CC BY
7
УДК 619:636.4:636.087.8
ИЗУЧЕНИЕ СУБХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧНОСТИ СУХОЙ БИОМАССЫ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА YARROWIA LIPOLYTICA ПРОДУЦЕНТА МИКРОИНКАПСУЛИРОВАННОЙ В-1,4-МАННАНАЗЫ ИЗ BACILLUS CIRCULANS
ПЕТРОВА С.Н.,
доктор сельскохозяйственных наук, доцент, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. +7 (4712) 53-13-35. ТРУБНИКОВ Д.В.,
кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии и химии имени профессора А.А. Сысоева, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. +7 (4712) 54-14-04.
ТРУБНИКОВА Е.В.,
доктор биологических наук, заведующий научно-исследовательской лабораторией «Генетика» ФГБОУ ВО Курский государственный университет, тел. +7 (4712) 70-32-34.
БЕЛОУС А.С.,
кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник научно-исследовательской лабораторией «Генетика», ФГБОУ ВО Курский государственный университет, тел. +7 (4712) 70-32-34.
ВОРОБЬЕВ А.С.,
студент магистратуры, ФГБОУ ВО Курский государственный университет, тел. +7 (4712) 70-32-34.
ДАНИЛОВА М.А.,
аспирант, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. +7 (4712) 54-14-04.
Реферат. Целью работы было исследование токсикологической безопасности белковой кормовой добавки, содержащей 1,4^-маннаназу из Bacillus circulans, инкапсулированной в клетках ре-комбинантного штамма Yarrowia lipolytica. Микроинкапусляция обеспечивает повышенную термостабильность целевого фермента при кратковременном прогреве, что позволяет использовать её в кормовых премиксах, получаемых гранулированием на распылительной сушке. Субхроническая токсичность добавки исследовалась на крысах линии Wistar в возрасте 4-4,5 месяцев и средней массой 240 г (от 220 до 260 г). В эксперименте использовалось пять групп по 12 животных в каждой: контрольная группа, получавшая стандартный рацион; две группы сравнения, получавшие добавленный к стандартному рациону коммерческий препарат ß-маннаназы Nutrizyme BetaMannanase (Sunson Industry Group Co., Ltd), разрешенный к применению в России в дозе в 2 и 10 раз превышающей рекомендованную производителем, а также две экспериментальные группы, и получавшие испытуемый препарат в составе стандартного рациона в пропорции 1 и 5% от массы поедаемого корма.
На 15-й и 29-й день опыта проводили эвтаназию экспериментальных животных с помощью обескровливания для дальнейшего патоморфологического исследования внутренних органов и тканей. В результате эксперимента показано отсутствие патологических изменений в организме экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о токсикологической безопасности новой микроинкапсулированной кормовой добавки в дозах превышающих предложенную для применения в животноводстве в 2 и 10 раз. Полученные результаты показывают возможность государственной регистрации испытуемого препарата в качестве ветеринарного препарата и его использования в животноводстве с целью увеличения суточных привесов свиней и птицы, сокращения выбросов фосфатов и эвтрофикации сточных вод.
Ключевые слова: бета-маннаназа, микрокапсуляция, субхроническая токсичность, Yarrowia lipolytica, Bacillus circulans.
STUDY OF SUBCHRONIC TOXICITY OF DRY BIOMASS OF RECOMBINANT STRAIN YARROWIA LIPOLYTICA PRODUCER OF MICROENCAPSULATED- 1,4-MANNASE FROM BACILLUS CIRCULANS
PETROVA S. N.,
Doctor of Agricultural Sciences, Associate Professor, Kursk State Agricultural Academy, tel. +7 (4712) 53-13-35.
TRUBNIKOV D.V.,
candidate of Biological Sciences, associate Professor of the Department of physiology and chemistry named after A.A. Sysoyev FSBEI of HE Kursk State Agricultural Academy, tel. +7 (4712) 54-14-04.
TRUBNIKOVA E.V.,
doctor of Biological Sciences, Head of the Science and Research Laboratory "Genetika" FSBEI of HE Kursk State University, tel. +7 (4712) 70-32-34.
BELOUS AS.,
candidate of Medical Sciences, Senior Researcher at the Research "Genetika" FSBEI of HE Kursk State University, tel. +7 (4712) 70-32-34.
VOROB'EV AS.,
master's student, FSBEI of HE Kursk State University, tel. +7 (4712) 70-32-34. DANILOVA M.A.,
post-graduate student, FSBEI of HE Kursk State Agricultural Academy, tel. +7 (4712) 54-14-04.
Essay. The aim of this work was to study the toxicological safety of a protein feed additive containing 1,4-P-mannanase from Bacillus circulans, encapsulated in the cells of the recombinant Yarrowia lipolytica strain. Microencapsulation provides increased thermal stability of the target enzyme during short-term heating, which makes it possible to use it in feed premixes obtained by granulation on spray drying. Subchronic toxicity of the additive was studied on Wistar rats aged 4-4.5 months and with an average weight of 240 g (from 220 to 260 g). The experiment used five groups of 12 animals each: the control group, which received a standard diet; two comparison groups that received added to the standard diet a commercial preparation of P-mannanase Nutrizyme Beta-Mannanase (Sunson Industry Group Co., Ltd), approved for use in Russia at a dose 2 and 10 times higher than the recommended by the manufacturer, as well as two experimental groups, and who received the test drug as part of a standard diet in a proportion of 1 and 5% of the mass of the eaten feed.
On the 15th and 29th day of the experiment, the experimental animals were euthanized by exsanguina-tion for further pathomorphological examination of internal organs and tissues. As a result of the experiment, the absence of pathological changes in the body of experimental animals was shown, which allows us to draw a conclusion about the toxicological safety of a new microencapsulated feed additive in doses exceeding those proposed for use in animal husbandry by 2 and 10 times. The results obtained show the possibility of state registration of the tested drug as a veterinary drug and its use in animal husbandry in order to increase the daily weight gain of pigs and poultry, reduce phosphate emissions and eutrophication of wastewater.
Keywords: beta-mannanase, microencapsulation, sub-chronic toxicity, Yarrowia lipolytica, Bacillus circulans.
Введение. В настоящее время у специалистов в области нутрицевтики вызывают особый интерес «минорные» сахара, которые, несмотря на невысокое содержание в составе потребляемых с пищей полисахаридов, способны существенно влиять на физиологические функции организма.
Одним из таких сахарных остатков является манноза. Этот сахар входит в состав полисаха-ридных цепей иммуноглобулинов и других белков крови. В качестве компонента корма для животных манноза обладает пребиотическим действием [1]. Недостаток маннозы в организме
приводит к нарушению гликозилирования иммуноглобулинов и других гликопротеидов крови [2]. Восполнение нехватки маннозы в рационе питания приводит к улучшению иммунного статуса и восстановлению биохимических процессов, как у животных, так и у человека.
В пищевых продуктах манноза находится в виде гомогенных или гетерогенных полисахаридов. Ферментативный гидролиз маннанов (полисахаридов гемицеллюлозной фракции клеточных стенок растений) является наиболее эффективным способом обеспечения потребности организма в маннозе. Ферменты, которые разрушают внутренние ß-1,4-гликозидные связи в основной цепи молекул ß-маннанов, называются ß-маннаназами [3,4].
Однако поступление кормовых ферментов, вводимых в составе корма, в кишечник продуктивных животных осложнена низкой стабильность белков в агрессивной среде желудка, содержащей протеазу пепсин, и отличающуюся низким рН (ниже 1). Для повышения стабильности кормовых ферментов при транзите через желудок используются методы химического микрокапсулирования [5,6]. Авторами настоящей работы предложен оригинальный метод, заключающийся в инкапсуляции кормовой ß-маннаназы из B. circulans в клетках рекомбинантного дрожжевого продуцента непосредственно в момент синтеза, что достигается путём отказа от использования секреторного лидерного пептида при конструировании гена, вводимого в дрожжевые клетки.
В связи с высокой перспективностью нового микроинкапсулированного препарата кормовой ß-1,4-маннаназы, полученного с использованием рекомбинантного штамма Y. lipolytica, существует необходимость получения данных о его безопасности для физиологического состояния животных. Решение это проблемы и являлось целью настоящего исследования.
Материалы и методы исследования. Эксперименты для изучения субхронической токсичности лабораторного образца сухой биомассы рекомбинантного штамма Y. lipolytica - продуцента микроинкапсулированной ß-1,4-маннаназы B. circulans, проводили в лаборатории кафедры физиологии и химии и в условиях вивария факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВО Курская ГСХА.
Исследования безопасности опытного образца проводили в сравнении с препаратом Nutrizyme Beta-Mannanase (Sunson Industry Group Co., Китай). Препарат разрешен к применению в
России и признанного ранее безопасным. Данный препарат представляет собой ß-маннаназу Bacillus lentus для кормления продуктивных животных с активностью 3000-25000Ед/г. Средняя активность 10000Ед/г, для данной активности средняя рекомендованная доза применения препарата 5 г на тонну корма. Учитывая, что суточная потребность крысы весом 230—250 грамм составляет 30 грамм корма в сутки, следовательно, средняя доза препарата для крыс составляет 0,6 мг/кг веса животного.
Опыты проводили на крысах линии Wistar в возрасте 4-4,5 месяцев и средней массой 240 г (от 220 до 260 г). Всем экспериментальным животным порционно выдавался гранулированный корм, а в поилки фильтрованную водопроводную воду.
Крыс рандомизировали по их массе и стратификацией по планируемым манипуляциям. Экспериментальных животных разделили на 5 групп (по 12 крыс в каждой группе):
I - контрольная (ежедневное внутрижелудоч-ное введение 1% крахмального клейстера);
II - препарат «сухая биомасса рекомбинантного штамма Y. lipolytica - продуцента микроинкапсулированной ß-1,4-маннаназы B. circulans», двукратная терапевтическая доза 300 мг/кг;
III - препарат «сухая биомасса рекомбинантного штамма Y. lipolytica - продуцента микроинкапсулированной ß-1,4-маннаназы B. circulans», пятикратная терапевтическая доза 1500 мг/кг;
IV - препарат ß-маннаназы для кормления животных Nutrizyme Beta-Mannanase - производитель Sunson Industry Group Co., Китай, двукратная терапевтическая доза 1,2 мг/кг;
V - препарат ß-маннаназы для кормления животных Nutrizyme Beta-Mannanase - производитель Sunson Industry Group Co., Китай, десятикратная терапевтическая доза 6 мг/кг.
Препараты вводили внутрижелудочно, один раз в сутки, для введения использовался специально изготовленный атравматичный зонд. Растворы для внутрижелудочного введения готовили во флаконе, путем перемешивания предварительно измельченных исследуемых препаратов и 1% крахмального клейстера.
На 15-й и 29-й день опыта, под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) проводили эвтаназию экспериментальных животных с помощью обескровливания для дальнейшего патоморфологи-ческого исследования внутренних органов и тканей. Проводили некропсию тушек экспериментальных животных. При их вскрытии обращали внимание на общий окраску внутренних органов, а также наличие и отсутствие жидкостей в раз-
личных полостях. При выявлении заболеваний у экспериментальных животных они отбраковывались без проведения последующего морфологического исследования. Морфологическому исследованию были подвергнуты следующие органы: желудок, тонкий кишечник, печень, почки, сердце и головной мозг. Данные органы взвешивали, проводили макроскопическое и гистологическое исследование.
Статистический анализ экспериментальных данных проводили в программе Microsoft Excel 10.0. Производили расчет средних значений показателей (M) и ошибки среднего (m). С целью сравнения показателей в исследуемых группах использовали двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями, достоверными считались различия при p<0,05.
При работе с животными условия их содержания и проводимые работы с ними соответствовали международным стандартам.
Результаты исследования. При макроскопическом исследовании грудной и брюшной по-
лостей у крыс всех экспериментальных групп патологических изменений не было обнаружено. При вскрытии органы имели обычное макроскопическое строение, расположены правильно бледно-синюшного цвета, в полости брюшины, а также плевральных полостях свободная жидкость отсутствовала.
При первом и втором забое гравиметрические показатели: средняя масса тушки крысы, печени, почек и сердца, в подопытных группах были на уровне значений в контрольной группе животных. Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод о том, что исследуемые препараты не угнетают синтетические процессы в организме и не вызывают стрес-сорного состояния, в связи с тем, что масса органов всегда остается в пределах нормы. Увеличение дозы исследуемого препарата до 10-кратной терапевтической дозы, а также препарата сравнения не вызывало достоверного изменение веса исследуемых органов (таблицы 1-3).
Таблица 1 - Масса печени у экспериментальных животных
Сроки исследования Отклонение показателей Группа контроля Экспериментальный образец - сухая биомасса рекомбинантного штамма Y. lipolytica - продуцента микроинкапсулированной ß-1,4-маннаназы B. circulans Препарат сравнения -фермент ß-маннаназа для кормления для животных Nutrizyme Beta-Mannanase (Sunson Industry Group Co., Китай)
300 мг/кг 1500 мг/кг 1,2 мг/кг 6 мг/кг
Абсолютная масса печени (г)
14 день экс- (M ± m) 9,65±0,845 9,74±0,481 9,56±0,357 9,39±0,544 9,33±0,529
перимента Относительная масса печени (мг/г)
(M ± m) 38,7±2,9 40,4±1,8 38,5±2,2 38,7±1,4 38,2±1,8
Абсолютная масса печени (г)
28 день экс- (M ± m) 11,37±0,485 11,35±0,701 11,19±0,511 11,23±0,949 11,07±0,745
перимента Относительная масса печени (мг/г)
(M ± m) 39,1± 1,4 38,9± 1,8 38,5±1,6 38,3±2,9 37,9±1,9
Единицы измерения: граммы, мг/г.
Таблица 2 - Масса почек у экспериментальных животных
Сроки исследования Отклонение показателей Группа контроля Экспериментальный образец - сухая биомасса рекомбинантного штамма Y. lipolytica - продуцента микроинкапсулированной ß-1,4-маннаназы B. circulans Препарат сравнения -фермент ß-маннаназа для кормления для животных Nutrizyme Beta-Mannanase (Sunson Industry Group Co., Китай)
300 мг/кг 1500 мг/кг 1,2 мг/кг 6 мг/кг
Абсолютная масса почек (г)
14 день экс- (M ± m) 0,874±0,056 0,841±0,075 0,855±0,033 0,858±0,043 0,871±0,059
перимента Относительная масса почек (мг/г)
(M ± m) 3,51±0,1 3,54±0,23 3,51±0,08 3,58±0,16 3,54±0,19
Абсолютная масса почек (г)
28 день экс- (M ± m) 1,027±0,052 1,012±0,059 1,012±0,059 1,008±0,044 1,016±0,058
перимента Относительная масса почек (мг/г)
(M ± m) 3,51±0,1 3,44±0,08 3,45±0,11 3,43±0,08 3,48±0,07
Единицы измерения: граммы, мг/г.
Таблица 3 - Масса се
эдца у экспериментальных животных
Сроки исследования Отклонение показателей Группа контроля Экспериментальный образец - сухая биомасса рекомбинантного штамма Y. Hpofytica - продуцента микроинкапсулированной ß-1,4-маннаназы B. circulans Препарат сравнения -фермент ß-маннаназа для кормления для животных Nutrizyme Beta-Mannanase (Sunson Industry Group Co., Китай)
300 мг/кг 1500 мг/кг 1,2 мг/кг 6 мг/кг
14 день эксперимента Абсолютная масса сердца (г)
(M ± m) 0,902±0,054 0,899±0,05 0,915±0,03 0,915±0,043 0,931±0,038
Относительная масса сердца (мг/г)
(M ± m) 3,65±0,12 3,67±0,13 3,76±0,11 3,76±0,24 3,87±0,12
28 день эксперимента Абсолютная масса сердца (г)
(M ± m) 1,007±0,044 1,023±0,078 1,009±0,062 1,033±0,068 1,022±0,05
Относительная масса сердца (мг/г)
(M ± m) 3,6±0,08 3,42±0,12 3,44±0,11 3,48±0,12 3,58±0,08
Единицы измерения: граммы, мг/г.
А Б В
Рисунок 1 - Морфологическое исследование желудка крыс в группе интактных животных (А), группе введения исследуемого препарата (Б) и группе введения препарата сравнения при окраске гематоксилином и эозином, увеличение х140
Рисунок 2 - Морфологическое исследование кишечника крыс в группе интактных животных (А), группе введения исследуемого препарата (Б) и группе введения препарата сравнения при окраске гематоксилином и эозином, увеличение х140
При гистологическом исследовании же- изменения в слизистой и стенке желудка от-
лудка во всех экспериментальных группах сутствовали. Дно желудка имело послойное
животных дистрофические и воспалительные строение. Слизистая оболочка с упорядочен-
ными железами, содержащими все типы клеток. Толщина слизистой оболочки варьировала от 380 до 600 мкм, составляя в среднем при первом забое 450±20 мкм, при втором 452±22 мкм (рисунок 1).
При микроскопии стенки тонкого кишечника патологических изменений в структуре слизистой оболочки, подслизистого и мышечного слоев также не показало. Слизистая тонкого кишечника имела обычный рисунок. В просвете тонкого кишечника имелось не большое количество слущенных эпителиальных клеток (рисунок 2).
Печень имела балочное строение. Дистрофические и воспалительные изменения отсутствовали. Визуализировалось большое количество печеночных триад без патологических изменений, печеночные дольки были правильной формы, в них отмечалось умеренное
венозное полнокровие, гепатоциты формировали радиальные балки, а их ядра хорошо контурировались и выглядели однотипно, цитоплазма была просветленной или с небольшим количеством мелкогранулярных эозино-фильных включений (рисунок 3).
Почки окружены фиброзной капсулой. В паренхиме почки четко различались корковое и мозговое вещество. Дегенеративные и воспалительные изменения в клубочках и канальцах не были обнаружены. Клубочки были умеренно полнокровны, их средний диаметр составлял 80 мкм. В корковом веществе наблюдалось большое количество почечных (мальпигиевых) телец, округлой формы. Эпителий извитых канальцев был с хорошо различимыми ядрами, цитоплазмой и мелкой эо-зинофильной зернистостью (рисунок 4).
А
Б
В
Рисунок 3 - Морфологическое исследование печени крыс в группе интактных животных (А), группе введения исследуемого препарата (Б) и группе введения препарата сравнения при окраске гематоксилином и эозином, увеличение х140
А Б В
Рисунок 4 - Морфологическое исследование почек крыс в группе интактных животных (А), группе введения исследуемого препарата (Б) и группе введения препарата сравнения при окраске гематоксилином и эозином, увеличение х140
А
г . » •• ? «
' • ; > ... 4
• ' V > * ;' • .
* • <-г 4 V* I V *
! 4. « • » • » л '
V ' \ > . « : • ; •
» » I
»
J'
Б В
Рисунок 5 - Морфологическое исследование сердца крыс в группе интактных животных (А), группе введения исследуемого препарата (Б) и группе введения препарата сравнения при окраске гематоксилином и эозином, увеличение х 140
Рисунок 6 - Морфологическое исследование головного мозга крыс в группе интактных животных (А), группе введения исследуемого препарата (Б) и группе введения препарата сравнения при окраске гематоксилином и эозином, увеличение х 140
Гистологическое исследование сердца морфологических изменений не показало. Эндотелий был выстлан однослойным плоским эпителием. Миокард без реактивных изменений, визуализировались полнокровные вены, а также участки кардиомиоцитов, находящиеся в состоянии разной сократительной активности, толщиной от 4,4 до 6,1 мкм, дистрофические изменения в них не было выявлено. Эпикард был образован рыхлой волокнистой соединительной тканью, имея в своем составе клетки белой жировой ткани, и покрыт мезо-телием (рисунок 5).
При микроскопии отёк вещества мозга не был обнаружен. Сосудистые сплетения желудочков были хорошо развиты. Кора головного мозга с четкой структурной архитектоникой. Мягкая мозговая оболочка с тонкостенными сосудами в состоянии умеренного полнокровия. Корковое вещество с четкой стратифика-
цией, нейроны и глиальные клетки и без признаков их гибели (рисунок 6).
Обсуждение. Учитывая цели доклинической оценки безопасности, к которым, как правило, относят определение характеристик токсического действия исследуемых веществ в отношении органов-мишеней в зависимости от их дозы, экспозиции и потенциальной обратимости изменений. Эти данные используют для определения предельной безопасной дозы, рекомендуемой для практического применения в кормах, а также для определения показателей с целью мониторинга наличия или отсутствия потенциальных побочных эффектов. В связи с тем, что разработанный новый препарат сухой биомассы рекомбинантного штамма Y. lipolytica - продуцента микроинкапсулированной ß-1,4-маннаназы B. circulans предназначен для использования в кормах для продуктивных животных, для морфологического исследования
были выбраны органы желудочно кишечного тракта (желудок, тонкий и толстый кишечник), а также сердце, головной мозг, печень и почки с целью выявления возможного кардиотоксиче-ского, нейротоксического, гепато- и нефроток-сического действия исследуемой субстанции.
Проведенное гравиметрическое, морфомет-рическое и гистологическое исследование не выявило каких-либо закономерных патоморфо-логических изменений сердца, головного мозга, печени, почек, желудка, тонкого и толстого кишечника подопытных крыс, обусловленных введением малых и больших доз исследуемых добавок. Таким образом, препарат сухой биомассы рекомбинантного штамма Y. lipolytica -продуцента микроинкапсулированной ß-1,4-маннаназы B. circulans, и препарат сравнения -фермент ß-маннаназа для кормления животных Nutrizyme Beta-Mannanase (Sunson Industry Group Co., Китай) не обладают местнораздра-жающим и общетоксическим действием на организм крыс.
Выводы. В исследовании показана безопасность новой кормовой добавки, представляющей собой препарат сухой биомассы рекомби-нантного штамма У. 11ро1уИеа - продуцента микроинкапсулированной Р-1,4-маннаназы В. еггеЫат в исследовании на крысах, в дозах превышающих предложенную для применения в животноводстве в 2 и 10 раз. Это открывает возможности для применения данного препарата в промышленном птицеводстве и свиноводстве с целью улучшения кормовой эффективности кормов, увеличения привесов и улучшения общего физиологического состояния и иммунного статуса продуктивных животных.
Благодарность выражена Худину А.Н. (Курский государственный университет) и Харченко Е.В. (Курская государственная сельскохозяйственная академия имени И.И. Иванова) за предоставленную возможность выполнения экспериментальной части исследования на базе научно-исследовательских лабораторий.
Список использованных источников
1. Prebiotic properties of mannose and its effect on specific resistance / O.S. Korneeva, I.V. Cheremushkina, A.S. Glushchenko, N.A. Mikhaílova et al. // Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. -2012. - No. 5. - Р. 67-70.
2. Congenital disorder of glycosylation type 1b. Experience with mannose treatment / E. Martín Hernández, A.I. Vega Pajares, B. Pérez González, M.J. Ecay Crespo et al. // An Pediatr (Bare). - 2008. - Vol. 69. - No. 4. - P. 358-365.
3. Геммицеллюлозы зерна злаков и ферменты, катализирующие их расщепление / Н.А. Родионова, Л.В. Капрельянц, П.В. Середницкий, А.Ю. Килимник // Прикладная биохимия и микробиология. - 1992. - Т. 28. - вып. 5. - С. 645-664.
4. Moreira, L.R.S., Filho E.X.F. An overview of mannan structure and mannandegrading enzyme systems // Appl Microbiol Biotechnol. - 2008. - Vol. 79. - Р. 165-178.
5. Microencapsulation of Rosemary Essential Oil by Co-Extrusion / Gelling Using Alginate as a Wall Material / C. Dol9á, M. Ferrándiz, L. Capablanca, et al. // Journal of Encapsulation and Adsorption Sciences. - 2015. - Vol. 5. - No. 3. - P. 121-130.
6. Микрокапсулы: перспективы использования в современной фармацевтической практике / Э.Ф. Степанова, М.Е. Ким, К.Б. Мурзагулова, С.Б. Евсеева // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 5. - С. 767.
Spisok ispoFzovanny'x istochnikov
1. Prebiotic properties of mannose and its effect on specific resistance / O.S. Korneeva, I.V. Cheremushkina, A.S. Glushchenko, N.A. Mikhaílova et al. // Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. -2012. - No. 5. - R. 67-70.
2. Congenital disorder of glycosylation type 1b. Experience with mannose treatment / E. Martín Hernández, A.I. Vega Pajares, B. Pérez González, M.J. Ecay Crespo et al. // An Pediatr (Barc). - 2008. - Vol. 69. - No. 4. - P. 358-365.
3. Gemmicellyulozy' zerna zlakov i fermenty, kataliziruyushhie ix rasshheplenie / N.A. Ro-dionova, L.V. Kaprelyancz, P.V. Seredniczkij, A.Yu. Kilimnik // Prikladnaya bioximiya i mikrobiologiya. - 1992. - T. 28. - vyp. 5. - S. 645-664.
4. Moreira, L.R.S., Filho E.X.F. An overview of mannan structure and mannandegrading enzyme systems // Appl Microbiol Biotechnol. - 2008. - Vol. 79. - R. 165-178.
5. Microencapsulation of Rosemary Essential Oil by Co-Extrusion / Gelling Using Alginate as a Wall Material / C. Dol^a, M. Ferrandiz, L. Capablanca, et al. // Journal of Encapsulation and Adsorp-tion Sciences. - 2015. - Vol. 5. - No. 3. - P. 121-130.
6. Mikrokapsuly': perspektivy' ispol'zovaniya v sovremennoj farmacevticheskoj praktike / E.F. Stepanova, M.E. Kim, K.B. Murzagulova, S.B. Evseeva // Sovremenny'e problemy' nauki i obrazovaniya. - 2014. - № 5. - S. 767.
