CC BY
100
[гиена и санитария 5/2012
О Н. В. ДУДЧИК, 2012 УДК 614.77:579.22]-078
Н. В. Дудчик
ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ КОНСОРЦИУМА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ КАК ТЕСТ-ОБЪЕКТОВ для ОцЕНКИ ИНТЕГрАлБНОй ТОКСИчНОСТИ
ГУ Республиканский научно-практический центр гигиены, Минск, Беларусь
Изучены свойства консорциума микроорганизмов ИнМИ/ЦГ7, выделенного при проведении гигиенического мониторинга из образцов промышленных стоков. Показано, что способность штаммов к образованию биопленок коррелирует с их чувствительностью к токсикантам.
Ключевые слова: консорциум, биотестирование, пленкообразование, чувствительность к токсикантам
DudchikN.V - INVESTIGATION OF THE PROPERTIES OF THE SOIL MICROBIAL CONSORTIUM AS A TEST OBJECTS FOR ESTIMATION OF INTEGRAL TOXICITY
State Institution "The Republican scientific - practical center of hygiene", Minsk
The properties of a consortium of microorganisms InMI/СH7 selected from of industrial effluent samples have been investigated. The ability of strains to form biofilms was shown to be correlated with their sensitivity to toxicants.
Key words: consortium, bioassay, film formation , sensitivity to toxicants
В настоящее время в микробиологии наблюдается переход от традиционного представления о микроорганизмах как строго одноклеточных организмах к представлению о микробных сообществах как целостных структурах, регулирующих жизненные функции в зависимости от изменения условий обитания. Генотипические и фенотипические признаки штаммов, образующих консорциум, значительно отличаются как от типовых признаков составляющих консорциум микроорганизмов, так и от свойств самого консорциума. Это относится к показателям метаболической активности, способности продуцировать экзогенные ферменты, устойчивости к антибиотикам и дезсредствам, способности утилизировать различные субстраты и т. д. Как правило, консорциумы представляют природные ассоциации, но могут быть селектированы путем отбора штаммов с заданными свойствами [1, 2, 8, 10, 11].
Принимая во внимание вышесказанное, задачей нашего исследования было изучение свойств штаммов микроорганизмов, а также консорциума ИнМИ/ЦГ7 как тест-объектов для определения интегральной токсичности объектов окружающей среды, в частности их способности к образованию биопленок, а также чувствительности к химическим токсикантам.
Материалы и методы
При проведении испытаний использовали стандартное оборудование микробиологических лабораторий, а также следующие реактивы и питательные среды: мя-сопептонный агар, глюкоза, манит, кальций хлористый, магния сульфат, кальций хлористый, железо хлорное, натрий хлористый, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат калия, генцианвиолет - производства Российской Федерации, среда TSB - "bioMerieux", Франция. Импе-диметрические исследования проводили на анализаторе БакТрак4300 ("SY Lab", Австрия), оптические измерения - на планшетном ридере ("BioRad 680", Великобритания).
Консорциум микроорганизмов и штаммы Arthrobacter spp. ЦГ2, Rhodoccus spp. ЦГ5 культивировали на мясо-
Дудчик Н. В. - канд. биол. наук, зав. лаб. микробиологии (n_dudchik@tut.by, rspch.rspch@by).
пептонном агаре. Штамм Azotobacter spp. ЦГ10 культивировали на агаризованнй безазотистой среде следующего состава: глюкоза - 10 г, маннит - 10 г, CaCO3 -1 г, MgSO4 - 0,2 г, CaCl - 0,02 г, FeCl3 - 0,02 г, раствор микроэлементов 10% - 0,01 мл.
Изучение способности к пленкообразованию. Штаммы инокулировали в 10 мл среды TSB c 1% раствором глюкозы и инкубировали в течение 36 ч при 28°C, а затем разводили 1:100 свежей средой и вносили по 200 мкл в лунки планшета. Отрицательный контроль содержал 200 мкл стерильной среды TSB c 1% раствором глюкозы. Планшеты инкубировали в течение 24 ч при 280С. Затем содержимое лунок удаляли, промывали троекратно фосфатным буфером, высушивали, окрашивали раствором генцианвиолета (50 мкл/лунка) в течение 10 мин, промывали фосфатным буфером, затем добавляли 96° этиловый спирт (200 мкл/лунка) и детектировали оптическую плотность при длине волны Т 540 нм. Исследования проводили троекратно не менее чем в трех повторностях для каждого штамма.
Поведение ростового теста. Мясопептонный бульон разливали в измерительные ячейки микробиологического анализатора с импедиметрическим принципом детекции по 4,5 мл, инокулировали 0,1 мл рабочей суспензии тест-штамма с клеточной плотностью 107 клеток /мл. Контролем служили ячейки с культуральной средой, инокулированной 0,1 мл рабочей суспензии тест-штамма, не содержащей исследуемого образца. Исследования проводили троекратно не менее чем в трех повторностях для каждого штамма и каждого исследуемого образца.
Результаты и обсуждение
Термин "консорциум" используется для описания различных коопераций микроорганизмов [2]. Консорциум ИнМИ/ЦГ7 представляет собой стабильную природную ассоциацию микроорганизмов, которая сформировалась в результате длительного воздействия химических контаминантов техногенного и антропогенного происхождения. Штаммы были выделены при проведении гигиенического мониторинга образцов промышленных стоков, содержащих хлорорганические пестициды и тяжелые металлы. Определение систематического положения отобранных штаммов в соот-
82
Таблица 1
Интерпретация результатов пленкообразования тест-объектов
Среднее значение ОП
Способность к пленкообразованию
< 2 • ОП
ок
2•ОП -4•ОП
ок о
> 4 • ОП
Отсутствует/ слабо выражена Умеренная Сильная
Примечание. ОПок - среднее значение оптической плотности отрицательного контроля + 3 стандартных отклонения оптической плотности отрицательного контроля.
Таблица 2
Способность к образованию биопленок штаммами микроорганизмов, а также консорциумом инМи/цГ7
Тест-объект
Способность к пленкообразованию
Azotobacter spp. ЦГ 10 Arthrobacter spp. ЦГ 2 Rhodoccus spp. ЦГ5 Консорциум ИнМИ/ЦГ7
Отсутствует Слабо выражена Отсутствует Умеренная
ветствии с определителем бактерий Берги позволило идентифицировать Azotobacter sp.U,ri0, Arthrobacter sp. ЦГ2, Rhodoccus sp. ЦГ5 (рабочая коллекция Республиканского научно-практического центра гигиены). Бактерии родов Azotobacter, Arthrobacter, Rhodoccus являются представителями аутохтонной почвенной микрофлоры. Соотношение штаммов бактерий в консорциуме составляет 33% для каждого штамма, но может незначительно варьировать в зависимости от способа и среды культивирования.
Образование биопленок изучали количественным методом TCP (tissue culture plate method), являющимся золотым стандартом при изучении биопленок, так как метод минимизирует получение ложноположительных и ложноотрицательных результатов при высокой чувствительности, специфичности и точности. Интерпретацию степени пленкообразования проводили в соответствии с общепринятым критерием Stepanovic (табл. 1) [9].
Полученные результаты показали, что из 3 штаммов консорциума лишь Arthrobacter sp. ЦГ2 обладает слабо выраженной способностью к пленкообразованию, а у штаммов Azotobacter sp. ЦГ10 и Rhodoccus sp. ЦГ5 способность к пленкообразованию отсутствует. В то же время консорциум имеет более выраженную способность к образованию биопленок, которую можно отнести к умеренной по критерию Stepanovic (табл. 2).
Изучение чувствительности тест-объектов к токсическим воздействиям
Исследования проводились с использованием ростового теста с импедиметрическим способом детекции роста микроорганизмов. В настоящее время в лабораторной практике при оценке токсичности наиболее широко используется ростовой бактериальный тест с оптическим способом детекции [8, 12]. Однако
Т аблица 3
оценка чувствительности тест-объектов к интегральному токсическому воздействию в ростовом тесте
Тест-объект IDTr *, ч idt, * Т1 idt, * Т2
Azotobacter spp. ЦГ-10 4,2±0,13 4,5±0,20 1,07 4,2±0,19 1,0
Arthrobacter spp. ЦГ-2 4,3±0,12 5,9±0,20 1,37 4,3±0,20 1,0
Rhodoccus spp. ЦГ-5 5,3±0,10 5,3±0,13 1.0 5,3±0,16 1,0
Консорциум ИнМИ/ЦГ7 3,1±0,18 9,0±0,21 2,90 3,1±0,2 1,0
Примечание.
приведены средние результаты трех измерений.
оптический принцип детекции имеет ограничения при анализе непрозрачных, темноокрашенных, негомогенных образцов, что в значительной степени затрудняет, а в некоторых случаях делает невозможным анализ объектов окружающей среды. Кроме того, этот способ детекции обладает низкой чувствительностью, что приводит к необходимости длительного времени проведения испытаний.
Ранее нами было показано, что для оценки токсичности потенциально опасных химических веществ может быть успешно применена импедиметрическая детекция параметров роста и развития популяции тест-микроорганизмов в условиях периодической культуры [1, 4, 7]. Для оценки токсических воздействий целесообразно определение продолжительности лаг-фазы кривой роста тест-штамма микроорганизма.
Оценивали показатель интегральной токсичности двух проб почв с использованием Azotobacter spp. ЦГ10, Arthrobacter spp. ЦГ2, Rhodoccus spp. ЦГ5, а также консорциума ИнМИ/ЦГ7. Предварительный химический анализ проб почв показал, что проба 1 была контаминирована солями свинца и хлорорганическими пестицидами, превышавшими регламентированные уровни.
Оценка степени токсического воздействия основывалась на сравнении параметра времени детекции IDT (Impedance Detection Time) в контроле (IDT) и опыте (IDT), полученных с помощью программного обеспечения прибора.
Чувствительность к интегральному токсическому воздействию для тест-культуры рассчитывали по формуле
IDT
Т =----- , (1)
IDT
где 1 - чувствительность к интегральному токсическому воздействию, IDTk - значение времени детекции в контроле, IDTo - значение времени детекции в опыте.
При Т = 1 считали штамм нечувствительным, при Т = 1,1—1,5 - умеренно чувствительным, при Т = 1,6 и более - чувствительным к интегральному токсическому воздействию.
Полученные результаты приведены в табл. 3.
Результаты указывают на то, что чувствительность штаммов, составляющих консорциум, различалась и отличалась от чувствительности консорциума, которая к интегральному токсическому воздействию превышала чувствительность отдельных штаммов в 2,1-2,9 раза.
Важно отметить, что более высокая чувствительность к интегральному токсическому воздействию в ростовом тесте коррелировала со способностью микроорганизмов образовывать биопленки, состоящие из микроорганизмов нескольких видов. Эти результаты хорошо согласуются с данными о том, что микроорганизмы в составе консорциумов способны обмениваться сигналами и проявлять координированную активность, свойственную многоклеточным микроорганизмам [1].
Таким образом, консорциум ИнМИ/ЦГ7 может обеспечить расширение арсенала чувствительных тест-объектов, что дает возможность надежно определять интегральную токсичность объектов окружающей среды с использованием биотестирования.
83
[гиена и санитария 5/2012
Литер атур а
1. Ананьина Л. Н. Нафталинметаболизирующий консорциум микроорганизмов, выделенный из засоленной почвы: Авто-реф. дис. ... канд. биол. наук. - Пермь, 2007.
2. Грузина В. Д. // Антибиотики и химиотер. - 2003. - Т. 48, №
10. - С. 32-39.
3. ДудникН. В. // Вестн. Рос. воен.-мед. акад. - 2008. - Ч. 1. - С. 148-149.
4. ДудникН. В. // Гиг. и сан. - 2009. - № 1. - С. 84-87.
5. ДудникН. В. и др. // Мед. журн. - 2010. - № 3. - С. 143-145.
6. Патент BY 13064 от 01.05.10. Способ оценки интегральной токсичности твердого или жидкого объекта окружающей среды. Соколов С. М., Дудчик Н. В., Мельникова Л. А., Ко-теленец А. И. // Официальный бюллетень НЦИС РБ. - 2010. - № 2. - С. 104.
7. Патент BY 13667 от 03.13.09. Способ оценки модулирующего действия образца поверхностных, подземных или сточных вод на рост популяции бактерий рода Pseudomonas. Дудчик Н. В. и др. // Официальный бюллетень ЦНИС РБ. - 2010. - № 5. - С. 128.
8. Холоденко В. П. и др. // Рос. хим. журн. - 2001. - Т. 45, № 35-36. - С. 135-143.
9. Hassan A. et al. // Braz. J. Infect. Dis. - 2011. - Vol. 15, N 4. - P. 305-311.
10. Molina C. et al. // Biodegradation. - 2009. - Vol. 20, N 6. - P. 789-800.
11. O'Tool G. et al. // Ann. Rev. Microbiol. - 2000. - Vol. 54. - P. 49-79.
12. Vidic T. et al. // Environ. Toxicol. - 2009. - Vol. 24, N 5. - P. 472-483.
Поступила 10.02.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 613.471-078
О. О. Синицына1, А. В. Задиран2, Т. З. Артемова1, Е. К. Гит1, А. В. Загайнова1, Н. Н. Буторина1
ОЦЕНКА ИНФОРМАТИВНОСТИ ИНДИКАТОРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ САНИТАРНОэпидемиологической безопасности плавательных бассейнов
1ФГБУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина Минздравсоцразвития России; 2ГБУЗ Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии Департамента здравоохранения Москвы, филиал "Вишняковский", Москва
В воде и смывах с поверхностей 15 общественных закрытых плавательных бассейнов (ПБ) Москвы, в которых обеззараживание и дезинфекцию осуществляли препаратами хлора, выявлено превышение нормативов по бактериологическим показателям, выделены возбудители грибковых заболеваний кожи и ногтевых пластин. В ходе исследования установлено отсутствие эпидемически значимой информативности нормируемых индикаторных показателей в отношении возбудителей грибковых заболеваний, а также несоответствие эффективности существующих рекомендаций по проведению дезинфекционных мероприятий требованиям санитарно-эпидемиологической безопасности посетителей ПБ.
Ключевые слова: плавательный бассейн, обеззараживание, санитарно-эпидемиологическая безопасность, бактериологические и микологические показатели, грибы рода Candida,
O. O. Sinitsyna1, A. V Zadiran2, T. Z. Artemova1, E. K. Gipp1, A.V.Zagaynova1, N.N.Butorina1 — EVALUATION OF THE INFORMATIVITY OF INDICES OF THE SANITARY-EPIDEMIOLOGICAL SAFETY OF THE SWIMMING POOLS
1Federal State Budgetary Istitution "A.N. Sysin Research Institute of Human Ecology and Enviromental Health" of the Ministry of Health Care and Social Development; 2Federal The State Budget Health Care institution of Moscow "Scientific-and-Practical Center for Dermatovenereology and Cosmetology" of the Health Department of the City of Moscow, branch "Veshnyakovsky"
Water samples and surface swabs from 15 Moscow public indoor swimming pools (SP), where disinfection was carried with the ту of chlorine reagents, were studied and excess of bacteriological indicators standards was revealed, infestants of fungous skin and nails diseases were allocated. The research results showed both the absence of epidemic significant information value of bacteriological indicators in relation to infestants offungous diseases and discrepancy of efficiency of existing recommendations for disinfection actions to requirements on providing sanitary-and-epidemiologic safety of SP visitors.
Key words: swimming pool, disinfection, sanitary-and-epidemiologic safety, bacteriological and mycological indicators, Candida funguses, Trichophyton rubrum
В России в течение последних лет расширилась сеть плавательных бассейнов (ПБ), аквапарков и других искусственных водных объектов спортивного и рекреационного назначения, как государственных и
Синицина О. О. - д-р мед. наук, зам. дир. по научной работе (labtox430@mail.ru); Задиран А. В. - врач-дерматовенеролог (alina. zadiran@yandex.ru); Артемова Т. З. - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаб. санитарной бактериологии и паразитологии (milkbacterialab@ list.ru); Гипп Е. К. - канд. мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. санитарной бактериологии и паразитологии; Загайнова А. В. - канд. биол. наук, ст. науч. сотр.; БуторинаН. Н. - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. санитарной бактериологии и паразитологии.
муниципальных, так и частных. В качестве объектов коллективного рекреационного водопользования ПБ являются лидерами по содержанию в воде и на поверхностях возбудителей различных инфекционных заболеваний кожи, слизистых оболочек, ногтевых пластин, в том числе грибковых, таких как микозы, онихомикозы, эпидермофитии и др. [9]. Однако в рамках производственного контроля и государственного надзора эпидемическая безопасность ПБ оценивается преимущественно (вода) или исключительно (поверхности) по бактериологическим показателям [8]. Считается, что принятая в международной практике система рутинного санитарно-микробиологического контроля, осно-
84
