольку различия биохимических показателей могут быть весьма значительны и у животных, получавших идентичные по составу рационы без токсической нагрузки. В то же время было отмечено, что содержание железа в сыворотке крови самцов 2-й и 3-й опытных групп было ниже нормы в 2,2 и 2,5 раза соответственно. По сравнению с аналогичными показателями животных 2-й и 3-й контрольных групп концентрация железа была соответственно на 59 и 63% (р<0,05) ниже. У крыс 1-й опытной группы содержание железа не выходило за пределы нормы и было ниже контрольных значений на 13% (р>0,05) (табл. 3).
Биохимические показатели сыворотки крови у самок 1-3-й опытных групп также демонстрировали статис-
тически значимые различия с аналогичными показателями у крыс соответствующих контрольных групп (концентрация глобулина, уровни триглицеридов, общего и прямого билирубина, мочевины, мочевой кислоты, кре-атинина, глюкозы, холестерина, активности лактатде-гидрогеназы, креатинфосфокиназы, АЛТ, аспартатами-нотрансферазы, содержание кальция, магния, железа, фосфора). Выявленные различия в целом находились в диапазоне физиологических колебаний и варьировали от 6 до 67%. Уровень содержания железа в сыворотке крови самок 2-й и-3-й опытных групп был ниже нормы в 1,1 и 1,4 раза соответственно. По сравнению с аналогичными показателями 2-й и 3-й контрольных групп уровень железа был соответственно на 63 и 67% (р<0,05) ниже. У крыс 1-й опытной группы содержание железа не выходило за пределы нормы и было ниже контрольных значений на 28% (р<0,05) (табл. 3).
Оценка результатов гематологических исследований животных 1-3-й опытных групп позволила выявить определенные закономерности изменений показателей эритроцитарного профиля: концентрация гемоглобина, гематокрит, средний объем эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците в целом были на 11-44% (р<0,05) ниже, чем соответствующие показатели животных 1-3-й контрольных групп. Общее количество эритроцитов у животных 2-й и 3-й групп было ниже контрольных значений на 23 и 25% у самцов и на 10 и 16% у самок соответственно, при этом в 1-й опытной группе значение данного показателя было на ~10% выше, чем у самцов и самок контрольных групп. Средняя концентрация гемоглобина в эритроците животных 2-3-й опытных групп была выше на 5-6% у самцов и 1-6% (р<0,05) у самок, а животных 1-й опытной группы - на 3 и 3% (р<0,05) ниже таковой у самцов и самок соответствующих контрольных групп. Значения показателей тром-
боцитарного профиля у крыс опытных групп были значительно выше, чем у крыс контрольных групп: общее количество тромбоцитов и тромбокрит - на 40-156% ^<0,05), средний объем тромбоцита - на 8-26% ^<0,05) (табл. 4).
Показатели системы антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов эритроцитов у крыс 1-3-й опытных групп проявляли линейные изменения (повышения концентрации) в ряду понижения содержания эссенциальных микронутриентов в рационах (табл. 5). Так, у самцов 1-3-й опытных групп активность глутатионпероксидазы возрастала на 38, 71 и 100%, каталазы - на 27, 62 и 117%, супероксиддисмутазы -на 25, 68 и 82% ^<0,05), у самок - на 19, 63 и 69%; 9, 62 и 81%; 19, 55 и 60% ^<0,05) соответственно. Активность глутатионредуктазы в эритроцитах самцов и самок 1-й и 2-й опытных групп демонстрировала сходную тенденцию и была выше аналогичных показателей у крыс 1-2-й контрольных групп на 26 и 64% (у самцов) и 18 и 52% (у самок). Вопреки сложившемуся тренду у самцов 3-й опытной группы активность глутатионредук-тазы была лишь на 18% ^<0,05) выше, чем у самцов 3-й контрольной группы, у самок разница составляла 6% ^>0,05).
Содержание МДА в печени крыс опытных групп также повышалось от 1-й к 3-й группе: у самцов отличия от соответствующих показателей 1-3-й контрольных групп составляли 14, 21 и 35% ^<0,05), у самок - 6, 11
и 25% ^<0,05). Содержание МДА в эритроцитах самцов 1-3-й опытных групп было выше, чем у контрольных животных на 4, 4 и 24% ^<0,05), у самок - на 7, 16 и 35% ^<0,05) соответственно. Концентрация МДА в сыворотке крови самцов и самок 1-2-й опытных групп не имела значимых отличий от контроля, животные 3-й опытной группы демонстрировали некоторое повышение этого показателя: самцы - на 16%, самки - на 14% ^<0,05).
Таким образом, основные цели данного эксперимента были достигнуты: подтверждено снижение адаптационного потенциала и формирование у крыс гипо-, нормо-и гиперчувствительности к воздействию токсических факторов (на примере воздействия солями кадмия), сформирован проект перечня физиолого-биохимичес-ких параметров (биомаркеров), реагирующих на токсическое воздействие, включающий показатели эритроци-тарного и тромбоцитарного профиля крови, содержание железа в сыворотке крови, показатели системы анти-оксидантной защиты и перекисного окисления липи-дов крови и печени. В последующих двух модельных исследованиях, которые будут проведены по аналогичной схеме с этанолом и четыреххлористым углеродом в качестве токсикантов, будет окончательно определен перечень биомаркеров, подлежащих обязательному изучению в токсикологических экспериментах.
Работа проведена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 16-16-00124).
Сведения об авторах
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва):
Тышко Надежда Валерьевна - кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: [email protected]
Садыкова Эльвира Олеговна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: [email protected]
Тимонин Андрей Николаевич - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории иммунологии E-mail: [email protected]
Шестакова Светлана Игоревна - младший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: [email protected]
Мустафина Оксана Константиновна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории
иммунологии
E-mail: [email protected]
Сото Селада Хорхе - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и про-теомного анализа E-mail: [email protected]
Литература
1. Саноцкий И.В., Уланова И.П. Критерии вредности в гигиене и токсикологии, при оценке опасности химических соединений. М. : Медицина, 1975. 328 с.
2. Сидорова Ю.С., Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М. и др. Влияние витаминной обеспеченности на протекание общего адаптационного синдрома у растущих крыс // Вопр. питания. 2014. Т.83, № 5. С. 20-25.
3. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Сото С.Х. и др. Биохимические показатели плазмы крови и некоторые параметры антиоксидантого статуса крыс при полигиповитаминозах разной степени // Бюл. экспер. биол. 2012. № 10. С. 439-442.
4. Волкова Н.А., Карплюк И.А. Изучение мутагенной активности кадмия при пероральном поступлении // Вопр. питания. 1990. № 1. С. 74-76.
5. Goyer R., Klaassen C., Waalkes M. Metal toxicology. Michigan: Academic Press, 1995. 525 p.
6. El-Mansy A.A., Mazroa S.A., Hamed W.S. et al. Histological and immunohistochemical effects of Curcuma longa on activation of rat hepatic stellate cells after cadmium induced hepatotoxicity // Biotech. Histochem. 2016. Vol. 91, N 3. P. 170-181.
7. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е. и др. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 5. С. 30-38.
8. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения: Методические указания (МУ 2.3.2.2306-07). М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. 21 с.
9. Костюк В.А., Потапович А.И. Определение продуктов перекисного окисления липидов с помощью тиобарбитуровой кислоты в анаэробных условиях // Вопр. мед. химии. 1987. Т. 33, № 3. С. 115-118.
10. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа // Вопр. мед. химии. 1994. Т. 40, № 2. С. 56-58.
11. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А. Оптимизация активности глутати-онредуктазы эритроцитов человека на полуавтоматическом анализаторе // Вопр. мед. химии. 1994. Т. 40, № 2. С. 59-61.
12. Ernster L., Nordenbrandt K. Microsomal lipid peroxidation // Methods in Enzymology. Oxidation and Phosphorylation. New York: Ac. Press. 1967. Vol. 10. P. 574-580.
13. Michara, M., Uchiyama, M., Fukuzawa, K. 1980. Thiobarbituric acid value on fresh homogenate of rat as a parameter of lipid peroxidation
in aging, CCl4 intoxication, and vitamin E deficiency // Biochem. Med. 1980. Vol. 23, N 3. P. 302-311.
14. Mills G.C. The purification and properties of glutathione peroxidase of erythrocytes // J. Biol. Chem. 1959. Vol. 234. P. 502-506.
15. Niashikimi M., Rao N., Jagi K. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. Vol. 46, N 2. P. 849-854.
16. Oshino N., Chance B. The role of H2O2 generation in perfused rat liver and the reaction of catalase compound I and hydrogen donors // Arch Biochem Biophys. 1973. Vol. 154, N 1. P. 117-131.
17. Tillotson J.A., Sauberlich H.E. Effect of riboflavin depletion and repletion on the erythrocyte glutathione reductase in the rat // J. Nutr. 1971. Vol. 101, N 11. P. 1459-1466.
18. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2006. 312 с.
19. Мустафина О.К., Трушина Э.Н., Шумакова А.А., Арианова Е.А., Тышко Н.В., Пашорина В.А. Гематологические показатели у крыс Вистар разного возраста, содержащихся на полусинтетическом полноценном виварном рационе // Вопр. питания. 2013. № 2. С. 10-16.
20. Lewi P.J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wistar rat. Amsterdam: Elsevier, Norrth-Holland biochemical, 1981. P. 358.
21. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. Burlington: Elsevier Academic Press, 2006. 912 p.
22. Tucker M.J. Diseases of the Wistar Rat. Lond.: Taylor & Francis Limited, 1997. 272 p.
References
1. Sanotskiy I.V., Ulanova I.P. The criteria of harm in hygiene and toxicology in risk assessment of chemical compounds. Moscow: Meditsina, 1975: 328 p (in Russian)
2. Sidorova Yu.S., Beketova N.A., Vrzhesinskaya O.A., Kodentsova V.M., et al. Effect of vitamin sufficiency on adaptation syndrome in growing rat. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2014; Vol. 83 (5): 20-5. (in Russian)
3. Kodentsova V.M., Vrzhesinskaya O.A., Beketova N.A., Soto S.H., et al. Biochemistry of blood plasma and some parameters of antioxidant status in rats with polyhypovitaminosis of varying severity. Byulleten' eksperimental'noi biologii i meditsiny [Bulletin of Experimental Biology and Medicine]. 2012; 10: 439-42. (in Russian)
4. Volkova N.A., Karplyuk I.A. Cadmium mutagenic activity after oral administration. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 1990; (1): 74-6. (in Russian)
5. Goyer R., Klaassen C., Waalkes M. Metal toxicology. Michigan: Academic Press. 1995: 525 p.
6. El-Mansy A.A., Mazroa S.A., Hamed W.S., et al. Histological and immunohistochemical effects of Curcuma longa on activation of rat hepatic stellate cells after cadmium induced hepatotoxicity. Biotech Histochem. 2016; 91 (3): 170-81.
7. Tyshko N.V., Zhminchenko V.M., Pashorina V.A., Seljaskin K.E., et al. A comparative assessment of the diet influence on growth and development of rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2011; 80 (5): 30-8. (in Russian)
8. Methodical Guidelines 2.3.2.2306-07 «Medical and biological safety assessment of genetically modified organisms of plant origin». Moscow: Federal'niy tsentr gigieny i epidemiologii Rospotrebnadzora, 2008: 21 p. (in Russian)
9. Kostyuk V.A., Potapovich A.I. The definition of lipid peroxidation products using thiobarbituric acid in anaerobic conditions. Voprosy meditsinskoy khimii [Questions of Medical Chemistry]. 1987; (3): 115-8. (in Russian)
10. Maltsev G.Yu., Vasilyev A.V. Estimation of erythrocyte catalase and superoxide dismutase activities using the open type analyzer.
Voprosy meditsinskoy khimii [Questions of Medical Chemistry]. 1994; (2): 56-8. (in Russian)
11. Maltsev G.Yu., Orlova L.A. Optimum estimation of glutathione reductase activity in human erythrocytes using a halfautomatic analyzer. Voprosy meditsinskoy khimii [Questions of Medical Chemistry]. 1994; (2): 59-61. (in Russian)
12. Ernster L., Nordenbrandt K. Methods in Enzymology. Oxidation and phosphorilation. Ed by R.W. Estabrook, M.E. Pullman. New York: Academic Press, 1967; 10: 574-80.
13. Michara M., Uchiyama M., Fukuzawa K. Thiobarbituric acid value on fresh homogenate of rat as a parameter of lipid peroxidation in aging, CCl4 intoxication, and vitamin E deficiency. Biochem Med. 1980; 23 (3): 302-11.
14. Mills G.C. The purification and properties of glutathione peroxidase of erythrocytes. J Biol Chem. 1959; 234 (3): 502-6.
15. Niashikimi M., Rao N., Jagi K. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen. Biochem Biophys Res Commun. 1972; 46: 849-54.
16. Oshino N., Chance B. The role of H2O2 generation in perfused rat liver and the reaction of catalase compound I and hydrogen donors. Arch Biochem Biophys. 1973; 154 (1): 117-31.
17. Tillotson J.A., Sauberlich H.E. Effect of riboflavin depletion and repletion on the erythrocyte glutathione reductase in the rat. J Nutr. 1971; 101: 1459-66.
18. Rebrova O.Yu. Statistical analysis of medical data. Application of software package Statistica. Moscow: Media Sfera, 2006: 312 p. (in Russian)
19. Mustafina O.K., Trushina EH.N., Shumakova A.A., Arianova E.A., Tyshko N.V., Pashorina V.A. Hematologic indices in different age Wistar rats, receiving a balanced semi-synthetic vivary diet. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2013; (2): 10-6. (in Russian)
20. Lewi P.J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wistar rat. Amsterdam: Elsevier; North-Holland Biochemical, 1981: 358.
21. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The laboratory rat. Burlington: Elsevier Academic Press, 2006: 912 p.
22. Tucker M.J. Diseases of the Wistar rat. London: Taylor and Francis, 1997: 272 p.
