CC BY
72
УДК 579.842.1/.2
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, ИЗОЛИРОВАННЫХ ОТ ПАЦИЕНТОВ МНОГОПРОФИЛЬНОГО ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО УЧРЕЖДЕНИЯ
М.В. Кузнецова12, Е.В. Афанасьевская2, Т.И. Карпунина2
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,
2Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера Росздрава
Карпунина Тамара Исаковна, д. б. н., профессор ПГМА - 614001 г. Пермь, ул. Куйбышева, д. 39.
Раб. тел.: (342) 236-44-85, e-mail: karpuninapsma@mail.ru
При оценке распространенности антибиотикорезистентности, гемолитической активности и способности к формированию биоплёнок среди 42 клинических штаммов энтеробактерий показано, что 35,7% культур были полирезистентными, 30,9% проявляли способность к пленкообразованию, 69,0% - проявляли гемолитические свойства. Сочетание полирезистентности и гемолитической активности выявлено у 23,8% штаммов. Одновременное наличие трех изучаемых признаков выявлено лишь у 4,8% изолированных культур. Проведенный ПЦР-анализ присутствия генов БЛРС в изучаемых штаммах показал, что наиболее часто встречались бета-лактамазы классов ТЕМ - 26,2%, SHV -23,8% и CTX-М - 7,1%.
Ключевые слова: энтеробактерии, антибиотикорезистентность, бета-лактамазы, биопленки, гемолитическая активность.
Evaluation of the spread of antibiotic resistance, hemolytic activity and ability to biofilm formation that was carried out with 42 clinical enterobacteria strains demonstrated that 35,7% of cultures were multi-resistant, 30,9% manifested the ability to biofilm formation, 69,0% showed hemolytic properties. Combination of multi-resistance and hemolytic activity was revealed in 23,8% strains. Concurrent availability of three characteristics under study was only found in 4,8% of the isolated cultures. The PCR assay aimed in detection of ESBL gene presence in the above strains indicated that most frequently occurred beta-lactamases of the classes such as TEM - 26,2%, SHV - 23,8%, and CTX-M - 7,1%.
Key words: enterobacteria, antibiotic resistance, beta-lactamases, biofilms, hemolytic activity.
РАЗДЕЛ II
РАЗДЕЛ II
Среди большого круга проблем, связанных с устойчивостью к антибиотикам госпитальной микрофлоры, одной из наиболее значимых в России является полирезистентность ряда грамотрицательных бактерий сем. Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp. и др.), обусловленная образованием этими бактериями бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) [1]. В этиологии внутрибольничных инфекций представители кишечных бактерий удерживают лидирующие позиции, а самым распространенным возбудителем, особенно при урологической и гастроэнтерологической патологии, считается Е. coli [2, 3, 4]. Большинство современных исследований, касающихся определения антибиотикочув-ствительности бактерий - возбудителей внутрибольничных инфекций, проводятся в сочетании с изучением их факторов вирулентности [5, 6, 7]. Такой подход представляется наиболее целесообразным с точки зрения установления «госпитальной» природы штамма [8]. Более того, прогнозирование течения инфекционного процесса с учетом возможного сочетания у возбудителя множественной устойчивости и широкого набора вирулентных свойств должно обеспечивать высокую эффективность проводимого лечения.
Цель работы: оценить распространенность сочетания анти-биотикорезистентности, гемолитической активности и способности к формированию биоплёнок среди клинических штаммов энтеробактерий, изолированных от пациентов многопрофильного ЛПУ.
Методы и материалы. Было изучено 42 штамма грамотрицательных бактерий, полученных из различных, преимущественно хирургического и акушерского, отделений, городской клинической больницы в период сентябрь-декабрь 2008 г. Спектр возбудителей включал: E. coli - 29, Enterobacter spp. - 5, Klebsiella spp. - 6, Proteus mirabilis - 2. Образование биопленок изучали на поверхности 96-луночной полистироловой планшеты согласно И.А. Шагиняну [9]. Гемолитическую активность оценивали на кровяном агаре по зоне гемолиза вокруг колоний исследуемых штаммов. Оценку чувствительности к антибиотикам проводили в соответствии c методическими указаниями (МУК, 2004). Препараты хромосомной ДНК получали фенольным методом, для выделения плазмидной ДНК использовали модифицированный щелочной метод Бирнбойма и Доли [10]. Амплификацию ДНК проводили с применением праймеров к генам бета-лактамаз типов TEM, CTX-M, SHV, DHA, FOX, CMY, ACT, синтезированных в ООО «Евроген» (г.Москва) [11]. Режим амплификации для праймеров TEM, CTX-M, CMY включал: начальный цикл денатурации - 1 мин. при 94°С; 35 циклов по схеме: денатурация 94°С - 20 с; отжиг 46°С - 60 с; синтез 72°С - 60 с; завершающий цикл 5 мин. при 72°С. Для праймеров SHV, DHA, FOX, ACT отжиг проводили при 55°С - 60 с [12]. Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1,2% агарозном геле в трисборатном буфере при напряженности электрического поля 6 В/см. Визуализацию полос и документирование данных осуществляли после окрашивания геля бромистым этиди-
ем с использованием системы гельдокументации В^осАпа^е (Вюте1га, Германия).
Результаты и обсуждение. Среди изолятов значительный процент составляли полирезистентные (к 3 и более антибиотикам) штаммы - 15 (35,7%). Удельный вес внутрибольничных штаммов, резистентных или условно-резистентных (промежуточных) к ампициллину, цефотаксиму и ингибитор-защищенному амоксициллину/клавуланату, составил 57,1%, 9,6% и 38,1% соответственно (таблица).
таблица.
Чувствительность бактерий к бета-лактамным антибиотикам
(абс. число/ %)
Антибиотик
Чувствительность штаммов Ампициллин м и с к £ о е в а л к S о к о м А м е н и с о а е
Чувствительные (S) 18/42,9 38/90,4 26/61,9 40/95,2
Промежуточные (I) 8/19,0 2/4,8 7/16,7 0
Резистентные (R) 16/38,1 2/4,8 9/21,4 2/4,8
К меропенему, устойчивость к которому среди представителей данного семейства встречается очень редко, были резистентны только две клинических культуры E. coli, а «промежуточные» варианты вообще не зарегистрированы. Девять изо-лятов (21,4%) были устойчивы и 11 (26,2%) характеризовались промежуточной устойчивостью к аминогликозидам (гентами-цину). Еще одним препаратом первого ряда в отношении кишечных бактерий является ципрофлоксацин (группа фтор-хинолонов), который подавлял рост 37 (88,1%) штаммов, выделенных от больных с гнойно-септическими инфекциями.
Механизмы резистентности бактерий семейства Enterobacteriaceae к современным цефалоспоринам чрезвычайно разнообразны, однако, наибольшее значение в настоящее время имеет устойчивость, связанная с продукцией хромосомных (класса С) или плазмидных b-лактамаз расширенного спектра класса А [13, 14]. В клинической практике при определении чувствительности кишечных бактерий необходимость детекции штаммов, вырабатывающих БЛРС, связана с тем, что часть продуцентов бета-лактамаз при применении существующих критериев, определяемых in vitro, попадают в категорию чувствительных, а цефалоспориновые антибиотики in vivo не дают клинического эффекта.
Проведенный ПЦР-анализ присутствия генов бета-лактамаз в изучаемых штаммах показал, что наиболее часто встречались ферменты типов ТЕМ - 11 (26,2 %) (рис.), все они были обнаружены у E. coli (37,9%); SHV - 10 (23,8%), включая 3 у Klebsiella spp. (50 %) и 7 у E. coli (24,1 %) и CTX-М - 3 (7,1 %). На матрице ДНК двух изолятов были обнаружены фрагменты, соответствующие по размерам генам, кодирующим хромосомные лактамазы FOX типа. Два полирезистентных штамма E. coli имели внехромосомный генетический материал, содержащий гены, кодирующие синтез бета-лактамаз 2 видов:
TEM+SHV. Ни в одном из изолятов (включая хромосомный материал) не обнаружены гены DHA, CMY, ACT видов. На матрице ДНК 18 изолятов не были амплифицированы фрагменты генов ни к одному из тестируемых классов лактамаз.
рис.
ПЦР-фрагменты генов, кодирующих бета-лактамазы ТЕМ типа (1080 п.н.).
За последние годы в России отмечено значительное увеличение частоты встречаемости БЛРС. При этом наблюдается увеличение частоты встречаемости СТХ-М-ферментов, которые, по сравнению с «классическими» БЛРС (ТЕМ и SHV типов), обладают большей гидролитической активностью в отношении многих бета-лактамов, включая цефалоспорины III и IV поколений [15]. Доля продуцентов БЛРС среди разных видов бактерий, характер доминирующих ферментов варьируют в разных регионах и меняются с течением времени. В нашем исследовании по результатам детекции основных генов бета-лактамаз классов А и С в 2008 году установлено, что по сравнению с 2006 г. доля изолятов, содержащих гены типа ТЕМ и SHV, увеличилась (с 18,4 до 26,2% и с 14,2 до 23,8% соответственно) и уменьшилась доля культур с GTX-геном (с 16,3 до 7,1%).
Показано, что 29 (69,0%) штаммов, изолированных от больных при инфекционных осложнениях, проявляли гемолитические свойства. Полный гемолиз вызывали 5 (11,9%) культур. Сочетание полирезистентности и гемолитической активности выявлено у 10 (23,8%) штаммов.
Закрепление и передача факторов патогенности наиболее эффективно происходит в микробных сообществах, в частности, биопленках, формирующихся как в макроорганизме, так и на различных субстратах - поверхностях медицинского оборудования и предметах ухода за больными [9]. Установлено, что 13 (30,9%) культур проявляли способность к пленкообра-зованию, причем это свойство было зарегистрировано у 31% E. coli против 66,6% Klebsiella spp. При этом все пленкообразующие штаммы проявляли гемолитическую активность, но только 2 из них отличались полирезистентностью.
Заключение. Известно, что основу лечения внекишечных инфекций, вызываемых представителями семейства Enterobacteriaceae, составляют бета-лактамные антибиотики.
Несмотря на это в фенотипах резистентности изолированных штаммов доля устойчивых к цефотаксиму не превышала 5%, в то время, как рост каждого второго изолята подавлялся гентамицином. Хотя в наших наблюдениях прослежена тенденция к росту присутствия БЛРС-генов, частота их встречаемости у госпитальных изолятов остается на значительно более низком уровне, чем в среднем по стране [16, 17], а распространенность генов СТХ-М-лактамаз снизилась практически вдвое по сравнению с 2006 г. [12]. Одновременное наличие трех изучаемых признаков (полирезистентность, гемолитическая активность и пленкообразование) выявлено лишь у 2 изолированных культур. Установленные фенотипические особенности изученных кишечных бактерий позволяют предполагать, что взаимозависимость генетической детерминации факторов патогенности и БЛРС в этой группе не проявляется.
Работа поддержана грантом РФФИ 09-04-99006-р_офи.
ш
ЛИТЕРАТУРА
1. Страчунский Л.С. Бета-лактамазы расширенного спектра - быстрорастущая и плохо осознаваемая угроза. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2005. Т. 7. № 1. С. 92-96.
2.Брискин Б.С. Внутрибольничная инфекция и послеоперационные осложнения с позиций хирурга. Инфекции и антимикробная терапия, 2000. Т. 2. № 4. С. 1-6.
3. Ермолов А.С. Микробная этиология гнойно-септических осложнений в различных хирургических подразделениях стационара /А.С. Ермолов, Д.Д. Меньшиков, Н.А. Карасев, Б.Н. Курилин. Стерилизация и госпитальные инфекции, 2007. Т. 2. № 4. С.39-43.
4. Зубков М.Н. Современные аспекты антибиотикопрофилактики и антимикробной терапии панкреатогенных инфекций. Фарматека, 2006. Т. 4. № 119. С. 12-17.
5. Колоджиева В.В. Эпидемиологические особенности гнойно-септических инфекций, вызванных энтерококками и стрептококками группы В у пациентов гинекологического стационара и женской консультации: автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб., 2006. 22 с.
6. Петрова Л.Ю. Резистентность к антибактериальным препаратам патогенных энтеробактерий в Санкт-Петербурге за период 2002-2005 гг. / Л.Ю. Петрова, В.Н. Алексеенко, Л.А. Кафтырева и др. Материалы росс. науч.-практ. конф. «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины». СПб., 2006. С. 244.
7. Чернуха М.Ю. Антибиотикорезистентность и формирование биопленок у клинических штаммов бактерий комплекса В. cepacia /М.Ю. Чернуха, Г.А. Данилина, Г.В. Алексеева и др. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2006. Т. 8. № 2. С. 41-42.
8. Зуева Л.П. Эпидемиология /Л.П. Зуева, Р.Х. Яфаев. Учебник. СПб: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2005. 752 с.
9. Шагинян И.А. Формирование биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик /И.А. Шагинян, Г.А. Данилина, М.Ю.Чернуха и др. Микробиология, 2007. № 1. С. 3-9.
10. Клонирование ДНК. Методы /пер. с англ.; под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1988. 538 с.
11. Сидоренко С.В. Этиология тяжелых госпитальных инфекций в отделениях реанимации и антибиотикорезистентность среди их возбудителей / С.В. Сидоренко, С.П. Резван, С.В. Еремина и др. Антибиотики и химиотерапия, 2005. Т. 50. № 2-3. С. 33-41.
12. Кузнецова М.В. Динамика распространенности генов бета-лактамаз у грамотрицательных бактерий, выделенных в клиниках г. Перми / М.В. Кузнецова, Т.И. Карпунина, А.Ю. Максимов, В.А. Демаков. Матер. науч.-практ. конф. «Современные проблемы эпидемиологии». Н. Новгород, 2007. С. 118-125.
13. Сидоренко С.В. Бета-лактамазы расширенного спектра: клиническое
значение и методы детекции. Инфекции и антимикробная терапия, 2002. Т. 4. № 6. С. 164-169.
14. Эйдельштейн М.В. Бета-лактамазы аэробных грамотрицатель-
ных бактерий: характеристика, основные принципы классификации, современные методы выявления и типирования. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2001. Т. 3. № 3.
С. 223-242.
15. Галкин Д.В. Современные возможности терапии тяжелых инфекций: цефоперазон/сульбактам и его роль в преодолении резистентности возбудителей нозокомиальных инфекций /Д.В. Галкин, Р.С. Козлов. Фарматека, 2006.
Т. 4. № 119. С. 18-27.
16. Эйдельштейн М.В. Динамика распространенности и чувствительности БЛРС-продуцирующих штаммов энтеробактерий к различным антимикробным препаратам в ОРИТ России /М.В. Эйдельштейн, Л.С. Страчунский, исследовательская группа РОСНЕТ. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2008. Т. 7. № 4. С. 323-336.
17. Решедько Г.К. Резистентность к антибиотикам грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций в ОРИТ многопрофильных стационаров России /Г.К. Решедько, Е.Л. Рябкова, О.И. Кречикова и др. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2008. Т. 10. № 2. С. 163-179.
