УДК 615.281.8, 615.375 DOI: 10.15372/SSMJ20180102
экспериментальное исследование острой токсичности пероральной формы пегилированного интерферона a2-b
Дмитрий Николаевич КИНШТ1,2, Павел Геннадьевич МАДОНОВ12, Татьяна Сергеевна ТАРТЫНОВА1, Алексей Александрович ЧУРИН3, Евгений Юрьевич ШЕРСТОБОЕВ3
1 Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России 630091, г. Новосибирск, Красный просп., 52
2АО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологии» 630056, г. Новосибирск, ул. Софийская, 20
3 НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга, Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН 634028, г. Томск, просп. Ленина, 3
Цель работы - изучение острой токсичности готовой лекарственной формы пегилированного интерферона а-2Ь для перорального применения, полученного с помощью технологии электронно-лучевого синтеза. Материал и методы. Препарат вводился перорально мышам и крысам в расчетных терапевтических дозах и дозах, их превышающих. Регистрировались параметры: гибель животных, общее состояние и поведение, масса тела. Результаты и их обсуждение. Препарат не обладает токсическим действием при пероральном введении. Макроскопических признаков повреждения желудка не обнаружено. Определение LD не представляется возможным.
Ключевые слова: интерферон а-2Ь, пегилирование, иммобилизация, острая токсичность, доклинические исследования.
Рекомбинантные интерфероны в современной медицине применяются для терапии вирусных инфекций. В основном используется инъекционный путь введения интерферонов, который в ряде случаев недостаточно комплаентен для пациента, а также не всегда обеспечивает терапевтическую концентрацию в органах, поврежденных вирусами. Технология радиационного синтеза, основанная на облучении потоком ускоренных электронов раствора инертного полимера (например, полиэтиленгликоля (ПЭГ)) с белковыми молекулами (например, интерферона (ИФН)) позволяет синтезировать лекарственные средства, обладающие биодоступностью при пероральном приеме и сохраняющими фармакодинамические свойства исходных белковых молекул [1, 2]. Вместе с тем необходимо учитывать, что иммобилизация белковых молекул на инертных носителях изменяет фармакологические свойства исходных белков
[9]. Воздействие ионизирующего излучения также может изменять структуру протеинов вплоть до их разрушения. В связи с этим фармакологические свойства интерферонов, модифицированных иммобилизацией с помощью технологии электронно-лучевого синтеза, должны быть тщательно изучены. Ранее in vitro и in vivo было показано сохранение иммунотропных свойств модифицированного ПЭГ-ИФН a-2b [7, 8]. Изучение токсикологической безопасности на животных в остром эксперименте является обязательной частью изучения токсичности новых лекарственных препаратов и химических соединений [5].
Цель данной работы - токсикологическая оценка безопасности готовой лекарственной формы для перорального применения ПЭГ-ИФН a-2b, полученного с помощью технологии электронно-лучевого синтеза, на животных в остром эксперименте.
Киншт Д.Н. - к.м.н., доцент кафедры фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины, e-mail: [email protected]
Мадонов П.Г. - д.м.н., проф., зав. кафедрой фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины
Тартынова Т.С. - клинический ординатор кафедры фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины
Чурин А.А. - д.м.н., заведующий отделом лекарственной токсикологии Шерстобоев Е.Ю. - д.м.н., проф., заведующий отделом иммунофармакологии
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Действующее вещество ПЭГ-ИФН a-2b получали с помощью облучения пучком электронов в дозе 1,5 Мрад предварительно замороженной при -70 °C смеси рекомбинантного ИФН a-2b с 5%-м раствором ПЭГ-1500. Состав готовой лекарственной формы (на 1 капсулу): ПЭГ-ИФН a-2b 1,2 х 106 ME, вспомогательные вещества -мальтодекстрин 0,3-0,36 г, декстран 0,035920,0898 г, полиэтиленгликоль 0,004-0,01 г, ЭДТА 0,08-0,2 мг. Изучаемое лекарственное средство защищено патентом РФ [3]. Животным перораль-но вводили готовую лекарственную форму в растворе фосфатно-солевого буфера.
Использовались аутбредные животные, 60 мышей CD-1, 60 крыс CD. Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986), ГОСТ Р 53434-2009, со статьей 11 Федерального закона от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств». Определение острой токсичности ПЭГ-ИФН a-2b проведено в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [5]. В исследовании использованы животные одного возраста (2,5 мес.). Животные распределялись по группам случайным образом, так, чтобы их индивидуальная масса не отличалась более чем на 10 % средней массы животных одного пола. Время непрерывного наблюдения составляло 8 ч после введения вещества. Наблюдение общего состояния здоровья, выявление признаков токсичности, тяжелого состояния, смертности проводились один-два раза в день (в первой и во второй половине дня) во всех группах в течение всего периода наблюдения. Осмотр осуществлялся в клетке, на руках, а в случае необходимости -на открытой поверхности. Потребление корма регистрировалось ежедневно, визуально.
Оценивались характер экскреции, состояние шерсти, кожных покровов и слизистых оболочек, аппетит, дыхание, подвижность, нервно-мышечная возбудимость, походка, агрессивность, миоз/ мидриаз/экзофтальм и другие признаки отклонения от здоровья. Массу тела регистрировали во всех группах перед введением препарата, еженедельно в течение всего периода наблюдения, и выражали в граммах, прирост массы тела относительно первого дня исследования - в процентах.
В «остром» эксперименте были использованы следующие дозы: общепринятые терапевтические для человека в пересчете на мышей и крыс [6], а также дозы, их превышающие, - до пятикратной у мышей и девятикратной у крыс.
Препарат вводили внутрижелудочно, мышам (самцы и самки): 60 х 106 и 120 х 106 МЕ/кг -однократно, 200 х 106 МЕ/кг - двукратно с интервалом 4 ч в максимально допустимых объемах, 250 х 106 МЕ/кг и 300 х 106 МЕ/кг - трехкратно с интервалом 4 ч в максимально допустимых для мышей объемах (0,8-1 мл); крысы получали 12 х 106 МЕ/кг, 24 х 106 МЕ/кг и 36 х 106 МЕ/кг -однократно, 72 х 106 МЕ/кг - двукратно с интервалом 4 ч в максимально допустимых объемах, 108 х 106 МЕ/кг - трехкратно с интервалом 4 ч в максимально допустимых для крыс объемах (5-8 мл).
Дозы препарата рассчитывали для каждого животного индивидуально, исходя из массы тела. В ходе исследования регистрировались:
1) гибель животных - ежедневно от начала до окончания периода наблюдения (14 дней);
2) общее состояние и поведение, тип токсических проявлений, их появление, развитие и/или прекращение их проявлений - ежедневно на протяжении 14-дневного периода наблюдения;
3) степень выраженности токсических проявлений (при их наличии) - ежедневно на протяжении 14-дневного периода наблюдения;
4) массу тела животных - в период проведения карантина и в ходе наблюдения.
После окончания эксперимента на 15 день животные были подвергнуты эвтаназии для осмотра внутренних органов. В случае гибели животных для определения LD10, LD50, и LD90 планировалось проведение пробит-анализа методом В.Б. Прозоровского [4].
Для количественных данных применена описательная статистика: подсчитаны среднее значение и стандартная ошибка среднего, которые представлены в итоговых таблицах. Для определения достоверности межгрупповых различий данные проанализированы с применением параметрических или непараметрических критериев в зависимости от типа распределения количественных данных. Нормальность распределения вариантов в группе определялась тестом Шапиро - Уилка при 5%-м уровне значимости, различия между группами определяли с помощью г-критерия Стьюдента или критерия Манна -Уитни и считали статистически значимыми при р < 0,05. Анализ выполнен для каждого пола отдельно.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При внутрижелудочном введении готовой лекарственной формы ПЭГ-ИФН а-2Ь мышам и крысам в различных дозах гибели животных не наблюдалось. При наблюдении в течение 14 дней
Таблица 2
Средние значения и прирост массы тела крыс при пероральном введении готовой лекарственной формы ПЭГ-ИФН а-2Ь в разных дозировках
Таблица 1
Средние значения и прирост массы тела мышей при пероральном введении готовой лекарственной формы ПЭГ-ИФН а-2Ь в разных дозировках
День взвешивания Пол, число в группе Группа животных
Контроль 60х106 МЕ/кг 120х106 МЕ/кг 200х106 МЕ/кг 250х106 МЕ/кг 300х106 МЕ/кг
Масса тела, г
Карантин в, П = 5 24,14 ± 0,57 25,82 ± 0,86 24,92 ± 0,87 24,73 ± 0,52 26,08 ± 0,43 24,24 ± 0,69
?, п = 5 20,14 ± 0,26 20,02 ± 0,10 19,98 ± 0,16 19,87 ± 0,16 19,98 ± 0,07 20,26 ± 0,27
1 день в, п = 5 31,44 ± 1,80 31,52 ± 1,29 32,58 ± 1,44 31,70 ± 0,91 31,96 ± 0,97 32,50 ± 1,53
?, п = 5 22,80 ± 0,93 23,36 ± 0,70 22,28 ± 0,72 21,92 ± 0,69 22,78 ± 0,50 22,54 ± 0,80
8 день в, п = 5 34,94 ± 1,80 35,02 ± 1,29 36,18 ± 1,51 35,10 ± 1,01 35,50 ± 0,94 35,78 ± 1,52
?, п = 5 26,30 ± 0,93 26,42 ± 0,77 26,02 ± 0,90 25,44 ± 0,89 25,98 ± 0,76 25,98 ± 0,78
15 день в, п = 5 38,86 ± 1,91 39,00 ± 1,49 39,78 ± 1,59 38,50 ± 1,11 39,04 ± 0,91 39,06 ± 1,52
?, п = 5 30,22 ± 0,98 29,48 ± 0,92 29,76 ± 1,10 28,96 ± 1,14 29,18 ± 1,04 29,42 ± 0,86
Прирост массы тела, %
8 день в, п = 5 11,30 ± 0,68 11,18 ± 0,45 11,10 ± 0,39 10,72 ± 0,10 11,12 ± 0,45 10,18 ± 0,66
?, п = 5 15,46 ± 0,66 13,14 ± 1,19 16,76 ± 0,72 16,03 ± 1,21 13,99 ± 1,14 15,40 ± 1,58
15 день в, п = 5 23,84 ± 1,82 23,84 ± 1,85 22,22 ± 0,79 21,44 ± 0,17 22,26 ± 0,93 20,38 ± 1,32
?, п = 5 32,75 ± 1,51 26,27 ± 2,37 33,52 ± 1,45 32,06 ± 2,42 27,98 ± 2,29 30,79 ± 3,17
День взвешивания Пол, число в группе Группа животных
Контроль 12х106 МЕ/кг 24х106 МЕ/кг 36х106 МЕ/кг 72х106 МЕ/кг 108х106 МЕ/кг
Масса тела, г
Карантин в, п = 5 185,96 ± 7,47 183,03 ± 12,52 172,92 ± 7,18 176,04 ± 7,38 183,57 ± 5,01 183,10 ± 11,30
?, п = 5 169,43 ± 7,11 160,47 ± 4,06 163,32 ± 3,98 167,20 ± 6,05 159,77 ± 4,49 162,49 ± 10,75
1 день в, п = 5 234,00 ± 5,10 233,20 ± 2,60 233,40 ± 3,08 234,40 ± 3,87 235,00 ± 2,81 234,40 ± 3,01
?, п = 5 203,95 ± 5,57 202,98 ± 6,67 202,77 ± 7,48 204,24 ± 5,78 200,81 ± 5,99 202,74 ± 5,78
8 день в, п = 5 272,00 ± 5,51 269,60 ± 3,57 270,00 ± 3,69 272,80 ± 4,94 274,00 ± 3,16 270,40 ± 4,03
?, п = 5 236,15 ± 5,67 235,37 ± 6,18 235,17 ± 6,81 235,44 ± 6,97 233,81 ± 5,50 234,94 ± 6,18
15 день в, п = 5 308,00 ± 5,54 306,80 ± 3,51 305,60 ± 4,42 308,00 ± 6,26 310,60 ± 3,64 305,00 ± 4,42
?, п = 5 267,95 ± 6,23 267,34 ± 5,64 267,17 ± 7,12 266,04 ± 6,46 265,01 ± 5,29 266,74 ± 5,77
Прирост массы тела, %
8 день в, п = 5 16,26 ± 0,71 15,60 ± 0,51 15,68 ± 0,62 16,37 ± 0,24 16,60 ± 0,58 15,35 ± 0,61
?, п = 5 15,83 ± 0,66 16,06 ± 0,77 16,11 ± 0,93 15,27 ± 0,59 16,53 ± 1,03 15,91 ± 0,30
15 день в, п = 5 31,70 ± 1,58 31,58 ± 1,03 30,93 ± 0,78 31,37 ± 0,58 32,17 ± 0,33 30,13 ± 1,06
?, п = 5 31,44 ± 0,77 31,91 ± 1,57 31,96 ± 1,41 30,33 ± 0,89 32,15 ± 1,86 31,67 ± 0,89
после внутрижелудочного введения препарата не было зафиксировано никаких отклонений общего состояния, внешнего вида и поведения животных. В этой ситуации проведение пробит-анализа для определения LD10, LD50, и LD90 не представляется возможным.
При запланированной эвтаназии на 15 день наряду с общим осмотром проведен осмотр желуд-
ка (место введения). Никаких макроскопических признаков, свидетельствующих о повреждении желудка - гиперемии, нарушении целостности слизистой оболочки, не обнаружено. Результаты взвешивания животных, представленные в таблицах, свидетельствуют о том, что статистически значимых различий между контролем и группами наблюдения не наблюдается.
заключение
Проведена токсикологическая оценка безопасности готовой лекарственной формы для перорального применения ПЭГ-ИФН а-2Ь, полученного с помощью технологии электроннолучевого синтеза, на мышах и крысах в остром эксперименте. Установлено, что исследуемый препарат в расчетных терапевтических дозах и дозах, их превышающих (до пятикратной у мышей и девятикратной у крыс), не обладает токсическим действием при внутрижелудочном введении в течение 14 дней; у мышей и крыс не было зафиксировано никаких отклонений общего состояния, внешнего вида и поведения. Гибели животных не зафиксировано, статистически значимых различий массы тела между контролем и группами наблюдения не обнаружено. Макроскопическое исследование при вскрытии животных на 14 сутки после введения не выявило какой-либо патологии внутренних органов. Препарат не обладает местно-раздражающим действием.
Введение лекарственной формы крысам и мышам в максимально возможном объеме не позволило достигнуть гибели животных и, следовательно, применить пробит-анализ для вычисления LD10, LD50, и LD90. Таким образом, для мышей значение LD50 превышает 300 х 106 МЕ/кг, для крыс - 108 х 106 МЕ/кг. Использованные дозы многократно превышают максимально применяемые суточные дозы ИФН а-2Ь для человека в пересчете на массу тела при парентеральном введении (от 3 млн МЕ/сут или 43000 МЕ/кг); препарат при внутрижелудочном введении в дозах, максимально возможных для введения животным, может быть отнесен к 4 классу опасности (по классификации ГОСТ 12.1.007-76).
Таким образом, отсутствие токсичности в «остром» эксперименте при сохранении имму-нотропных свойств и подтвержденной биодоступности при пероральном приеме позволяет рассматривать модифицированный иммобилизацией с помощью технологии электронно-лучевого синтеза ИФН а-2Ь как препарат, расширяющий арсенал пероральных иммунотропных средств в практической медицине.
благодарности
Данная работа проведена в рамках исполнения Государственного контракта от 14 мая 2012 г. № 16.N08.12.1017, ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности
Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» (шифр темы проекта «2012-2.5-16-N08-0001-001»).
список литературы
1. Киншт Д.Н., Мадонов П.Г., Святченко В.А., Терновой В.А. Экспериментальное обоснование применения пероральной формы пегилированного интерферона a2-b для терапии энтеровирусной инфекции // Сиб. науч. мед. журн. 2017. 37. (3). 11-16.
2. Мадонов П.Г., Ершов К.И., Дубровин А.В., Заполоцкий Е.Н., Мирошников П.Н., Шилова М.А., Киншт Д.Н. Электронно-лучевая модификация препаратов белковой природы для улучшения их фармакологических свойств // Мед. и образ. в Сибири. 2013. (4). Режим доступа: http://ngmu.ru/cozo/ mos/article/text_full.php?id=1115. Дата обращения: 13.09.2017.
3. Пат. № 2554761 РФ. Противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство / А.В. Артамонов, А.А. Бекарев, Н.В. Балданов, Д.Н. Киншт, П.Г. Мадонов, П.Н. Мирошников, А.М. Дыгай, М.Г. Данилец, А.А. Лигачева, Н.В. Масная, Е.С. Трофимова, Е.Ю. Шерстобоев, О.Г. Шитикова; Опубл. 13.05.2014.
4. Прозоровский В.Б. Использование метода наименьших квадратов для пробит-анализа кривых летальности // Фармакология и токсикология. 1962. 25. (1). 115-119.
5. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / ред. А.Н. Миронов. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.
6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / ред. Р.У. Хабриев. М.: Медицина, 2005. 832 с.
7. Шерстобоев Е.Ю., Шитикова О.Г., Масная Н.В., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Лигачева А.А., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Ершов К.И., Шилова М.А. Иммунотропные свойства иммоби-лизированного интерферона a-2b // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2016. 161. (5). 637-641.
8. Шитикова О.Г., Шерстобоев Е.Ю., Мас-ная Н.В., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Лигачева А.А., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Ершов К.И., Шилова М.А. Влияние иммобилизированного интерферона-а2Ь на функциональную активность иммунокомпетентных клеток in vitro // Иммунология. 2016. 37. (3). 155-161.
9. Wang Y.S., Youngster S., Grace M., Bausch J., Bordens R., Wyss D.F. Structural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. 54. (4). 547-570.
experimental study of the acute toxicity of the oral form of PEGYLATED interferon a2-b
Dmitriy Nikolaevich KINSHT1-2, Pavel Gennad'evich MADONOV12, Tatyana Sergeevna TARTYNOVA1, Alexey Alexandrovich CHURIN3, Eugeniy Yur'evich SHERSTOBOEV3
1 Novosibirsk State Medical University of Minzdrav of Russia 630091, Novosibirsk, Krasny av., 52
2 Siberian Center of Pharmacology and Biotechnology 630056, Novosibirsk, Sofiyskaya st., 20
3 Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine, Tomsk National Research Medical Center of RAS
634028, Tomsk, Lenin av., 3
The aim of the study is to investigate the acute toxicity of the oral finished dosage form of pegylated interferon a-2b, obtained with the help of electron-beam synthesis technology. Material and methods. The preparation was orally administered to mice and rats at calculated therapeutic doses and doses exceeding them. Recorded parameters: animal death, general condition and behavior, weight of animals. Results and discussion. The drug has no toxic effect when administered orally. No macroscopic signs of gastric damage were found. The definition of LD is not possible.
Key words: interferon a-2b, pegylation, immobilization, acute toxicity, preclinical trials.
Kinsht D.N. - candidate of medical sciences, associate professor of the chair for pharmacology, clinical pharmacology and evidentiary medicine, e-mail: [email protected] Madonov P.G. - doctor of medical sciences, professor, head of the chair for pharmacology, clinical pharmacology and evidentiary medicine
Tartynova T.S. - clinical resident of the chair for pharmacology, clinical pharmacology and evidentiary medicine
Churin A.A. - doctor of medical sciences, head of the department of drug toxicology
Sherstoboev E.Yu. - doctor of medical sciences, professor, head of immunopharmacology department