CC BY
3
MEDICAL & PHARMACEUTICAL
JOURNAL "PULSE"
2022. Vol. 24. № 11
https://clinical-journal ru E-ISSN 2686-6838
RESEARCH ARTICLE 3. Medical sciences
УДК 616-036.12
Corresponding Author: Shevchenko Olga Vyacheslavovna — researcher of the Central Research Laboratory of the Pacific State Medical University, Vladivostok, Russian Federation E-mail: tarakovaolga@gmail. com
© Shevchenko O.V., Korshunova O.V., Plekhova N.G. - 2022
I Accepted: 27.11.2022
http://dx.doi.org//10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-11-18-22
ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО КОНЪЮГАТА НА ОСНОВЕ ХЛОРИНА Е6
Шевченко О.В., Коршунова О.В., Плехова Н.Г.
ФГБОУ ВО «Тихоокеанский государственный медицинский университет», г. Владивосток, Российская Федерация
Аннотация. Фотодинамическая терапия является клинически одобренным методом лечения онкопатологий, который показал большие перспективы благодаря неинвазивности и селективности в отношении пролиферирующих клеток. Потенциал данной терапии раскрыт не в должной мере, отчасти из-за отсутствия идеальных по свойствам препаратов-фотосенсибилизаторов. Одной из возможных стратегий молекулярного дизайна препаратов нового поколения является включение тяжелых атомов в их структуру. Изучены фотодинамические и фототоксические свойства новосинтезированного молекулярного конъюгата полиэтиленимин/Хлорин е6/диэтилентриаминпентауксусная кислота/фолиевая кислота/европий (PEI/e6/DTPA/FA/Eu). При оптимальных условиях облучения красным светом длиной волны 645 нм в течение 20 мин под действием молекулярного конъюгата показана эффективная гибель клеток асцитной карциномы Эрлиха. Таким образом, молекулярный конъюгат РЕ1/е6ЮТРА^А/Еи проявляет фототоксическую активность, что свидетельствует о перспективе дальнейших исследований его свойств.
Ключевые слова: фотосенсибилизатор, порфирин, поглощение, асцитная карцинома Эрлиха, фотодинамическая терапия
STUDY OF THE CYTOTOXIC EFFECT OF A MOLECULAR CONJUGATE BASED ON CHLORIN E6
Shevchenko O.V., Korshunova O.V., Plekhova N.G.
Pacific State Medical University, Vladivostok, Russian Federation
Abstract. Photodynamic therapy is a clinically approved method of cancer treatment that has shown great potential due to its non-invasiveness and selectivity for proliferating cells. However, the potential of this type of therapy has not been fully exploited, partly due to the lack of ideal photosensitizer drugs. One of the possible strategies for the molecular design of new generation drugs is the inclusion of heavy atoms into the structure of such compounds. The photodynamic and photocytotoxic properties of the newly synthesized molecular conjugate based on Chlorin e6 with europium were studied. Optimal irradiation conditions were selected and effective cell death of Ehrlich's ascitic carcinoma under the action of a molecular conjugate upon irradiation with red light at a wavelength of645 nm for 20 min was shown. At this stage, the PEI/e6/DTPA/FA/Eu molecular conjugate exhibits confirmed photodynamic activity, which indicates the prospect of further research.
Keywords: photosensitizers, porphyrins, excitation wavelength, photodynamic therapy, oncological diseases
Введение. За последние несколько десятилетий клинически одобренная фотодинамическая терапия (ФДТ) заняла позиции перспективного метода лечения поверхностных новообразований [1, 2]. ФДТ клинически одобрена для лечения таких видов злокачественных новообразований как опухоли молочной железы, внутриглазные, головного мозга, головы и шеи, кожные, внутрибрюшинные, мезотелиомы, холангиокарциномы, колоректальные и другие [2]. Действие данной терапии основано на фотохимической реакции светочувствительного
соединения в ответ на облучение различными длинами волн. Индуцированная ФДТ регрессия опухоли является следствием сложных механизмов, включающих прямое разрушение клеток, повреждение сосудистой сети и иммунный ответ организма [3, 4]. Тем не менее, для этого лечения существуют некоторые ограничения, а именно: при проведении терапии малая глубина проникновения света в ткани, плохая стабильность и растворимость в воде фотосенсибилизаторов (ФС), их сложный синтез и очистка [5]. Для преодоления этих
https://clinical-journal. ru
2022. Vol. 24. № 8
Issue Doi: 10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-6
E-ISSN 2686-6838
недостатков учеными разрабатывается большое количество новых мультифункциональных конъюгатов [5]. Одна из возможных стратегий синтеза - введение тяжелых атомов или элементов с высоким зарядом в структуру ФС для улучшения фотостабильности, фотофизических и
фотохимических свойств. В таком случае, благодаря сопряжению синглетного и триплетного состояний при облучении ФС усиливается под его влиянием эффективность генерации активных форм кислорода (АФК) [6, 7]. Цель настоящего исследования - определение фотодинамической и фотоцитотоксической активности молекулярного конъюгата полиэтиленимин/Хлорин
е6/диэтилентриаминпентауксусная кислота/фолиевая кислота/европий
(РЕУеб/DTPA/FA/Eu) при воздействии волной диапазона красного света.
Материал и методы. Синтез молекулярного конъюгата РЕУеб/DTPA/FA/Eu осуществляли по разработанной нами раннее методике [8]. Спектры поглощения ФС, растворенного в фосфатно-солевом буфере (Sigma-Aldrich, США), измеряли на спектрофотометре (BioTek Synergy H1, США) в диапазоне 220 - 800 нм. Флуоресцентные параметры и фотодинамический потенциал оценивали при значениях возбуждение/испускание
(excitation/emission) 485/530 нм после облучения растворов с молекулярным конъюгатом или Хлорина е6 полупроводниковым лазером красного света (ООО «Свет и жизнь», Россия) длиной волны 645 нм.
Для исследования фотоцитотоксичности ФС использовали культуру клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха в концентрации 1*106 кл/мл в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (Lonza, Verviers, Бельгия), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Life Technologics Inc., США) и 0.05% гентамицина (Sigma Aldrich, США). Клетки с внесенным с молекулярным конъюгатом или Хлорином е6 в концентрации 1,56; 3,125; 6,25; 12,5 мкг/мл
оставляли на 1 сутки в термостате при 37°C, 5% CO2. После чего непоглощенные клетками соединения удаляли путем 2-х кратного отмывания монослоя средой Игла с последующим облучением красным светом длиной волны 645 нм в течение 20 мин. Фотоцитотоксичность определяли через 1 и 4 сут после облучения клеток при добавлении 5 мкл флуресцентного маркера 7-Аминоактиномицин D (7-AAD, BioLegend, США) и инкубировании в течение 10 мин. Результаты оценивали, используя проточный цитофлуориметр (MACSQuant, Германия), лазерный канал возбуждения 488 нм. Обсчет данных осуществляли с помощью программного обеспечения Kaluza Analysis (Beckman Coulter, США).
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Microsoft Office (Excel) и Prism 7 (GraphPad Software Inc. v.7, Сан-Диего, США). Различия между данными являлись достоверными при p<0,05.
Результаты и обсуждение. Одним из способов качественной идентификации порфирина в структуре ФС является исследование характерных максимумов поглощения. Для порфириновых структур специфичными являются две оптические области: полоса Соре 380-420 нм и менее интенсивная полоса Q 500-750 нм. В спектре поглощения молекулярного конъюгата
PEI/e6/DTPA/FA/Eu присутствуют максимумы при 403 и 662 нм, что подтверждает наличие Хлорина е6 в его составе (рис. 1) [9]. Известно, что рецептор фолиевой кислоты является признанным биомаркером из-за его сверхэкспрессии преимущественно на большом количестве опухолевых клеток. Следовательно, он широко используется как диагностический и терапевтический инструмент для обеспечения адресной доставки и визуализации раковых клеток [10]. В связи с этим в структуру молекулярного конъюгата нами введена фолиевая кислота, наличие которой также подтверждается максимумом при 287 нм в спектре поглощения (рис. 1).
Рис. 1 - Спект поглощения Хлорина е6 и РЕ1/е6ЮТРА/БА/Еи 60 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере при рН=7,4:
X - длина волны, нм
2022. Vol. 24. № 11
Issue Doi: 10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-11
https://clinical-journal. ru
E-ISSN 2686-6838
Fig.1 - Absorption spectrum of Chlorin e6 and PEI/e6/DTPA/FA/Eu 60 ^g/ml in phosphate buffered saline at pH = 7.4:
X - is the wavelength, nm
Вследствие фотонестабильности препаратов для ФДТ, одним из важнейших направлений является исследование явления
«фотовыгорания/фотообесцвечивания» (рЬо1оЫеасЫп§) вещества. В процессе реакции происходит разрыв ковалентных связей и инициируются неспецифические взаимодействия между флуорофором и окружающими молекулами [11] в результате чего происходит переход флуорофора из синглетного состояния в триплетное. То есть существует ограниченное количество циклов поглощения кванта света до полной деградации вещества и невозможности запуска фотодинамической реакции. В ходе эксперимента
200000
3 | 160000 £
о .£
s «
S tu = >-
5 «
H s
ф
ù
мы определили оптимальное время облучения молекулярного конъюгата PEI/e6/DTPA/FA/Eu длиной волны красного света 645 нм. Изменения значений флуоресценции и возможность генерации активных форм кислорода оценивали с помощью зонда 2',7'-Дихлор-дигидро-флуоресцеин диацетат (БРС-БЛ, Sigma-Aldrich, США). В процессе диффузии DFC-DA диацелируется клеточными эстеразами до нефлуоресцентного соединения и быстро окисляется АФК до сильно флуоресцеирующего дигидрофлуоресцеина (DFC). При этом интенсивность флуоресценции пропорциональна уровню АФК (рис. 2).
—•—Хлорин еб (СЫопп еб)
—•—РЕ1/е6/ОТРАУРА/Еи
Я1
о.
С CJ I-
ч 2 © -5
ь
120000
80000
40000
5 10 15 20 25 30
Время облучения, мин Irradiation time, min
Рис. 2 - Изменение интенсивности флуоресценции молекулярного конъюгата PEI/e6/DTPA/FA/Eu и Хлорина е6 при облучении красным светом длиной волны 645 нм.
Fig.2 - Change in the fluorescence intensity of the molecular conjugate PEI/e6/DTPA/FA/Eu and Chlorin e6 when irradiated with red light at a wavelength of 645 nm.
Исходя из полученных данных, в качестве оптимального времени облучения выбрано 20 минут. Стоит отметить, что позднее отмечается деградация и флуоресцентного зонда и, возможно, ФС. При подобранных условиях эффективность генерации АФК РЕ1/е6ЮТРА^А/Еи в 11,45 раз превышает значения для свободного Хлорина е6.
На культуре асцитной карциномы Эрлиха исследована жизнеспособность клеток после внесения конъюгата РЕ1/е6ЮТРА^А/Еи и облучения 645 нм в течение 20 мин с применением флуоресцентного зонда. Зонд 7-Аминоактиномицин Б 7-AAD представляет собой флуоресцентное химическое соединение с сильным сродством к ДНК. Клетки с поврежденными мембранами
содержат этот зонд 7-AAD, тогда как живые клетки с неповрежденными клеточными мембранами его не включают. Результаты исследований показывают, что на 1 сутки после облучения 645 нм количество мертвых клеток после воздействия молекулярным конъюгатом и свободным Хлорином еб в дозе 1,5 мкг/мл составило 33,53% и 14,55% соответственно. Для максимальной дозы 12,5 мкг/мл эти значения составили 51,81 и 42,98%, тогда как для клеток, которым препараты не вносили и не облучали, 8,04% (отрицательный контроль) и для клеток без добавления ФС, но облученных, 11,01% (положительный контроль). На 4 сутки при концентрации 1,5 мкг/мл количество клеток, содержащих 7-AAD, достигло 48,07% для
2022. Vol. 24. № 8
Issue Doi: 10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-6 —--—
hllps: clinical-journal. ru
E-ISSN 2686-6838
РЕ1/е6/ОТРА/РА/Еи и 29,34% для Хлорина е6. При воздействии максимальной дозы молекулярного конъюгата количество флуоресцирующих клеток составило 96,5%, тогда как для свободного Хлорина е6 этот показатель был в 1,6 раза меньше. Процент гибели клеток отрицательного контроля составил
120 п
100 -
80 -
< 60
40
20
11,2% и для положительного 15,01% (рис. 3). Таким образом, полученные экспериментальные данные подтверждают выраженное цитотоксическое действие молекулярного конъюгата на клетки асцитной аденокарциномы Эрлиха на 4 сутки после облучения красным светом.
■ РЕ1/е6/ОТРА/РА/Еи ■ Хлорин еб (СЫогт еб)
Клетки без облучения (Cells without irradiation)
Клетки с облучением (Cells with irradiation)
1,5
3,125
6,25
12,5
Дозы, мкг/мл Dose, (Ig/ ml
Рис. 3 - Жизнеспособность клеток асцитной карциномы Эрлиха при добавлении конъюгата PEI/e6/DTPA/FA/Eu и Хлорина е6, 4 сут после облучения красным светом длиной волны 645 нм в течение 20 мин.
Ось абсцисс: % 7-AAD+ клеток.
Fig.3 - Cell viability of Ehrlich ascites carcinoma with PEI/e6/DTPA/FA/Eu molecular conjugate or free Chlorine on the 4th day after irradiation with 645 nm red light for 20 min e6: 7-AAD - cell viability marker
Заключение. Введение тяжелого атома в структуру ФС РЕ1/е6/БТРА/РА/Еи демонстрирует
преимущества новосинтезированного конъюгата при ФДТ по сравнению с действием свободного Хлорина е6. Так, при облучении красным светом конъюгата отмечается увеличение времени жизни триплетного возбужденного состояния при передаче энергии между люминофором (европием) и ФС (Хлорином е6). Как результат, усиливается генерация активных форм кислорода металлосодержащим порфирином. В настоящем исследовании представлены данные по изучению
биологических свойств молекулярного конъюгата РЕУеб/БТРА/БА/Еи. Показано, что воздействие конъюгата РЕУеб/БТРА/БА/Еи увеличивает гибель опухолевых клеток карциномы Эрлиха на 4 сутки после облучения в 1,55 раза по сравнению с действием свободного Хлорина е6. Таким образом, дальнейшие исследования нового потенциального ФС являются перспективными, но не только в области ФДТ, но также и для оценки синергетического действия конъюгата на опухолевые клетки.
REFERENCES
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
[1]. Chen Y., Zhang L., Li F., Sheng J., Xu C., Li D., Liu, W. Combination of chemotherapy and photodynamic therapy with oxygen self-supply in the form of mutual assistance for cancer therapy. International Journal of Nanomedicine. 2021. vol. 16. P. 3679. doi: 10.2147/IJN.S298146
[2]. Gunaydin G., Gedik M. E., Ayan S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-a review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 2021. P. 608. doi.org/10.3389/fchem.2021.686303
[3]. Agostinis P., Berg K., Cengel K. A., Foster T. H., Girotti A. W., Gollnick S. O., Golab J. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA: a cancer journal for clinicians. 2011. vol. 61. №. 4. P. 250-281. https://doi.org/! 0. 3 322/caac .20114
[1]. Chen Y., Zhang L., Li F., Sheng J., Xu C., Li D., Liu, W. Combination of chemotherapy and photodynamic therapy with oxygen self-supply in the form of mutual assistance for cancer therapy. International Journal of Nanomedicine. 2021. vol. 16. P. 3679. doi: 10.2147/IJN.S298146
[2]. Gunaydin G., Gedik M. E., Ayan S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-a review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 2021. P. 608. doi.org/10.3389/fchem.2021.686303
[3]. Agostinis P., Berg K., Cengel K. A., Foster T. H., Girotti A. W., Gollnick S. O., Golab J. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA: a cancer journal for clinicians.
https://ctinical-joumaL ru
2022. Vol. 24. № 11
Issue Doi: 10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-11
E-ISSN 2686-6838
HI-
[5].
[6].
brahamse II., Hamblin M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 2016. vol. 473. №. 4. P. 347-364. https://doi.org/10.1042/BJ20150942 Karges J. Clinical development of metal complexes as photosensitizers for photodynamic therapy of cancer. Angewandte Chemie International Edition. 2022. vol. 61. 5. P. e202112236. https://doi.org/10.1002/anie.202112236 Nguen H. Q., Zhdanova K. A., Uvarova V. S., Bragina N. A., Mironov A. F., Chupin V. V., Shvets V. I. Development and characterization of nanoparticles prepared from the mixture of triterpenoids and amphiphilic meso-arylporphirins. Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2015. vol. 41. №. 2. P. 161-169. doi.org/10.1134/S1068162015020107 Fan H., Zhang L., Hu X., Zhao Z., Bai H., Fu X., Tan W. An MTH1-targeted nanosystem for enhanced PDT via improving cellular sensitivity to reactive oxygen species. Chemical Communications. 2018. vol. 54. №. 34. P. 43104313. doi.org/10.1039/C8CC01841C Шевченко, О. В., Панкратов, Н. Р., Фильштейн, А. П., Медков, М. А., Апанасевич, В. И., Тананаев, И. Г., Лукьянов, П. А. Молекулярные комплексы хлорина Е6 и европия для радиофотодинамической терапии. Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. 2020. №. 2. Р. 103-107. Jain R., Pradhan R., Hejmady S., Singhvi G., Dubey S. K. Fluorescence-based method for sensitive and rapid estimation of chlorin e6 in stealth liposomes for photodynamic therapy against cancer. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 2021. vol 244. P. 118823. doi.org/10.1016/j.saa.2020.118823
[10]. Fernández M., Javai, F., Chudasama V. Advances in targeting the folate receptor in the treatment/imaging of cancers. Chemical science. 2018. vol. 9. №. 4. P. 790-810. doi.org/10.1039/C7SC04004K
[11]. Demchenko A. P. Photobleaching of organic fluorophores: quantitative characterization, mechanisms, protection //Methods and Applications in Fluorescence. - 2020. - Т. 8. - №. 2. - С. 022001. doi.org/10.1088/2050-6120/ab7365
P.
250-281.
[7].
[8].
[9].
2011. vol. 61. №. 4. https://doi.org/l0.3322/caac.20l 14
[4]. Abrahamse H., Hamblin M. R. New photosensiti/ers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 2016. vol. 473. №. 4. P. 347-364. https://doi.org/10.1042/BJ20150942
[5]. Karges J. Clinical development of metal complexes as photosensitizers for photodynamic therapy of cancer. Angewandte Chemie International Edition. 2022. vol. 61. 5. P. e202112236. https://doi.org/10.1002/anie.202112236
[6]. Nguen H. Q., Zhdanova K. A., Uvarova V. S., Bragina N. A., Mironov A. F., Chupin V. V., Shvets V. I. Development and characterization of nanoparticles prepared from the mixture of triterpenoids and amphiphilic meso-arylporphirins. Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2015. vol. 41. №. 2. P. 161-169. doi.org/10.1134/S 1068162015020107
[7]. Fan H., Zhang L., Hu X., Zhao Z., Bai H., Fu X., Tan W. An MTH1-targeted nanosystem for enhanced PDT via improving cellular sensitivity to reactive oxygen species. Chemical Communications. 2018. vol. 54. №. 34. P. 4310-4313. doi.org/10.1039/C8CC01841C
[8]. Шевченко, О. В., Панкратов, Н. Р., Фильштейн, А. П., Медков, М. А., Апанасевич, В. И., Тананаев, И. Г., Лукьянов, П. А. Молекулярные комплексы хлорина Е6 и европия для радиофотодинамической терапии. Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. 2020. №. 2. Р. 103-107.
[9]. Jain R., Pradhan R., Hejmady S., Singhvi G., Dubey S. K. Fluorescence-based method for sensitive and rapid estimation of chlorin e6 in stealth liposomes for photodynamic therapy against cancer. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 2021. vol 244. P. 118823. doi.org/10.1016/j.saa.2020.118823
[10]. Fernández M., Javai, F., Chudasama V. Advances in targeting the folate receptor in the treatment/imaging of cancers. Chemical science. 2018. vol. 9. №. 4. P. 790-810. doi.org/10.1039/C7SC04004K
[11]. Demchenko A. P. Photobleaching of organic fluorophores: quantitative characterization, mechanisms, protection //Methods and Applications in Fluorescence. -2020. - Т. 8. - №. 2. - С. 022001. doi.org/10.1088/2050-6120/ab7365
Вклад авторов. Шевченко О.В. - выполнение экспериментальной части, написание текста; Коршунова О.В. - обзор литературы, оформление; Плехова Н.Г. - концепция и дизайн исследования.
Заявление о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Шевченко О.В. - SPINID:1714-4566; ORCID ID: 0000-0002-3113-3995
Коршунова О.В. - SPINID:1716-0804; ORCID ID: 0000-0003-3533-8506
Плехова Н.Г. - SPIN-ID: 88-673; ID ORCID: 0000-0002-8701-7213
For citation: Shevchenko O.V., Korshunova O.V., Plekhova N.G. STUDY OF THE CYTOTOXIC EFFECT OF A MOLECULAR CONJUGATE BASED ON CHLORIN E6. // Medical & pharmaceutical journal "Pulse". - 2022;24(11): 18-22. http://dx.doi.org//10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-11-18-22.
Author Contribution. Shevchenko O.V. - experimental part, writing the text; Korshunova O.V. - literature review, design;
Plekhova N.G. - the concept and design of the study.
Conflict of Interest Statement. The authors declare no conflict of interest.
Shevchenko O.V. - SPIN ID:1714-4566; ORCID ID: 0000-0002-3113-3995
Korshunova O. V. - SPIN ID:1716-0804; ORCID ID: 0000-0003-3533-8506
Plekhova N. G.-SPIN-ID: 88-673; ID ORCID: 0000-0002-8701-7213
Для цитирования: Шевченко О.В., Коршунова О.В., Плехова Н.Г. ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО КОНЪЮГАТА НА ОСНОВЕ ХЛОРИНА Е6 // Медико-фармацевтический журнал "Пульс". 2022;24(11): 18-22. http://dx.doi.org//10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-11-18-22.
