CC BY
20УДК 619:615.9 DOI 10.33632/1998-698Х.2021-3-52-57
ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА АФЛАТОКСИНА В1 НА ПЕРЕВИВАЕМЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК
А.И. Самсонов - кандидат биологических наук, О.В. Шлямина - кандидат химических наук,
Ж.Р. Насыбуллина
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», 420075, г. Казань, Научный городок-2;
е-таИ:упт@,тт1. ги
Альтернативные классическим методикам способы оценки токсичности с использованием культур клеток все более актуальны в биохимических и токсикологических исследованиях, но достаточно слабо представлены в ветеринарной науке. Изучен цитотоксический эффект афлатоксина В1 на перевиваемые линии клеток почки бычка (MDBK). Установлены и сложно сопоставимые и взаимоисключающие данные при изучении цитотоксического действия микотоксина афлатоксина В1 для культур клеток линии MDBK. Результаты получены на основе определения индекса цитотоксичности и цитотоксического индекса. Необходимо продолжение исследований с поиском более оптимально отражающего токсические эффекты микотоксинов на клетки in vitro показателя.
Ключевые слова: циготоксичность, культура клеток, афлатоксин В1, цитотоксический индекс, индекс цитотоксичности.
Введение. Оценка токсичности соединений проводится на начальном этапе определения биологической активности веществ. Альтернативные классическим методикам способы оценки токсичности с использованием культур клеток все более актуальны в биохимических и токсикологических исследованиях, но достаточно слабо представлены в ветеринарной науке [2, 16, 20]. Такие методы позволяют помимо решения этических проблем, связанных с массовым использованием и гибелью экспериментальных животных, значительно удешевить и сократить сроки исследования [17].
Клеточные культуры используют также для определения цитотоксического действия микотоксинов [15, 21]. Микотоксины - это токсичные вторичные метаболиты, продуцируемые мицелиальными грибами, которые преимущественно принадлежат к видам из родов Aspergillus, Fusarium и Penicillium. Было открыто более 500 различных классов микотоксинов, многие из которых имеют неизвестные механизмы действия [4, 7, 13]. Прием внутрь микотоксинов может привести к микотоксикозу как у животных, так и у человека, в том числе при субклинических концентрациях [18]. Эти токсичные соединения, вызывающие глобальную озабоченность, обычно обнаруживаются в качестве загрязняющих веществ в различных товарах растительного происхождения, особенно в зерне злаков, и
поэтому часто обнаруживаются в кормах для животных [6, 12, 19, 22], а в ряде случаев способствуют возникновению инфекционных заболеваний [9]. Микотоксины также можно обнаружить в продуктах питания (молоко и производные молока, мясо, яйца) в результате переноса от животных, употреблявших загрязненные корма [5, 8]. В пищевых продуктах и кормах чаще встречается естественное совместное сосуществование микотоксинов с потенциальными аддитивными, антагонистическими или синергическими эффектами, чем единичные микотоксиновые контаминанты [1, 23]. Микотоксины наносят высокие ежегодные экономические потери во всем мире из-за некачественных сельскохозяйственных товаров, а также снижение здоровья животных и человека [3, 14]. Современные данные [21] указывают на необходимость создания моделей совместного культивирования, которые лучше способны отражать реакцию органов и тканей (физии-ологически и иммунологически) для более высокой оценки воздействия микотокси-нов на организм.
Цель исследования — изучение цито-токсического эффекта афлатоксина В1 на пре-виваемые культуры клеток линии MDBK.
Материал и методы. Цитотоксический эффект на перевиваемые культуры клеток определяли по пролиферативной активности [15, 17]. Применяли в экспериментах in vitro линию перевиваемых культур клеток MDBK (коллек-
ция ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань) [10, 11]. Данная линия клеток получена S. Madin и N. Darby в 1957 г. из почки бычка. Использовали микотоксин афлатоксин В1. Клеточную суспензию разливали в стеклянные флаконы из химически инертного стекла объёмом 2 см3 в каждый. Спиртовой раствор афлатоксин В1 вносили во флаконы в виде спиртового раствора 0,001 см3. Контролем служили флаконы с клеточной суспензией -вносили этиловый спирт (96 об.%) 0,001 см3. В последующем выдерживали флаконы с культурой в инкубаторе при температуре 37 °С. Длительность инкубирования составила 96 ч. Затем клетки с помощью смеси растворов трипсина и версена подвергали диспергированию. Диспергирующий раствор вносили в объёме 0,2 см3 на флакон и инкубировали в термостате при 37 °С. Период инкубации составил 20 мин. Для остановки действия диспергирующей смеси вливали 1 см питательной среды, содержащей бычью сыворотку крови.
Подсчет клеток осуществляли под световым микроскопом с помощью камеры Горяева. Для определения жизнеспособности клеток к 1 см3 клеточной суспензии добавляли 1 см3 красителя (индикатор трипановый синий в виде водного раствора в концентрации 0,5 %). Нежизнеспособные клетки окрашивались в
синий цвет, функционирующие клетки оставались бесцветными.
Воздействие афлатоксина В1 на жизнеспособность клеток устанавливали на основе следующих показателей:
1) Выраженное в процентах соотношение функционирующих клеток к общему числу клеток - коэффициента жизнеспособности (КЖ).
2) Отношение количества клеток, выросших к количеству засеянных - индекс пролиферации (ИП).
3) Отношение изначально засеянного числа к количеству функционирующих, оставшихся после инкубации с афлатоксином В1 -индекс цитотоксичности (ИЦ).
4) Содержание клеток в 1 см3 - клеточной популяции плотность.
5) Цитотоксический индекс по Г.П. Червонской с соавт. (ЦТИ, 1988).
Обработку результатов производили методом вариационной статистики (критерий достоверности Стьюдента). Разница между сравниваемыми значениями воспринималась достоверной при Р < 0,05.
Результаты исследований. Данные, полученные по изучению цитотоксичности афлатоксина В1 на клеточной линии МББК представлены в таблице и рисунке.
Таблица - Влияние афлатоксина В1 на жизнеспособность клеточной линии MDBK
Концентрация микотоксина, М Коэффициент жизнеспособности Индекс цитотоксичности Цитотоксический индекс
Контроль (0) 99,05 ± 0,37 0,250 ± 0,003 0
1,07x10-6 0 0 -134,924 ± 70,97
2,08x10-9 96,25 ±1,07* 0,59 ± 0,04* -3,63 ± 1,91
0,26x10-9 98,09 ± 0,38 0,249 ± 0,005 -0,09 ± 0,04
Примечание - * - различия достоверны с вероятностью Р < 0,05
При изучении воздействия афлатоксина В1 на перевиваемые культуры клеток установлено, что с помощью индекса цитотоксич-ности, а также цитотоксического индекса получаются взаимоисключающие и сложно сопоставимые данные. Выявились некоторые сложности при расчете результатов. Так, индекс цитотоксичности следует подсчитывать и для контроля, только потом сопоставлять цифровые данные. При этом данный показатель не рассчитывается при тотальной смерти клеток в контрольных флаконах. В процессе определения
цитотоксического индекса практически не реально с высокой долей достоверности установить долю погибших клеток. Это происходит вследствие отрыва от монослоя, проникая в инкубационную среду, которая удаляется из флаконов перед внесением дисперрующей клетки смесью. Числовые значения этого индекса в случае наличия только скрытого повреждения в монослое, не показывали значимого варьирования данных. Не следует рассматривать раздельно от индекса пролиферации самостоятельно и коэффициент жизнеспособности клеток.
4,5
3,5
2,5
4,04
4,07
3,2 1
0,43
Контроль (0)
1,07x10-6
2,08x10-9
0,26x10-9
Рисунок 1- Индекс пролиферации линии MDBK под влиянием афлатоксина В1
Так, и коэффициент жизнеспособности равен в контроле 99,05±0,37, а индексе пролиферации равен 4,04 ± 0,06. При воздействии афлатоксина В1 в концентрации 2,08 х коэффициент жизнеспособности был равен 96,25±1,07, в то же время значение индекса пролиферации составило 3,11 ± 0,14 ф < 0,05).
Заключение. При изучении цитоток-
сического действия афлатоксина В1 для пере-виваемых культур клеток MDBK на основе индекса цитотоксичности и цитотоксического индекса выявляются сложно сопоставимые и взаимоисключающие результаты. Необходимо изыскание более достоверно отражающего токсические эффекты микотоксинов на клетки in vitro показателя.
4
3
2
1.5
1
0,5
0
Литература
1. Антипов, В.А. Воздействие сочетанных микотоксикозов на организм крупного рогатого скота / В.А. Антипов, П.В. Мирошниченко, А.Н. Трошин, А.Х. Шантыз // Ветеринария и кормление, 2016. - №
2. - С. 42.
2. Виноходов, Д.О. Биотестирование в птицеводстве и ветеринарии: Введение в биотестирование / Д.О. Виноходов, Н.Л. Поляков // Ветеринария в птицеводстве, 2003. - № 5-6. - С. 41.
3. Грибы рода Aspergillus - возбудители болезней животных и птиц: монография / Р.М. Потехина, Е.Ю. Тарасова, Л.Е. Матросова, Э.И. Семёнов, С.А. Танасева, Н.Н. Мишина, О.К. Ермолаева, А.Р. Валиев, А.И. Самсонов. - Казань: ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 2020. - 121 с.
4. Ефимочкина, Н.Р. Токсигенные свойства микроскопических грибов / Н.Р. Ефимочкина, И.Б. Седова, С.А. Шевелева, В.А. Тутельян // Вестник Томского государственного университета. Биология, 2019. - № 45. - С. 6.
5. Коростелева, В.П. Оценка качества мяса овец при Т-2 микотоксикозе на фоне применения актовегина, гептрала и фоспренила / В.П. Коростелева, Э.К. Папуниди, С.Ю. Смоленцев, Е.Ю. Тарасова // Мясная индустрия, 2014. - Т.6. - С. 10.
6. Макаева, А.Р. Мониторинг питательной ценности и химической безопасности основных кормов Республики Татарстан по результатам исследований, выполненных в 2019 году / А.Р. Макаева, О.В. Шлямина, И.М. Фицев // Бутлеровские сообщения, 2020. - Т. 62. - № 4. - С. 123.
7. Микотоксины (в пищевой цепочке): монография / К.Х. Папуниди, М.Я. Тремасов, В.И. Фисинин, А.И. Никитин, Э.И. Семёнов. - Казань: ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 2017. - 158 с.
8. Мишина, Н.Н. Полевой случай трансмиссии дезоксиниваленола в органы сельскохозяйственной птицы / Н.Н. Мишина, А.З. Мухарлямова, Э.Р. Рахметова, И.Н. Штыров, А.М. Сайфутдинов, Э.И. Семенов // Проблемы медицинской микологии, 2020. - Т. 22. - № 3. - С. 105.
9. Нургалиев, Ф.М. Частота развития язвенных процессов в слизистой оболочке желудка свиней, обусловленных воздействием микотоксинов и колонизацией бактериями рода Helicobacter / Ф.М. Нургалиев, Э.И. Семенов, О.К. Поздеев, П.В. Софронов // Ветеринарный врач, 2020. - № 2. - С. 31.
10. Плотникова, Э.М. Изучение биологических свойств культуры клеток, подвергнутой длительной криоконсервации / Э.М. Плотникова, И.А. Архарова, А.И. Самсонов, З.Г. Чурина // Ветеринарный врач, 2018. - № 2. - С. 7.
11. Плотникова, Э.М. Радиорезистентная линия культур клеток MDBK для репродукции вирусов / Э.М. Плотникова, Х.Н. Макаев, Р.Н. Низамов, А.И. Самсонов, И.А. Архарова, Р.Г. Фазлиахметов,
3.Г. Чурина // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию со дня рождения профессора В.А. Киршина «Актуальные проблемы ветеринарной медицины». - Казань: ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 2018. - С. 247.
12. Самсонов, А.И. Профилактика Т-2 токсикоза норок / А.И. Самсонов, В.Н. Дервянов // Ветеринарный врач, 2007. - № 2. - С. 17.
13. Танасева, С.А. Мониторинг афлатоксина В1 в кормах Республики Татарстан / С.А. Танасева, О.К. Ермолаева, Л.Е. Матросова, Э.И. Семенов // Международный вестник ветеринарии, 2020. - № 2. - С. 132.
14. Тарасова, Е.Ю. Изучение сорбционной активности потенциальных средств профилактики микотоксинов в отношении афлатоксинов / Е.Ю. Тарасова, Э.И. Семенов. Л.Е. Матросова, Н.Н. Мишина, А.З. Мухарлямова // Ветеринарный врач, 2020. - №2. - С. 51.
15. Тертичная, М.В. Возможность использования культур клеток в качестве биопробы при Т-2 токсикозе / М.В. Тертичная, Р.Я. Гильмутдинов, М.Я. Тремасов // Ветеринарный врач, 2005. - № 2. -С. 29.
16. Тремасов, М.Я. Актуальные проблемы ветеринарной токсикологии / М.Я. Тремасов, К.Х. Папуниди, Э.И. Семенов, Е.Ю. Тарасова // Вестник ветеринарии, 2012. - № 4 (63). - С. 16.
17. Червонская, Г.П. Культура клеток - биологическая модель в токсикологических исследованиях / Г.П. Червонская // Тезисы докладов 1 съезда токсикологов России. - М., 1998. - С.328.
18. Шакурова, Н.В. Влияние микотоксинов на ультраструктуру кортикальных элементов нефрона свиней / Н.В. Шакурова, Э.И. Семенов, В.Б. Савва // Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки, 2020. - Т. 162. - № 3. - С. 350.
19. Штыров, И.Н. Аналитика данных распространения Т-2 токсина в Республике Татарстан / И.Н. Штыров, Э.И. Семёнов, Л.Е. Матросова, С.А. Танасева, Е.Ю. Тарасова, Н.Н. Мишина // Международный вестник ветеринарии, 2021. - № 1. - С. 167.
20. Шуралев, Э.А. Т-2 токсин биотестирование на Stylonychia mytilis и Daphnia magna Straus / Э.А. Шуралев, Л.Р. Валиуллин, О.В. Никитин, Э.И. Семёнов // Успехи медицинской микологии, 2017. -Т.17. - С.457.
21. Ran, Xu In-Vitro Cell Culture for Efficient Assessment of Mycotoxin Exposure Risk Mitigation / Ran Xu, Niel A. Karrow, Umesh K. Shandilya, Lv-hui Sun, Haruki Kitazawa // Toxins, 2020. - № 12. -P. 146.
22. Samsonov, A.I. Mink farming and mycotoxicosis / A.I. Samsonov, E.I. Semenov, E.M. Plotnikova, A.I. Nikitin, K.K. Papunidi, M.Y. Tremasov, S.Yu. Smolentsev // Indian Veterinary Journal, 2018. - Т. 95. - № 5. - P. 52.
23. Semenov, E.I. Joint effect of the mycotoxins T-2 toxin, deoxynivalenol and zearalenone on the weaner pigs against a background of the infection load / E.I. Semenov, L.E. Matrosovа, M.Ya. Tremasov, E.Yu. Tarasova et al. // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 2016. -№7 (1). - P. 1860.
STUDY OF THE CYTOTOXIC EFFECT OF AFLATOXIN B1 ON TRANSFERABLE CELL CROPS
A.I. Samsonov - Candidate of biological sciences, O. V. Shlyamina - Candidate of chemical sciences,
Zh. R.Nasybullina
FSBSI "Federal Center for Toxicological, Radiation and biological safety", 420075, Kazan, Nauchny gorodok-2;
e-mail: vnivi@mail.ru.
Methods for assessing toxicity, alternative to classical tests on experimental animals, namely, models using cell cultures, are increasingly being used in biochemical and toxicological studies, but are poorly represented in veterinary studies. The cytotoxic effect of aflatoxin B1 on continuous cell cultures of the bovine kidney cell line (MDBK) was studied. It was found that when determining the cytotoxicity of aflatoxin B1 for transplanted animal cell cultures using the cytotoxicity index and the cytotoxic index, contradictory and difficult to compare results are obtained. It is necessary to continue research with the search for a new indicator that more optimally reflects the toxic effects of mycotoxins on cells in vitro.
Keywords: cytotoxicity, cell culture, aflatoxin B1, cytotoxic index, cytotoxicity index.
References
1. Antipov, VA. Impact of the combined mikotoksikoz on an organism of cattle/VA. Antipov, P.V. Miroshnichenko, A.N. Troshin, A.H. Shantyz//Veterinary science and feeding, 2016. - No. 2. - P. 42.
2. Vinokhodov, D.O. Biotestirovaniye in poultry farming and veterinary science: Introduction to biotesting / D.O. Vinokhodov, N.L. Polyakov//Veterinary science in poultry farming, 2003. - No. 5-6. - P. 41.
3. Mushrooms of the sort Aspergillus are causative agents of diseases of animals and birds: monograph / R.M. Potekhina, E.Yu. Tarasova, L.E. Matrosova, E.I. Semyonov, S.A. Tanaseva, N.N. Mishina,
0.K. Yermolaeva, A.R. Valiyev, A.I. Samsonov. - Kazan: FGBNU of "FTsTRB-VNIVI", 2020. - 121 p.
4. Efimochkina, N.R. Toksigennye of property of microscopic mushrooms / N.R. Efimochkina, I.B. Sedova, S.A. Shevelyova, V.A. Tutelyan//Messenger of the Tomsk state university. Biology, 2019. - No. 45. - P. 6.
5. Korosteleva, V.P. Otsenka of quality of meat of sheep at T-2 to a mikotoksikoza against the background of application of an aktovegin, a geptral and fosprenil / Accusative Korosteleva, E.K. Papunidi, S.Yu. Smolentsev, E.Yu. Tarasova//the Meat industry, 2014. - T.6. - P. 10.
6. Makayeva, A.R. Monitoring of nutritional value and chemical safety of the main forages of the Republic of Tatarstan by results of the researches executed in 2019. R. Makayeva, O.V. Shlyamina,
1.M. Fitzev//Butlerovskiye of the message, 2020. - T. 62. - No. 4. - P. 123.
7. Mycotoxins (in a food chain): monograph / K.H. Papunidi, M.Ya. Tremasov, V.I. Fisinin, A.I. Nikitin, E.I. Semyonov. - Kazan: FGBNU of "FTsTRB-VNIVI", 2017. - 158 p.
8. Mishina, N.N. A field case of transmission of desoxynivalenol in bodies of an agricultural bird / N.N. Mishina, A.Z. Mukharlyamova, E.R. Rakhmetova, I.N. Shtyrov, A.M. Sayfutdinov, E.I. Semyonov // Problems of a medical mycology, 2020. - T. 22. - No. 3. - P. 105.
9. Nurgaliyev, F.M. Chastota of development of ulcer processes in a mucous membrane of a stomach of the pigs caused by influence of mycotoxins and colonization by sort Helicobacter bacteria /
F.M. Nurgaliyev, E.I. Semyonov, O.K. Pozdeev, P.V. Sofronov//the Veterinarian, 2020. - No. 2.- P. 31.
10. Plotnikova, E.M. Studying biological properties of the culture of cages subjected to a long cryopreservation / E.M. Plotnikova, I.A. Arkharova, A.I. Samsonov, Z.G. Churin//the Veterinarian, 2018. - No.
2. - P. 7.
11. Plotnikova, E.M. The radio resistant line of cultures of cages of MDBK for a reproduction of viruses / E.M. Plotnikova, H.N. Makayev, R.N. Nizamov, A.I. Samsonov, I.A. Arkharova, R.G. Fazliakhmetov, Z.G. Churin//Materials of the international academic and research conference devoted to the 90 anniversary since the birth of professor V.A. Kirshin "Current problems of veterinary medicine". - Kazan: FGBNU of "FTsTRB-VNIVI", 2018. - P. 247.
12. Samsonov, A.I. Prevention of T-2 of toxicosis of minks / A.I. Samsonov, V.N. Dervyanov // Veterinarian, 2007. - No. 2. - P. 17.
13. Tanaseva, S.A. Monitoring of an aflatoxin of B1 in sterns of the Republic of Tatarstan / S.A. Tanaseva, O.K. Yermolaeva, L.E. Matrosova, E.I. Semyonov//the International bulletin of veterinary science, 2020. - No. 2. - P. 132.
14. Tarasova, E.Yu. Studying sorption activity of potential prophylactics of mycotoxins concerning aflatoxins / E.Yu. Tarasova, E.I. Semyonov. L.E. Matrosova, N.N. Mishina, A.Z. Mukharlyamova // Veterinarian, 2020. - No. 2. - P. 51.
15. Tertichny, M.V. Vozmozhnost of use of cultures of cages as a biological test at T-2 toxicosis / M.V. Tertichnaya, R.Ya. Gilmutdinov, M.Ya. Tremasov//the Veterinarian, 2005. - No. 2.- P. 29.
16. Tremasov, M.Ya. Current problems of veterinary toxicology / M.Ya. Tremasov, K.H. Papunidi, E.I. Semyonov, E.Yu. Tarasova//Messenger of veterinary science, 2012. - No. 4 (63). - P. 16.
17. Chervonskaya, G.P. Kultura of cages - biological model in toxicological researches /
G.P. Chervonskaya//Theses of reports of 1 congress of toxicologists of Russia. - M, 1998. - P. 328.
18. Shakurova, N.V. Influence of mycotoxins on ultrastructure of cortical elements of nephron of pigs / N.V. Shakurova, E.I. Semyonov, V.B. Savva//Scientific notes of the Kazan university. Series: Natural sciences, 2020. - T. 162. - No. 3. - P. 350.
19. Shtyrov, I.N. Analitika of data of distribution of T-2 of toxin in the Republic of Tatarstan / I.N. Shtyrov, E.I. Semyonov, L.E. Matrosova, S.A. Tanaseva, E.Yu. Tarasova, N.N. Mishina//the International bulletin of veterinary science, 2021. - No. 1. - P. 167.
20. Shuralev, E.A. T-2 toxin biotesting for Stylonychia mytilis and Daphnia magna Straus / E.A. Shuralev, L.R. Valiullin, O.V. Nikitin, E.I. Semyonov//Progress of a medical mycology, 2017. - T.17. -P. 457.
21. Shuralev, E.A. T-2 toxin biotesting for Stylonychia mytilis and Daphnia magna Straus / E.A. Shuralev, L.R. Valiullin, O. V. Nikitin, E.I. Semyonov // Advances in medical mycology. - T.17. - M.: Nat. Acad. Mikol. 2017. - S. 457.
22. Ran, Xu In-Vitro Cell Culture for Efficient Assessment of Mycotoxin Exposure Risk Mitigation / Ran Xu, Niel A. Karrow, Umesh K. Shandilya, Lv-hui Sun, Haruki Kitazawa // Toxins. - 2020. - № 12. -P. 146.
23. Samsonov, A.I. Mink farming and mycotoxicosis / A.I. Samsonov, E.I. Semenov, E.M. Plotnikova, A.I. Nikitin, K.K. Papunidi, M.Y. Tremasov, S.Yu. Smolentsev // Indian Veterinary Journal. - 2018. - T. 95. -№ 5. - P. 52.
24. Semenov, E.I. Joint effect of the mycotoxins T-2 toxin, deoxynivalenol and zearalenone on the weaner pigs against a background of the infection load / E.I. Semenov, L.E. Matrosova, M.Ya. Tremasov, E.Yu. Tarasova et al. // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2016. - № 7 (1). -P. 1860.
