CC BY
6
УДК 619:636.4:636.087.8
ИЗУЧЕНИЕ ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ СУХОЙ БИОМАССЫ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА YARROWIA LIPOLYTICA ПРОДУЦЕНТА МИКРОИНКАПСУЛИРОВАННОЙ ß-M-МАННАНАЗЫ ИЗ BACILLUS CIRCULANS
ПЕТРОВА С.Н.,
доктор сельскохозяйственных наук, доцент, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. +7 (4712) 53-13-35. ТРУБНИКОВ Д.В.,
кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии и химии
имени профессора А.А. Сысоева, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. +7 (4712) 54-14-04.
ТРУБНИКОВА Е.В.,
доктор биологических наук, заведующая научно-исследовательской лабораторией «Генетика», ФГБОУ ВО Курский государственный университет, тел. +7 (4712) 70-32-34.
БЕЛОУС А.С.,
кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник научно-исследовательской лабораторией «Генетика», ФГБОУ ВО Курский государственный университет, тел. +7 (4712) 70-32-34.
ВОРОБЬЕВ А.С.,
студент магистратуры, ФГБОУ ВО Курский государственный университет, тел. +7 (4712) 70-32-34.
ДАНИЛОВА М.А.,
аспирант, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. +7 (4712) 54-14-04. ГОРОБЕЦ А.Ю.,
преподаватель кафедры физиологии и химии имени профессора А.А. Сысоева, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. 54-14-04.
Реферат. Целью работы было исследование острой токсичности белковой кормовой добавки, содержащей 1,4^-маннаназу из Bacillus circulans, инкапсулированной в клетках рекомби-нантного штамма Yarrowia lipolytica. Для исследования острой токсичности растворы исследуемой кормовой добавки вводились белым мышах обоего пола, массой тела 22±2 г в максимально допустимом для данного вида животных и массы их тела объеме. Препарат сравнения ß-маннаназы Nutrizyme Beta-Mannanase (Sunson Industry Group Co., Ltd), разрешенный к применению в России вводился аналогичным образом в том же количестве. Данные, полученные на интактных животных (введение внутрь желудка эквивалентной дозы 1% крахмального клейстера), были использованы в качестве контроля. По выживаемости и общему состоянию животных судили о токсическом действии исследуемого вещества. Фиксировалось отсутствие гибели животных в течение 3 суток, после чего наблюдение за экспериментальными животными продолжали в течение двух недель. LD50 у исследуемых препаратов установить не удалось в виду отсутствия гибели животных. Полученные экспериментальные данные, внутрижелудочного введения мышам обоего пола исследуемого препарата и препарата сравнения позволяют отнести их к IV классу (малотоксичным веществам). Состояние переживших острую интоксикацию животных свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препаратов в дозах, превышающих в сотни раз дозы, рекомендованные для кормопроизводства. Полученные результаты показывают возможность государственной регистрации испытуемого препарата в качестве ветеринарного препарата и его использования в животноводстве с целью увеличения суточных привесов свиней и птицы, сокращения выбросов фосфатов и эвтрофикации сточных вод.
Ключевые слова: бета-маннаназа, микрокапсуляция, острая токсичность, Yarrowia lipolytica, Bacillus circulans.
STUDY OF ACUTE TOXICITY OF DRY BIOMASS OF RECOMBINANT STRAIN YARROWIA LIPOLYTICA PRODUCER OF MICROINCAPSULATED p-1,4-MANNASE FROM BACILLUS CIRCULANS
PETROVA S. N.,
Doctor of Agricultural Sciences, Associate Professor, Kursk State Agricultural Academy, tel. +7 (4712) 53-13-35.
TRUBNIKOV D.V.,
candidate of Biological Sciences, associate Professor of the Department of physiology and chemistry named after A.A. Sysoyev FSBEI of HE Kursk State Agricultural Academy, tel. +7 (4712) 54-14-04.
TRUBNIKOVA E.V.,
doctor of Biological Sciences, Head of the Science and Research Laboratory "Genetika" FSBEI of HE Kursk State University, tel. +7 (4712) 70-32-34.
BELOUS A.S.,
candidate of Medical Sciences, Senior Researcher at the Research "Genetika" FSBEI of HE Kursk State University, tel. +7 (4712) 70-32-34.
VOROB'EV AS.,
master's student, FSBEI of HE Kursk State University, tel. +7 (4712) 70-32-34. DANILOVA M.A.,
post-graduate student, FSBEI of HE Kursk State Agricultural Academy, tel. +7 (4712) 54-14-04. GOROBETS A.Y.,
lecturer of the Department of physiology and chemistry named after A.A. Sysoyev FSBEI HE Kursk State Agricultural Academy, tel. 54-14-04.
Essay. The aim of the work was to study the acute toxicity of a protein feed additive containing 1,4-P-mannanase from Bacillus circulans, encapsulated in the cells of the recombinant Yarrowia lipolytica strain. To study acute toxicity, solutions of the studied feed additive were administered to white mice of both sexes, weighing 22 ± 2 g in the maximum volume allowed for a given animal species and their body weight. The P-mannanase comparison drug Nutrizyme Beta-Mannanase (Sunson Industry Group Co., Ltd), approved for use in Russia, was administered in the same way in the same amount. As a control, we used data obtained on intact animals (administration into gastric of an equivalent dose of 1% starch paste). The toxic effect of the test substance was judged by the general condition of the animals and their survival. The absence of death of the animals was recorded for 3 days, after which the observation of the experimental animals was continued for two weeks. It was not possible to establish LD50 in the studied preparations due to the absence of death of animals. The obtained experimental data, intragastric administration of the test drug and the reference drug to mice of both sexes, allow us to classify them as class IV (low-toxic substances). The state of animals that survived acute intoxication indicates good tolerance and harmlessness of drugs in doses exceeding hundreds of times the doses recommended for feed production. The results obtained show the possibility of state registration of the tested drug as a veterinary drug and its use in animal husbandry in order to increase the daily weight gain of pigs and poultry, reduce phosphate emissions and eutrophication of wastewater.
Keywords: beta-mannanase, microencapsulation, acute toxicity, Yarrowia lipolytica, Bacillus circulans.
Введение. Манноза - моносахарид, обладающий физиологической активностью, присутствие которого способствует снижению
уровня глюкозы и холестерина в плазме крови. В чистом виде манноза не встречается в пищевых продуктах, а присутствует в виде
полисахаридов, не расщепляющихся кислотами и ферментами желудочно-кишечного тракта животных [1-4]. При снижении уровня маннозы в крови в результате нарушения углеводного питания или работы желудочно-кишечного тракта синтезируются гликопро-теиды и гликолипиды с меньшим количеством молекул моносахарида, что приводит к снижению пороговой чувствительности иммунной системы. Манноза это эпимер глюкозы, является мономером маннана, обладает иммуностимулирующими, радиопротекторными свойствами и гиполипидемическим действием, способствует росту животных [5].
Ферментативный гидролиз маннанов осу-щесвляют Р-маннаназы, относящиеся к классу О-гликозид-гидролаз [6-8]. Р-маннаназы являются эндогидролазами, которые случайным образом расщепляют основную цепь молекул маннанов [9]. Довольно обширным является спектр микроорганизмов, Р-маннаназы из которых были выведены [10-15].
Маннаназа в настоящее время рассматривается в качестве одного из наиболее перспективных, хотя и малодоступных и недостаточно исследованных пока кормовых ферментов. Субстратом маннаназ являются 1,4-0-маннаны, находящиеся в зерне в количествах до 2% от общей сухой массы полисахаридов. Адсорбенты на основе маннозы прочно связывают микотоксины. Таким образом, внесение углеводов, в частности маннозы, в рацион кормления поросят и других сельскохозяйственных животных улучшает продуктивность, способствует росту и развитию сильной иммунной системы, сводя к минимуму риск заболеваний. Помимо этого, применение манна-назы может позволить гораздо рациональнее и наиболее полно применить природные сырьевые ресурсы, что особенно подчёркивает актуальность по всему миру в настоящее время [16-20].
В связи с этим на базе ФГБОУ ВО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени И.И. Иванова» была разработана экономически эффективная технология производства белковой кормовой добавки Р-1,4-маннаназы, полученной с использованием рекомбинантного штамма У. Ыро1уИеа, по своей термостабильности адаптированную для использования в кормовых премиксах, путём биоконверсии мясокостной муки с превышением предельно допустимой концентрации по микотоксинам и отходов масло-экстракционного производства с помощью
рекомбинантного штамма Y. lipolytica. В настоящее время существует необходимость получения данных о ее безопасности для физиологического состояния животных. Решение это проблемы и являлось целью настоящего исследования.
Материалы и методы. Эксперименты для изучения острой токсичности лабораторного образца сухой биомассы рекомбинантного штамма Y. lipolytica - продуцента микроин-капсулированной ß-1,4-маннаназы B. circulans, проводили в лаборатории кафедры физиологии и химии и в условиях вивария факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВО Курская ГСХА. Исследования безопасности опытного образца проводили в сравнении с препаратом Nutrizyme Beta-Mannanase (Sunson Industry Group Co., Китай). Препарат разрешен к применению в России и признан ранее безопасным. Данный препарат представляет собой ß маннаназу Bacillus lentus для кормления продуктивных животных с активностью 3000-25000Ед/г.
Опыты проводили на белых мышах обоего пола массой 22±2 г. Животным однократно, внутрижелудочно вводили исследуемые растворы препаратов в виде приготовленной суспензии (в 1% крахмальном клейстере), через металлический зонд с гладкой оливой на конце в допустимом по максимуму для данного вида животных (из-за их массы тела) объёме в 0,5 мл. Для приготовления суспензий исследуемого препарата и препарата сравнения их смешивали с 1% крахмальным клейстером таким образом, чтобы концентрация препаратов была максимальной и также с этим была сохранена возможность продвижения приготовленных взвесей для введения препаратов внутрь мышиного желудка через просвет зонда. Этим условиям удовлетворило растворение 300 мг исследуемого препарата в 1 мл 1% крахмального клейстера. Таким образом, в среднем, мышам с массой тела 20 г вводили 0,15 грамм исследуемого препарата и препарата сравнения, что соответствует дозе 7,5 г/кг.
О токсическом действии препаратов судили по общему состоянию животных и их выживаемости, LD50. На третьи сутки, после затравки препаратами, был проведён подсчёт погибших и выживших животных с последующим наблюдением на протяжении 2-х недель за последними. По методу Штабского было рассчитано LD50 на основании полученных результатов.
Таблица 1 - Исследование острой токсичности на мышах при внутрижелудочном введении
Группа животных Доза г/кг Число животных летальность, % LD16 мг/кг LD50 мг/кг LD84 мг/кг
общее погибшие выжившие
I 7,5 15 0 15 0 н/о н/о н/о
II 7,5 15 0 15 0 н/о н/о н/о
Примечание: группа - Лабораторный образец сухой биомассы рекомбинантного штамма Y. lipolytica - продуцента микроинкапсулированной ß-1,4-маннаназы B. circulans, группа II -Nutrizyme Beta-Mannanase (Sunson Industry Group Co., Китай). Значения LD в миллиграммах на килограмм, н/о - не определяется.
Соблюдение этических стандартов закреплено на заседании этического комитета Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. Иванова, г. Курск от 05.04.2021 г, протокол №2.
Результаты исследования. Проведенные исследования показали, что после внутрижелу-дочного введения мышам исследуемого препарата в сравнении с препаратом Nutrizyme BetaMannanase в дозе 7,5 г/кг никаких токсических явлений и падежа мышей не наблюдалось (таблица 1).
Проведенные исследования показали, что после внутрижелудочного введения мышам исследуемого препарата заметных изменений в поведении животных не наблюдалось даже при применении максимальной дозы раствора (7,5 г/кг), соответствующей максимально возможному объему вещества носителя, вводимому мышам внутрижелудочно. Рассчёт препаратов LD50 по методу Штабского не представлялся возможным в виду достижения для данного вида животных максимально допустимого объёма для внутрижелудочного введения. Проведенные исследования так же показали, что после внут-рижелудочного введения мышам препарата сравнения при применении дозы 7,5 г/кг существенных проявлений интоксикации не наблюдалось.
Согласно классификации К.К.Сидорова полученные экспериментальные данные, внутри-желудочного введения мышам обоего пола препарата «сухой биомассы рекомбинантного штамма Yarrowia lipolytica продуцента микроинкапсулированной ß-1,4-маннаназы из Bacillus circulans» позволяют отнести данный препарат к IV классу, малотоксичным веществам. Свидетельствует о хорошей переносимости и без-
вредности препарата состояние переживших острую интоксикацию животных, проверенную в дозах, превышающих дозировки, рекомендованные для кормопроизводства, в несколько сотен раз.
Таким образом, препарат сухой биомассы рекомбинантного штамма Yarrowia lipolytica продуцента микроинкапсулированной ß-1,4-маннаназы из Bacillus circulans при изучении острой токсичности при внутрижелудочном введении мышам обоего пола показал равнозначную токсичность в сравнении с препаратом сравнения - Nutrizyme Beta-Mannanase (Sunson Industry Group Co., Китай). Исследуемый препарат и препарат сравнения можно отнести к малотоксичным препаратам.
Выводы. В исследовании показана безопасность новой кормовой добавки, представляющей собой препарат сухой биомассы рекомби-нантного штамма Y. lipolytica - продуцента микроинкапсулированной ß-1,4-маннаназы B. circulans в исследовании на мышах, в дозах превышающих предложенную для применения в животноводстве в сотни раз. Это открывает возможности для применения данного препарата в промышленном птицеводстве и свиноводстве с целью улучшения кормовой эффективности кормов, увеличения привесов и улучшения общего физиологического состояния и иммунного статуса продуктивных животных.
Благодарности в исследованни выражены Худину А.Н. (Курский государственный университет) и Харченко Е.В. (Курская государственная сельскохозяйственная академия имени И.И. Иванова) за предоставленную возможность выполнения экспериментальной части исследования на базе научно-исследовательских лабораторий.
Список использованных источников
1. Preparation of asparagine-linked monoglucosylated high-mannosetype oligosaccharide from egg yolk / Ning Wang, Akira Seko, Yoichi Takeda, Yukishige Ito // Carbohydrate Research. - 2015. - Vol. 411, 26 June. - P. 37-41.
2. Sharma, Vandana. Mannose metabolism: More than meets the eye Review Article / Vandana Sharma, Mie Ichikawa, Hudson H. Freeze // Biochemical and Biophysical Research Communications.
- 2014. - Vol. 453, issue 2, 17 October. - P. 220-228.
3. Mannosidase IA is in Quality Control Vesicles and Participates in Glycoprotein Targeting to ERAD / Navit Ogen-Shtern, Edward Avezov, Marina Shenkman, Ron Benyair, Gerardo Z. Lederkremer // Original Research Article Journal of Molecular Biology. - 2016. - Vol. 428, Issue 16, 14 August. - P. 3194-3205.
4. Frequent IgG subclass and mannose binding lectin deficiency in patients with chronic fatigue syndrome / Sabrina Guenther, Madlen Loebel, Agnes A. Mooslechner, Michael Knops, Leif G. Hanitsch, Patricia Grabowski, Kirsten Wittke, Christian Meisel, Nadine Unterwalder, Hans-Dieter Volk, Carmen Scheibenboge // Original Research Article Human Immunology. - 2015. - Vol. 76, Issue 10, October. - P. 729-735.
5. Liu, Yaoqing Diana. Effect of high mannose glycan pairing on IgG antibody clearance / Yaoqing Diana Liu, Gregory C. Flynn // Original Research Article Biologicals. - 2016. - Vol. 44, issue 3, May.
- P. 163-169.
6. Геммицеллюлозы зерна злаков и ферменты, катализирующие их расщепление / Н.А. Родионова, Л.В. Капрельянц, П.В. Середницкий, А.Ю. Килимник // Прикладная биохимия и микробиология. - 1992. - Т. 28. - вып. 5. - С. 645-664.
7. Kurakake, M. Production of beta-mannanase and beta-mannosidase from Aspergillus awamori K4 and their properties / M. Kurakake, T. Komaki. - Hiroshima : Fukuyama University. - 2001. - Vol. 42. - P. 377-380.
8. Springerplus. Recovery and Purification of Oligosaccharides from Copra Meal by Recombinant Endo-0-mannanase and Deciphering Molecular Mechanism Involved and Its Role as Potent Therapeutic Agent / A. Ghosh, A. K. Verma, J. R. Tingirikari, R. Shukla, A. Goyal // Molecular Biotechnology.
- 2014. - P. 403-406.
9. Ki-Hong, Y. Characterization of the Bacillus subtilis WL-3 Mannanase from a Recombinant Escherichia coli / Y. Ki-Hong, C. Seesub, L. Byung-Lak // J. of Microbiology. - 2008. - Vol. 46. - № 3. - P. 344-349.
10. Корнеева О.С., Чигирина Н.А. Биосинтез Р-маннаназы грибом Trichoderma harzianum при глубинном культивировании // Вестник Воронеж. гос. технол. акад. - 2004. - № 9. - С. 54-57.
11. A P-mannanase from B. subtilis B36: purification, properties sequencing, gene cloning and expression in E. coli. Z. / Y. N. Li, K. Meng, Y. R. Wangm, B. Yao // Naturforsch (C). - 2006. - Vol. 61.
- P. 840-846.
12. Structure and functional investigation of ligand binding by a family 35 carbohydrate binding module (CtCBM35) of P-mannanase of family 26 glycoside hydrolase from Clostridium thermocellum / A. Ghosh, A. K. Verma, S. Gautam, M. N. Gupta, A. Goyal // J. Agric Food Chem. - 2013. - Vol. 61, № 50. - P. 123-124.
13. Production and properties of beta-mannasase by free and immobilized cells of Aspergillus oryzae NRRL 3488 / A. M. Hashem, A. M. Ismail, M. A. ELRefai, A. F. Abdel-Fattah. - Cairo : National Research Centre, 2001. - Vol. 105. - P. 115-130.
14 Production, partial purification and properties of P-mannanases obtained by solid substrate fermentation of spent soluble coffee wastes and copra paste using Aspergillus oryzae and Aspergillus niger / C. Regalado, B. E. Garcia-Almendarez, L. M. Venegas-Barrera, A. Tellez-Jurado, G. Rodriguez-Serrano, S. Huerta-Ochoa, J. R. Whitaker // J. Sci. Food Agric. - 2000. - Vol. 80. - P. 143-150.
15. Montiel, M. D. Evaluation of an endo-beta-mannanase produced by Streptomyces ipomoea CECT 3341 for the biobleaching of pine kraft pulps / M. D. Montiel, M. Hernandez, J. Rodriguez. -Madrid : Universidad de Alcala, 2002. -Vol. 58. - P. 67-72.
16. Р-маннаназы различного происхождения: получение, характеристика и перспективы практического применения / Д. С. Черенков, О. С. Корнеева, Е. Г. Новоселова и др. // Успехи современной биологии. - 2010. - Т. 130. - № 2. - С. 190-199.
17. Macro-micro fungal cultures synergy for innovative cellulase enzymes production and biomass structural analyses / Sai Praneeth Thota, Pradeep Kumar Badiya, Sandeep Yerram, Praveen V. Vadlani, Meera Pandey, Nageswara Rao Golakoti, Siva Kumar Belliraj, Rajesh Babu Dandamudi, Sai Sathish Ramamurthy // Original Research Article Renewable Energy. - 2017. - Vol. 103, April. -P. 766-773.
18. Multi-component thermostable cellulolytic enzyme production by Aspergillus niger HN-1 using pea pod waste: Appraisal of hydrolytic potential with lignocellulosic biomass / Reetika Sharma, Rekha Rawat, Ravinder Singh Bhogal, Harinder Singh Oberoi // Original Research Article Process Biochemistry. - 2015. - Vol. 50, issue 5, May. - P. 696-704.
19. Production and characterization of cellulolytic enzyme from Penicillium oxalicum GZ-2 and its application in lignocellulose saccharification / Hanpeng Liao, XiaoTeng Fan, Xinlan Mei, Zhong Wei, Waseem Raza, Qirong Shen, Yangchun Xu // Original Research Article Biomass and Bioenergy. -2015. - Vol. 74, March. - P. 122-134.
20. Identification of endoglucanases, xylanases, pectinases and mannanases in the multi-enzyme complex of Bacillus licheniformis SVD1 / J. Susan van Dyk, Makiko Sakka, Kazuo Sakka, Brett I. Pletschke // Original Research Article Enzyme and Microbial Technology. - 2010. - Vol. 47, issue 3, 5 August. - P. 112-118.
Spisok ispoFzovanny'x istochnikov
6. Gemmicellyulozy' zerna zlakov i fermenty', kataliziruyushhie ix rasshheplenie / N.A. Rodionova, L.V. Kaprel'yancz, P.V. Seredniczkij, A.Yu. Kilimnik // Prikladnaya bioximiya i mikrobiologiya. - 1992. - T. 28. - vy'p. 5. - S. 645-664.
10. Korneeva O.S., Chigirina N.A. Biosintez P-mannanazy' gribom Trichoderma harzianum pri glubinnom kul'tivirovanii // Vestnik Voronezh. gos. texnol. akad. - 2004. - № 9. - S. 54-57.
16. P-mannanazy' razlichnogo proisxozhdeniya: poluchenie, xarakteristika i perspektivy' prakticheskogo primeneniya / D. S. Cherenkov, O. S. Korneeva, E. G. Novoselova i dr. // Uspexi sovremennoj biologii. - 2010. - T. 130. - № 2. - S. 190-199.
