ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПЕРОРАЛЬНОЙ ФОРМЫ ПЕГИЛИРОВАННОГО ИНТЕРФЕРОНА α-2B ДЛЯ ТЕРАПИИ ЭНТЕРОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.281.8

экспериментальное обоснование применения пероральной формы пегилированного интерферона о1-2Ь для терапии энтеровирусной инфекции

Дмитрий Николаевич КИНШТ12, Павел Геннадьевич МАДОНОВ1,2,

Виктор Александрович СВЯТЧЕНКО3, Владимир Александрович ТЕРНОВОЙ3

1 Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России 630091, г. Новосибирск, Красный просп., 52

2 ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологии» 630090, г. Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 10

3 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» 630559, Новосибирская обл., р.п. Кольцово

Цель работы - изучение противовирусной активности и некоторых параметров фармакокинетики пероральной формы пегилированного интерферона а-2Ь (ПЭГ-ИФН а-2Ь), полученного с помощью технологии электроннолучевого синтеза. Материал и методы. Противовирусная активность ПЭГ-ИФН а-2Ь изучалась в отношении вируса Коксаки на культуре клеток ЯС. Для исследования фармакокинетики использован ПЭГ-ИФН а-2Ь, меченый ФИТЦ. Результаты и обсуждение. ПЭГ-ИФН а-2Ь обладает сравнимой специфической активностью с исходным интерфероном. Биодоступность ПЭГ-ИФН а-2Ь при внутрижелудочном введении 29,68 %. Препарат обнаруживается в ткани тонкого кишечника в достаточно высокой концентрации.

Ключевые слова: интерферон а-2Ь, энтеровирусная инфекция, пегилирование, нанотехнологии, иммобилизация, иммобилизированный интерферон а-2Ь.

Одним из глобальных вызовов в современной медицине является отсутствие достаточного арсенала высокоэффективных лекарственных средств (ЛС) для лечения инфекционных заболеваний энтеровирусной этиологии. Между тем энтеровирусная инфекция распространена повсеместно, а источником инфекции является только человек. Для ее успешного лечения потенциальный лекарственный препарат помимо специфичности действия должен иметь особые фармакокинетические свойства, позволяющие ему представительствовать на протяжении желудочно-кишечного тракта в достаточной терапевтической концентрации. Помимо этого, он должен создавать терапевтически значимые концентрации и в кровеносном русле. Многолетний клинический опыт лечения инфекционных вирусных заболеваний свидетельствует о высоком терапевтическом потенциале лекарственных

препаратов на основе рекомбинантных интер-феронов. Однако у таких ЛС, как и других белков, малая устойчивость в агрессивной среде желудочно-кишечного тракта, низкая энтеральная биодоступность.

В то же время решение задачи, связанной с биодоступностью белковых препаратов при пе-роральном применении, с успехом осуществлено с помощью использования технологии радиационного синтеза. Радиационный синтез позволяет создавать конъюгаты интерферона и полимера, которые, с одной стороны, существенно не нарушают фармакодинамических свойств интерферона, а с другой - выгодно улучшают его фармакокинетические свойства. Такой синтез осуществляется с помощью применения направленного потока ускоренных электронов с использованием широкого диапазона энергии электронов (1-5 МэВ) и доз от 0,5 до 6 Мрад [3].

Киншт Д.Н. - к.м.н., доцент кафедры фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины, е-таИ: [email protected]

Мадонов П.Г. - д.м.н., проф., зав. кафедрой фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины

Святченко В.А. - к.б.н., зав. лабораторией вирусологии флавивирусов

Терновой В.А. - к.б.н., зав. лабораторией молекулярной эпидемиологии особо опасных инфекций

Целью данной работы явилось изучение противовирусной активности и некоторых параметров фармакокинетики пероральной формы ПЭГ-ИФН а-2Ь, полученного с помощью технологии электронно-лучевого синтеза.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Пероральную форму ПЭГ-ИФН а-2Ь получали с помощью облучения пучком электронов в дозе 1,5 Мрад предварительно замороженной при -70 °С смеси рекомбинантного ИФН а-2Ь с 5%-м раствором полиэтиленгликоля-1500.

Исследование противовирусной активности ПЭГ-ИФН а-2Ь проводилось в отношении вируса Коксаки А7 (штамм ЖЭВ-8) и В6 (штамм ЖЭВ-15) на культуре клеток ЯВ с использованием схемы с предынкубацией клеток с различными концентрациями исследуемого ЛС. Для этого разведения ПЭГ-ИФН а-2Ь на культуральной среде БМЕМ добавляли к клеткам, культивированным в стандартных 96-луночных культураль-ных микропланшетах за 6 ч до инфицирования согласно [7].

Эффективность подавления репликации вируса исследована посредством количественного ОТ-ПЦР анализа в режиме реального времени. Монослой клеток ЯВ с указанными концентрациями ПЭГ-ИФН а-2Ь инкубировали в течение 6 ч, после чего клетки инфицировали дозой 100 ТЦД50 вируса Коксаки А7 и через 30 ч в клеточных лиза-тах определяли количество вирусной РНК. Количественный ОТ-ПЦР анализ выполняли согласно [7]. Количество вирусной РНК в клетках, предын-кубированных с ПЭГ-ИФН а-2Ь, нормализовали относительно контроля вируса (инфицированные вирусом клетки ЯВ без предынкубации с интерфероном).

Для определения концентрации ИФН в крови животных обычно применяются иммунофер-ментные методы, однако существующие наборы могут давать недостоверные результаты при попытке определения концентрации ИФН, иммоби-лизированных на инертных носителях. Поэтому для определения фармакокинетических параметров была использована методика определения ПЭГ-ИФН а-2Ь, меченного ФИТЦ [1]. В процессе получения ПЭГ-ИФН а-2Ь, меченного ФИТЦ, раствор может содержать как несвязанный ФИТЦ, так и молекулы избыточно меченого белка. Для удаления примесей непрореагировавшего ФИТЦ использовалась ультрафильтрация на центрифужных концентраторах (тип Vivaspin, GE, США), для удаления избыточно меченого белка -ионообменная хроматография.

Исследование фармакокинетики проводилось на половозрелых конвенциональных аут-бредных крысах-самцах стока CD разводки отдела экспериментальных биологических моделей НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга Томского национального исследовательского медицинского центра РАН. Животные, участвующие в экспериментах, содержались в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, Правилами лабораторной практики в Российской Федерации.

Активность ПЭГ-ИФН a-2b составляла 107 МЕ/мл. ПЭГ-ИФН a-2b вводился крысам однократно внутривенно в дозе 100 000 МЕ/кг (10 мкг/кг), внутрижелудочно однократно в дозе 100 000 МЕ/кг и курсом в течение 5 суток в дозе 100 000 МЕ/кг. Изучение фармакокинетики ЛС проводили согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [6].

Количество меченного ФИТЦ ПЭГ-ИФН a-2b в биологических пробах определяли по интенсивности флуоресценции ФИТЦ, используя спектрофлуориметр «Hitachi-HPp-4» (Hitachi Ltd., Япония). ПЭГ-ИФН a-2b, меченный ФИТЦ, был изучен на предмет флуоресцентных свойств. Раствор, содержащий изучаемый препарат, обладал специфическими флуоресцентными свойствами. Установлено, что оптимальная длина волны возбуждения флуоресценции соответствует 493,5 нм, а оптимальная длина волны для регистрации флуоресценции - 523,9 нм. Методика валидирована, построена калибровочная зависимость между концентрацией и откликом детектора, которая описывалась уравнением y = -0,5638х2 + 29,628х -17,394, но в диапазоне концентраций 2-300 нг/мл была близка к линейной с коэффициентом корреляции 0,9998.

Пробы крови и ткани тонкого кишечника у крыс после однократного и многократного вну-трижелудочного введения в различных дозах отбирали до и через 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 и 24 ч после последнего введения ПЭГ-ИФН a-2b. Кровь и органы у крыс забирали после эвтаназии в СО2-камере. Сыворотку крови получали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10-15 мин. Отобранные образцы сыворотки хранили при температуре -20 °C до выполнения анализа. Полученные образцы тканей и органов промывали в физиологическом растворе и замораживали в индивидуальных контейнерах при температуре -20 °C до выполнения анализа.

Для определения концентрации лекарственного вещества в биологических объектах проводили предварительную пробоподготовку.

Сыворотка крови. Для определения меченного ФИТЦ ПЭГ-ИФН а-2Ь образцы сыворотки объемом 500 мкл помещали в чистые круглодон-ные пробирки и добавляли 500 мкл воды, перемешивали, центрифугировали при 3000 g 10 мин и оценивали интенсивность флуоресценции при установленной длине волны возбуждения 493,6 нм и длине волны испускания 523,9 нм. Для оценки исходного уровня автофлуоресценции у 6 интактных животных пробы сыворотки крови получали аналогичным способом.

Ткань тонкого кишечника. Для определения меченного ФИТЦ ПЭГ-ИФН а-2Ь в тканях навеску ткани (около 1 г) тщательно растирали в ступке при добавлении 2 мл воды. После гомогенизации добавляли еще 2 мл воды, тщательно перемешивали содержимое и переносили суспензию в чистые пробирки. Полученную суспензию встряхивали на шейкере в течение 10 мин. После этого пробирки центрифугировали при 3000 g 10 мин. Супернатант переносили в чистые пробирки и использовали для анализа. Для оценки исходного уровня автофлуоресценции у 6 интакт-ных животных пробы ткани получали аналогичным способом.

После определения концентраций меченного ФИТЦ ПЭГ-ИФН а-2Ь во всех образцах сыворотки крови и ткани кишечника определяли усредненный фармакокинетический профиль исследуемого препарата.

Для расчета фармакокинетических параметров использовали внемодельный метод статистических моментов [4]. Площади АиС и АиМС рассчитывали методом трапеций [2]. Результаты экспериментов обрабатывались методами вариационной статистики: вычисляли среднее значение выборки и стандартную ошибку среднего. В ходе исследований рассчитывали следующие фармакокинетические параметры: суммарную площадь под экспериментальной кривой «концентрация - время» АиС, суммарную площадь

под кривой момента AUMC, общий клиренс Cl, константу элиминации kel, время полувыведения Т1/2, среднее время удержания лекарственного вещества MRT, максимальную концентрацию Cmax и время достижения максимальной концентрации T .

max

Абсолютную биодоступность F меченного ФИТЦ ПЭГ-ИФН a-2b рассчитывали по формуле

AUC,„ х D

F =

в/с

в/в

AUCb/b хDb/c

где АиСв/с - площадь под фармакокинетической кривой после внесосудистого введения; АиСв/в -площадь под фармакокинетической кривой после внутривенного введения; Ов/в - величина дозы для внутривенного введения; Д^с - величина дозы для внесосудистого введения.

результаты и их обсуждение

Исследованиепротивовируснойактивности пегилированного интерферона а-2Ь. В предварительном эксперименте выявлено, что исследуемый препарат не оказывал токсического воздействия на культуру клеток ЯЛ во всем диапазоне используемых концентраций (разведения 1:30 - 1:93750).

Инфицирование осуществляли дозой 100 ТЦД50 вируса Коксаки А7. В контролях вируса (к клеткам вместо исследуемого ПЭГ-ИФН а-2Ь добавляли равные объемы культуральной среды) к этому сроку наблюдалась 100%-я вирус-индуцированная гибель клеточного монослоя. Параллельно проведено аналогичное исследование в отношении вируса Коксаки В6 (штамм ЖЭВ-15). Как видно из данных, представленных в табл. 1, достоверных различий противовирусной активности ПЭГ-ИФН а-2Ь в отношении двух используемых энтеровирусных штаммов не отмечено. Результаты исследования эффек-

Таблица 1

Противовирусная активность ПЭГ-ИФН а-2Ь в отношении вируса Коксаки А7 (штамм ЖЭВ-8),

Коксаки В6 (штамм ЖЭВ-15)

Препарат Количество жизнеспособных клеток в монослое, %

Концентрация ПЭГ-ИФН a-2b, МЕ/мл Контроль вируса

80 400 2000 10 000 50 000

Коксаки А7 (штамм ЖЭВ-8)

рчИФН a-2b 50 100 100 100 100 0

ПЭГ-ИФН a-2b 0 50 100 100 100 0

Коксаки B6 (штамм ЖЭВ-15)

рчИФН a-2b 50 100 100 100 100 0

ПЭГ-ИФН a-2b 5 47 100 100 100 0

Таблица 3

Фармакокинетические параметры меченного ФИТЦ ПЭГ-ИФН а-2Ь в сыворотке крови крыс после внутривенного и внутрижелудочного введения в дозе 100 000 МЕ/кг (10 мкг/кг), полученные на основании усредненных значений концентраций

Таблица 2

Количественный анализ уровней вирусной РНК в клетках КО, инфицированных вирусом Коксаки А7 (штамм ЖЭВ-8) и предынкубированных с различными концентрациями ПЭГ-ИФН а-2Ь

Препарат Количество вирусной РНК относительно контроля вируса, %

Концентрация ПЭГ-ИФН a-2b, МЕ/мл Контроль вируса

80 400 2000 10 000 50 000

рчИФН a-2b 50 33 20 10 3

ПЭГ-ИФН a-2b 100 42 28 15 5

Показатель Значение параметра

Внутривенно Внутрижелудочно

AUC, (нг х ч)/мл 564,11 167,44

AUMC, (нг х ч2)/мл 3610,34 1671,21

Cmax, нг/мЛ 15,61

Cl, мл/час 1,8 23,9

kel, Ч 0,15 0,11

Т1/2, Ч 4,53 6,28

MRT, ч 6,4 9,98

Тmаx, ч 4,0

Таблица 4

Фармакокинетические параметры меченного ФИТЦ ПЭГ-ИФН а-2Ь в сыворотке крови и тонком кишечнике крыс при пятикратном внутрижелудочном введении препарата в дозе 100 000 МЕ/кг (10 мкг/кг), полученные на основании усредненных значений концентраций

Показатель Сыворотка крови Тонкий кишечник

AUC, (нг х ч)/мл 250,89 71,02

AUMC, (нг х ч2)/мл 2483,67 537,94

Cl, мл/ч 15,90

Cmax, нг/мл 18,83 (нг/мл) 27,96

Тmax, Ч 4,0 0,5

тивности подавления репликации вируса Коксаки А7 (штамм ЖЭВ-8) исследуемым ПЭГ-ИФН a-2b в инфицированных клетках RD посредством количественного ОТ-ПЦР анализа в режиме реального времени представлены в табл. 2. Таким образом, исследование противовирусной активности ПЭГ-ИФН a-2b показало, что ЛС на основе ПЭГ-ИФН a-2b менее активен в сравнении с не иммобилизированным интерфероном a-2b (рчИФН a-2b). Эти данные хорошо согласуются с данными для пегилированных белков (цитоки-нов) на in vitro моделях [8].

Некоторые параметры фармакокинетики лекарственного препарата на основе иммоби-лизированного на полиэтиленгликоле интер-

фероне а-2Ь. Результаты расчета некоторых фар-макокинетических параметров меченного ФИТЦ ПЭГ-ИФН а-2Ь в сыворотке крови крыс, полученные на основании усредненных значений концентраций, после однократного внутривенного и внутрижелудочного введения препарата в дозе 100 000 МЕ/кг (10 мкг/кг), приведены в табл. 3.

Поскольку доза, вводимая крысам внутривенно и внутрижелудочно, была одинаковой, биодоступность рассчитывали как отношение искомых площадей под фармакокинетической кривой. Величина АиСв/в равнялась 564,11 (нг*ч)/мл, АиСв/с - 167,44 (нг*ч)/мл, таким образом, абсолютная биодоступность для меченого ПЭГ-ИФН а-2Ь составила 29,68 %.

Меченный ФИТЦ ПЭГ-ИФН а-2Ь вводили один раз в сутки в течение 5 дней в дозе 100 000 МЕ/кг (10 мкг/кг), результаты расчета фармакокинетических параметров препарата в сыворотке крови и тонком кишечнике крыс приведены в табл. 4.

заключение

Проведено изучение противовирусной активности и некоторых параметров фармакокинетики пероральной формы ПЭГ-ИФН а-2Ь, полученного с помощью технологии электронно-лучевого синтеза.

При исследовании противовирусной активности ЛС на основе иммобилизированного на по-лиэтиленгликоле с помощью электронно-лучевой технологии интерферона а-2Ь показано, что оно обладает специфической активностью, сравнимой с исходным не иммобилизированным ИФН а-2Ь (производство ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологии», Новосибирск).

Абсолютная биодоступность ЛС ПЭГ-ИФН а-2Ь при однократном внутрижелудочном введении в дозе 100 000 МЕ/кг составила 29,68 %. После пятикратного применения исследуемого препарата в суточной дозе 100 000 МЕ/кг площадь под кривой была увеличена на 49,8 % по сравнению с однократным введением ПЭГ-ИФН а-2Ь в аналогичной дозе. При пятикратном внутрижелудочном введении ПЭГ-ИФН а-2Ь препарат обнаруживается в ткани тонкого кишечника в достаточно высокой концентрации (Стах 27,96 нг/г).

Высокая биодоступность при пероральном приеме и транспорт пегилированного с помощью электронно-лучевой технологии интерферона а-2Ь в кровоток позволяет рассчитывать на его клиническую эффективность в отношении энте-ровирусной инфекции. Также следует отметить, что создание пероральных лекарственных препаратов на основе пегилированных интерферонов выглядит перспективно не только для лечения энтеровирусной инфекции, а также с позиции создания новой фармакологической технологии лечения вирусных заболеваний пищеварительной системы. Ожидаемая медико-социальная и экономическая эффективность от внедрения модификации интерферонов с помощью технологии

электронно-лучевого синтеза изменяет парадигму лечения вирусных инфекций с точки зрения сочетания эффективности и безопасности по сравнению с представленными на современном фармацевтическом рынке препаратами.

благодарности

Данная работа проведена в рамках исполнения Государственного контракта от 14 мая 2012 г. № 16.N08.12.1017, ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» (шифр темы проекта «2012-2.5-16-N08-0001-001»).

список литературы

1. Дингл Дж. Лизосомы. Методы исследования. М.: Мир, 1980. 342 с.

2. Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А., Каркищенко В.Н. Фармакокинетика. Ростов-на-Дону: Феникс, 2001. 383 с.

3. Мадонов П.Г., Ершов К.И., Дубровин А.В. и др. Электронно-лучевая модификация препаратов белковой природы для улучшения их фармакологических свойств // Мед. и образ. в Сибири. 2013. (4). Режим доступа: http://ngmu.ru/cozo/mos/article/ text_full.php?id=1115 (дата обращения: 13.02.2017).

4. Пат. 2554761 РФ. Противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство / А.В. Артамонов, А.А. Бекарев, Н.В. Балданов и др. Опубл. 13.05.2014.

5. Пиотровский В.К. Метод статистических моментов и интегральные модельно-независимые параметры фармакокинетики // Фармакология и токсикология. 1986. (5). 118-125.

6. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / Общ. ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.

7. Lu J., Yi L., Zhao J., Yu J. et al. Enterovirus 71 disrupts interferon signaling by reducing the level of interferon receptor 1 // J. Virol. 2012. 86. (7). 37673776.

8. Veronese F.M., Pasut G. Protein PEGylation // Long Acting Injections and Implants / Eds. J.C. Wright, D.J. Burgess. N.Y.; Dordrecht; Heidelberg; L.: Springer, 2012.295-314.

experimental substantiation of application of pegylated interferon a-2b oral formulation for therapy of enteroviral infection

Dmitriy Nikolaevich KINSHT1-2, Pavel Gennad'evich MADONOV12,

Victor Alexandrovich SVYATCHENKO3, Vladimir Alexadrovich TERNOVOY3

1 Novosibirsk State Medical University of Minzdrav of Russia 630091, Novosibirsk, Krasny av., 52

2 Siberian Center of Pharmacology and Biotechnology 630090, Novosibirsk, AcademikLavrentiev av., 10

3 State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector» 630559, Novosibirsk region, settlement Koltsovo

The purpose of the work is the study of the antiviral activity and some pharmacokinetic parameters of oral formulation of pegylated interferon a-2b (PEG-IFN a-2b) obtained by technology of electron-beam synthesis. Material and Methods. The antiviral activity of PEG-IFN a-2b against Coxsackie virus was studied in RD cells culture. To study the pharmacokinetics we used FITC-labeled PEG-IFN a-2b. Results and Discussion. PEG-IFN a-2b has a specific activity comparable to the original interferon. Bioavailability of PEG-IFN a-2b is 29.68% in intragastric administration. The drug is detected in the intestinal tissue in a sufficiently high concentration.

Key words: interferon a-2b, enteroviral infection, pegylation, nanotechnology, immobilization, immobilized interferon a-2b.

Kinsht D.N. - candidate of medical sciences, associate professor of the chair for pharmacology, clinical pharmacology and evidentiary medicine, e-mail: [email protected]

Madonov P.G. - doctor of medical sciences, professor, head of the chair for pharmacology, clinical pharmacology and evidentiary medicine

Svyatchenko V.A. - candidate of biological sciences, head of the laboratory of flaviviruses virology Ternovoy V^. - candidate of biological sciences, head of laboratory of molecular epidemiology especially dangerous infections