CC BY
29
Изучение структуры и иммуноадъювантной активности глюкана «АДВА»
Е. А. Генералов
Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, физический факультет, кафедра биофизики. Россия, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 2.
E-mail: generals1179@gmail.com
Статья поступила 14.06.2013, подписана в печать 09.09.2013.
Получены экспериментальные данные, подтверждающие возможность применения полисахаридов в качестве адъювантов. Изучены иммуноадъювантные свойства полисахарида «АДВА» при совместном использовании с антигенами различной структуры и химической природы — эритроцитами барана, полисахаридным антигеном менингококка, белковым экзотоксином возбудителя столбняка, гемагглютинином вируса гриппа. Охарактеризована структура полисахарида «АДВА» методами ИК-спектроскопии и ГЖХ, показана его нетоксичность. Обсуждается возможность применения «АДВА» в качестве иммуноадъюванта.
Ключевые слова: иммуноадъювантная активность, «АДВА», глюкан, углеводы, полисахариды.
УДК: 571.27, 577.29. PACS: 87.15.-v, 87.14.-g.
Введение
Адъюванты (АД) — вещества, усиливающие иммунный ответ против совместно вводимых антигенов (АГ). Слово «адъювант» происходит от латинского глагола аф'иуаге, который означает «помогать» или «усиливать» [1]. Разработка эффективных АД для вакцин, обеспечивающих формирование выраженного и длительно сохраняющегося иммунитета на системном уровне или только в месте введения АГ (например, слизистых оболочек), остается одной из сложнейших задач в производстве вакцин. АД применяются в вакцинах для усиления иммунного ответа уже более 80 лет, и на их протяжении соли алюминия были практически единственными адъювантами, одобренными для использования у человека. Адъювантная активность соединений алюминия была впервые продемонстрирована в 1926 г. на примере дифтерийного анатоксина, адсорбированного на гидроксиде алюминия [2], что позволило значительно снизить дозы антигенов при иммунизации и увеличить тем самым безопасность вакцины. С тех пор гидроксид алюминия и фосфат алюминия широко применяются при создании вакцин, используемых для иммунизации людей [3]. Однако сегодня назрела необходимость в разработке нового поколения АД, создаваемых на основе последних достижений в области иммунологии. Соединения для адъ-юванта должны сочетать в себе способность повышения эффективности вакцин с максимальной переносимостью и безопасностью. При некоторых инфекционных болезнях, таких как, например, малярия, необходимо, чтобы вакцина индуцировала как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. Другая ситуация — это иммунологическое старение. С возрастом, когда иммунная система ослабевает или если она компрометирована, адъювантные вакцины позволяют преодолеть ослабление иммунитета за счет более сильной специфической стимуляции. И, наконец, еще один положительный эффект повышения эффективности вакцин при использовании новых АД — это возможность уменьшения количества АГ на дозу вакцины. Это оказалось трудной задачей для многих соединений. Тем не менее появились вещества на основе углеводов
в качестве перспективных кандидатов для адъювантов. Углеводы являются легкобиоразлагаемыми веществами и поэтому безопасны и хорошо переносимы. Углеводные соединения не депонируются в тканях, поэтому не происходит хронической иммунной активации. Полисахариды играют важную сигнальную роль в функционировании иммунной системы. Из охарактеризованных полисахаридов глюканы достаточно хорошо изучены. Глюканами являются полисахариды, выделенные из растений или микроорганизмов, состоят из повторяющихся Э-глюкозных единиц, соединенных гликозид-ными связями в различных альтернативных конфор-мациях: а -глюкан включают декстран (а -1,6-глюкан), гликоген (а-1,4- и а-1,6-глюкан), пуллулан (а-1,4-и а -1,6-глюкан) и крахмал (а -1,4- и а -1,6-глюкан); в-глюкан включают целлюлозу (в -1,4-глюкан), курд-лан (в-1,3-глюкан), ламинарин (в-1,3 - и в-1,6-глю-кан), еЬгу8о1аштапп (в-1,3-глюкан), лентинан (очищенный в-1,6 и в-1,3-глюкан из Бёоёез ЬепИпиз), НеЬешп (в-1,3-и в-1,4-глюкан), р1еигап (в-1,3- и в -1,6-глюкан изолированы от Р1еигоШ8 Оз^еаШз) и зимозан (в-1,3-глюкан из БаееЬагошуеез). Глюканы повышают как гуморальный, так и клеточный иммунитет и проявляют адъювантную активность, связываясь со специфическими рецепторами, которые экспрессируют-ся на моноцитах и других антиген-презентирующих клетках, что приводит к активации ЫР-кБ каскада, созреванию моноцитов и продукции провоспалительных цитокинов. Каждый тип глюкана может быть разного качества и чистоты, содержать смеси различных структур полимерной цепи с различными конформаци-онными разветвлениями и длиной полимерной цепи, а также примеси белков клеточной стенки. Структурные различия или наличие загрязняющих веществ в препаратах глюканов могут влиять на их адъювант-ную активность, что влечет за собой необходимость физико-химической и структурной характеристики. Им-мунологически активные углеводсодержащие соединения уникальны по своим физико-химическим и биологическим свойствам, что предоставляет широкий выбор возможностей для дизайна вакцин. В литературе описана адъювантная активность глюканов. Диэтиламино-
этил-декстран (DEAE-декстран) (а-1,6, а-1,3-глюкан), поликатионное производное декстрана, был испытан в качестве ветеринарного адъюванта. DEAE-декстран повышал первичный иммунный ответ макак-резусов к инактивированному формалином вирусу венесуэльского энцефаломиелита лошадей с уменьшением времени синтеза IgG [4]. Также было показано, что зимо-зан (в-1,3-глюкан) повышал гуморальный и клеточный иммунные ответы на ДНК-вакцинацию у мышей [5]. в-Глюкан, полученный из водорослей экстрагирован из адаптированного штамма Euglena (SRI штамм D86-G), выращенных гетеротрофно в темноте, повышал гуморальный и клеточный иммунитет при совместном введении пептидных антигенов [6]. У мышей иммунизация гликобелком D вируса герпеса (gD2) совместно со 100 мкг глюкана водорослей приводила к продукции анти-gD2-антител и значительно повышала популяцию Т-клеток, которые сохранялись дольше, чем у контрольных животных. Ковалентная конъюгация в-глюкана водорослей непосредственно с gD2-антигеном приводила к получению еще более высоких титров антител, что достигается с помощью простой смеси gD2-антигена и в -глюкана [6]. в-глюкан водорослей нетоксичен при внутривенном введении в дозах до 25 мг/кг массы тела.
Целью вакцинации является создание у человека эффективного иммунитета, обеспечивающего длительную защиту от инфекций. Большинство современных вакцин разрабатывается на основе определенных АГ. АГ микроорганизмов, опухолевых клеток или аллергенов вводятся в организм человека в виде очищенных белков. Такие «молекулярные вакцины», как правило, обладают слабой иммуногенностью, и для усиления иммунного ответа со стороны иммунной системы человека к ним необходимо добавлять адъюванты [7, 8].
Настоящаяая работа посвящена изучению адъювант-ной активности природного глюкана «АДВА» и некоторых его структурных характеристик.
1. Методы исследования 1.1. Инфракрасная спектроскопия субстанции «АДВА»
ИК-спектры полисахаридов регистрировались на спектрометре с фурье-преобразованием FTIR IRAffi-nity-1, «Shimadzu» (Япония) методом ATR (ATR-при-ставка MIRacle (ZnSe/Diamond)), в таблетках KBr, с разрешением 4см-1. Разложение контура полос в спектре делали с использованием пакета ACDLabs/Spectrus Processor после стандартной процедуры ATR коррекции базовой линии. Спектры регистрировались в диапазоне от 4000 до 400 см-1.
1.2. Спектрофотометрическое определение уроновых
кислот в полисахаридах по реакции с 3,5-диметилфенолом и концентрированной серной кислотой
Содержание уроновых кислот в образах «АДВА» проводили, используя метод разработанный А. И. Усовым [9].
К 0.5 мл гидролизата, приготовленного для ГЖХ, добавляли 0.5 мл 20%-го раствора борной кислоты и затем 4 мл концентрированной серной кислоты. После нагревания при 70° C в течение 40 мин прибавляли
0.1 мл раствора 3,5-диметилфенола. Оптическую плотность измеряли при двух длинах волн — 400 и 450 нм. В качестве стандарта использовали галактуроновую кислоту.
1.3. Определение белка в образцах «АДВА»
К 0.4 мл исследуемого раствора, содержащего 10-100 мкг белка, приливали 2 мл рабочего раствора, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 10 мин. Затем добавляли 0.2 мл реактива Фолина-Чокальтеу, содержимое пробирок тщательно перемешивали и через 30-90 мин колориметрировали при 750 нм. Содержание белка рассчитывали по калибровочному графику [10].
1.4. Анализ моносахаридов
Гидролиз полисахарида проводили 2М-трифторук-сусной кислотой с последующим восстановлением моносахаридов до соответствующих ацетатов полиолов, как описано в [11, 12]. Конечные ацетаты поли-олов анализировали на хроматографе Hewlett-Packard 5890А (USA) с пламенно-ионизационным детектором, капиллярной колонкой Ultra 2 (Crosslinked 5% Ph Me Silicon 25 м x 0.2 мм x 0.33 м), и интегратором НР 3393 A в режиме программирования температуры от 175 до 290° C со скоростью 10° C/мин. Исследуемые образцы анализировали параллельно со стандартными образцами, содержащими глюкозу, арабинозу, галактозу или любой другой сахар. В качестве внутреннего стандарта использовали миоинозитол.
1.5. Оценка биологической активности полисахарида «АДВА»
В экспериментах были использованы половозрелые самцы мышей-гибридов (CBAxC57BL6)F 1 из питомника «Столбовая» ГУ НЦ БМТ РАМН.
Иммуноадъювантную активность определяли по влиянию полисахарида «АДВА» на синтез антител к эритроцитам барана, полисахаридному антигену менингококка, белковому экзотоксину возбудителя столбняка и гемагглютининам вируса гриппа.
Для определения титра сывороточных антител (IgG) к эритроцитам барана использовали реакцию прямой гемагглютинации с эритроцитами барана [13]. Исследуемые сыворотки разводили двукратно на забуференном физиологическом растворе, содержащем 0.1% бычьего сывороточного альбумина. Использовали 1%-е форма-линизированные эритроциты барана. Доза антигена на одно животное — 0.6 •107 эритроцитов. Все реакции ставили в двух повторах.
Для определения титра сывороточных антител к по-лисахаридному антигену менингококка, белковому экзотоксину возбудителя столбняка, гемагглютининам вируса гриппа использовали стандартные антигенные диагностикумы. Антитела в реакции гемагглютинации определяли с помощью диагностикума эритроцитарно-го менингококкового полисахаридного (ВГУП «НПО Микроген», МЗ РФ, Москва) и диагностикума эрит-роцитарного столбнячного антигенного жидкого (ОАО «Биомед» им. И. И. Мечникова, Московская обл.).
Антитела в реакции торможения гемагглютинации определяли с помощью гриппозного диагностикума HiNi и H3N2 (ООО по производству диагностических препаратов, С.-Петербург). Эксперименты ставили в трех повторах.
В качестве стандартных антигенов были использованы:
1) эритроциты барана;
2) полисахаридный антиген — стандартная менин-гококковая полисахаридная вакцина (производитель — ВГУП «НПО Микроген», МЗ РФ, Москва) [14, 15];
3) протеиновый антиген — столбнячный анатоксин в составе АДС (производитель — ОАО «Биомед» им. И. И. Мечникова, Московская обл.) [14, 15];
4) комплексный антиген (гликопротеины — гемаг-глютинин, нейраминидаза и липопротеины суперкап-сида вируса гриппа) — живая гриппозная вакцина «Гриппол» субтипы H1N1/H3N2/B (производитель — НПО «Петровакс Фарм», Москва) [14].
За титр реакции принимали максимальное разведение сыворотки, при котором еще наблюдался положительный результат.
Вакцинация стандартными вакцинами проводилась путем пересчета вакцинной дозы для человека на 1 кг веса мыши с использованием поправочного коэффициента [13].
Матричные растворы «АДВА» готовили, предварительно растворяя 1 мг вещества в 1 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида, и стерилизовали фильтрованием сквозь одноразовые фильтры «Millex» (Millipore) с диаметром пор 0.2 мкм. Приготовленные растворы «АДВА» вводили в хвостовую вену подопытных животных одновременно с введением антигена. Контролем служили иммунизированные антигенами животные без введения исследуемой субстанции (в качестве плацебо использовали стерильный физиологический раствор).
Для изучения специфической фармакологической активности «АДВА» использовали эквитерапевтиче-ские дозы (ЭТД) субстанции для крыс при пересчете с учетом поверхности тела:
сут ЭТД = 0.0014 мг/кг х 39/6.5 = 0.0084 мг/кг,
сут 10 ЭТД = 0.0084 мг/кг х 10 = 0.084 мг/кг,
сут 40 ЭТД= 0.0084 мг/кг х 40 = 0.36 мг/кг.
Коэффициенты пересчета доз (мг/кг на мг/м2) составили для крысы 6.5 и для человека 39 в зависимости от веса тела [16].
Кровь для исследования брали из подъязычной вены крысы в объеме 1.0-1.5 мл на 8-й день после иммунизации. Забор крови осуществлялся после 14-15-часового голодания в одинаковое время суток. Для получения сыворотки кровь центрифугировали при 1000g 15 мин.
Для всех количественных данных вычисляли групповое среднее арифметическое (М), стандартную ошибку среднего (SEM). Полученные результаты были обработаны на IBM PC/AT с помощью пакетов прикладных программ Statistica 5.5. Вероятность различий показателей средних в группах определяли с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости p < 0.05.
1.6. Определение эндотоксина
Для определения присутствия в образцах «АДВА» липополисахаридов (ЛПС) использовали ЛАЛ-тест (лизат амебоцитов). 0.1 мл образца «АДВА» (5 мг/мл), стандартный образец или вода без эндотоксина смешивались с 0.1 мл ЛАЛ, инкубировали 1 час при 37 ° С до формирования геля.
1.7. Изучение токсичности «АДВА»
Изучение острой токсичности «АДВА» проводили в соответствии с методическими рекомендациями по экспериментальному изучению новых лекарственных средств Фармакологического комитета Минздрава РФ. ЛД50 рассчитывали по методу Миллера и Тейнтера. Препарат «АДВА» в различных дозировках вводили однократно подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно и внутривенно.
2. Результаты и обсуждение
Ранее был выделен растительный полисахарид «АДВА» и изучены его химические свойства [17]. «АДВА» имеет молекулярную массу в интервале 20 • 103 — 30 • 104 Да. Плохо растворим в воде, но хорошо растворим в солевых растворителях; практически нерастворим в органических растворителях, таких как эфир, хлороформ, ацетон, спирт, диметилсульфок-сид. Обработка в-(1-3)- и в-(1-4)-гликозилгидролаза-ми и а-амилазой показала, что полисахарид «АДВА» практически не содержит а-связей, преимущественно в-(1-4)-глюкозидные связи.
Была проведена работа по изучению спектральных характеристик полисахарида «АДВА». ИК-спектр представлен на рисунке.
В ИК-спектре «АДВА» отмечаются полосы поглощения: 3338 см-1 (ОН-); 2922, 2853 см-1 (С-Н-); 2361, 2342 см-1 (=Ы + Н- , = ЫН +, = ЫН +2); 1651, 1645 см-1 (С = С, кристаллизационная вода) 1028, 1076, 1150 см-1 (С-О, С-О-С, кольцевые колебания пиранозного цикла); в области 895 см-1 колебание характеризует в-конфигурацию гликозидной связи [18].
ИК-спектр «АДВА» показал характерные для поли-сахаридных структур полосы поглощения [19-21].
Было проведено определение моносахаридного состава, уроновых кислот и белка, входящих в состав полисахарида «АДВА» (табл. 1). Белок не был обнаружен в образцах «АДВА».
Иммуноадъювантную активность полисахарида «АДВА» определяли по влиянию на синтез антител к эритроцитам барана, полисахаридному антигену менингококка, белковому экзотоксину возбудителя столбняка, гемагглютининам вируса гриппа.
В табл. 2 представлены титры антител в реакции прямой гемагглютинации, образующихся при иммунизации мышей (СБА х С57Б16)Р 1 эритроцитами барана и «АДВА».
Введение субстанции «АДВА» приводило к увеличению титра специфических антител к эритроцитам барана в 2.82 раза (доза 0.0084 мг/кг); в 4.05 раза (доза 0.084 мг/кг) и в 4.78 раза (доза 0.336 мг/кг).
В табл. 3 представлены титры антител, образующихся в реакции гемагглютинации при иммунизации
: §
................................................................................................................................
ю о о
о о о
ю
ОТ О)
о
о О) от о
ю 00 О!
о
о со от о
ю
ОТ
о
о от о
ю
ЕО О!
о
о со от о
ю л от о
о 1Л О)
о
ю ч
О)
о
Интенсивность 04. СЛ. оч. сл. оч. сл. оч. сл. оч. сл. оч. сл. оч. сл. оч. сл. оч. сл. оч. сл. оч. сл. о. и о. и о. и
1- со О! от ОТ а> ОТ О) О) О) со от о> со от от ^ от от от от от от со от от от от со от от со со от ю от со от
о о о о о о о о о о о о о о
О) СП от ч- со ю со со см о со со от со ю со см
и со со о см С\| о см ю СМ с» см см ч N со ю см ^ см со N о см см см от со см см см см со см о со со см см ю со см
он ю со ю О) ю о (О Т— со см со со со ю со со со г^ со со со от со о
.0 ±с Що 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
и т о у о у о у о у о у о у о у о у о у о у о у о у о у о
1- ОТ от от ОТ О) О) от О) О) от от от со от от со от от от от со от от со от от со от от от от от от от от от от
о о о о о о о о о о о о о о
5 и ю О) см о ?) со о со ч со от от со от со ч- ю ч- о ч ю - о ч- со ч
со ч со Т— О) со со со со со со см от со со от т- ю от со от о со от Т— о от от ч-о о см о см от см о см со ч-о см со о см
О г го ч ч- ч- ю ч- (О ч- ч со ч- от ч- о ю ю см 1Л со Ю 3 ю 1Л со ю
Интенсивность 5 5 а. и а и о. и а и сл. 5 сл. оч. сл. | оч. сл. | оч. сл. | оч. сл. | оч. сл. |
1- от от о со от от от от от со от со от от со от от со от от от от от от от от о о о о о о от от от
о о о о о о о о о о о т_ о
со со см 1-о со со ч- ю со со о ю со ^ со ю со со со см
Е и со со ю ю ю ю со со 1Л ч- со ¡о со со ю со 1Л от со со р см со г^ о от о со ч-см со со со со
& от см о со со см со со со ч- со ю со со со г», со со со от со о ч- ¥ см ч
■О
тП я
«о
и и и и 0 и 0 0 и У и 0 и 0
о
и
о о го со СТ) го со от го ч см со со
(7) О) СП со СП со со СП СП от от СП со со
1- от от от от от го го от го го от го го го
о о о о о о о о о о о о о о
ем о ч- см со со СП ч со см ч- о СП
ю со со ю от со о см ч сб см ч
£ от со ч— со ч го ю со со го со
ю со со от о со ю СО о ем со ю
см со со со со ч- ч ч ч- ч- ю ю ю ю
* * * * * * * * * * * * * *
о ю со N. со О) о см СО ч- 1Л со N. со
* 1 * см см ем см см см см см см
Интенсивность 5 5 у о оч.сл. | оч.сл. | 5 т □ оч.сл. | 5 т □ оч.сл. | 5 т □ оч.сл. | 5 т о оч. б. | о. и
н ю от от со го го со го го ю от от со от го ю го го со го го от от о о о от от от от от от от ч-го ю го о со го
о о о о о о о о о о о о о
ТЕ и со со го СО о со со со со со со - от со о со см ю
со £ СП см со со ч-со со со ч го со со ю со со ч-со со ч от со см о о ч
£ - см со ч ю со СП от о - см со ч
ИК-спектр «АДВА».
Сокращения: оч. сл. — очень слабая, сл. — слабая, ср. — средняя, б. — большая, оч. б. — очень большая
Таблица 1
Моносахариды и уроновые кислоты, входящие в состав полисахарида «АДВА»
Навеска, мг ТФУ к-та в 1 мл 0.553 мг инозита Glc, мг Gal, мг Ar, мг % сахаров % уроновых кислот
2.79 2 (1.106) 1.86 0.0875 0.044 71 5.7
Таблица 2
Титры антител у мышей (CBA х C57Bl6)F^ при иммунизации эритроцитами барана и «АДВА» (реакция прямой гемагглютинации)
Титр реакции, n = 10
Контроль На фоне введения субстанции «АДВА»
0.0084 мг/кг 0.084 мг/кг 0.336 мг/кг
1:30 1:40 1:70 1:90
1:10 1:30 1:60 1:80
1:20 1:60 1:80 1:90
1:20 1:50 1:70 1:90
1:20 1:70 1:90 1:100
1:20 1:60 1:80 1:100
1:20 1:60 1:70 1:90
1:10 1:40 1:80 1:90
1:20 1:70 1:90 1:100
1:20 1:60 1:80 1:80
M±SD 1:19.00±5.67 1:54.0± 13.49 1:77.00±9.48 1:91.00±7.37
Таблица 3
Титры антител у мышей (CBA х C57Bl6)F^ при иммунизации менингококковой полисахаридной вакциной и «АДВА» (реакция гемагглютинации)
Титр реакции, n = 10
Контроль На фоне введения субстанции «АДВА»
0.0084 мг/кг 0.084 мг/кг 0.336 мг/кг
1:10 1:40 1:40 1:60
1:10 1:30 1:30 1:60
1:10 1:60 1:50 1:70
1:10 1:50 1:40 1:60
1:10 1:70 1:30 1:70
1:20 1:60 1:40 1:60
1:10 1:60 1:40 1:70
1:20 1:40 1:40 1:60
1:10 1:70 1:50 1:60
1:20 1:60 1:40 1:60
M ± SD 1:13.0±4.8 1:25.0±5.2 1:40.00±6.61 1:63.00±4.83
мышей (СБА х С57Б16)Р1 менингококковой полисаха-ридной вакциной и субстанцией «АДВА».
Из представленных данных видно, что введение субстанции «АДВА» приводило к увеличению титра специфических антител в сыворотках мышей, иммунизированных менингококковой вакциной, в 1.92 раза
(доза 0.0084 мг/кг); в 3.07 раза (доза 0.084 мг/кг) и в 4.8 раза (доза 0.336 мг/кг).
Результаты влияния субстанции «АДВА» на титр антител, образующихся при вакцинации мышей (CBA х C57Bl6)F1 столбнячным анатоксином, представлены в табл. 4.
Таблица 4
Влияние субстанции «АДВА» на титр антител, образующихся при вакцинации мышей (CBA х C57Bl6)F^ столбнячным анатоксином в составе АДС
Титр реакции, n = 10
Контроль На фоне введения субстанции «АДВА»
0.0084 мг/кг 0.084 мг/кг 0.336 мг/кг
1:20 1:180 1:200 1:240
1:30 1:240 1:300 1:320
1:20 1:200 1:320 1:340
1:20 1:160 1:220 1:300
1:20 1:240 1:280 1:340
1:30 1:200 1:240 1:340
1:20 1:200 1:320 1:360
1:20 1:180 1:220 1:320
1:40 1:260 1:280 1:300
1:20 1:160 1:240 1:340
M±SD 1:24.00±6.99 1:202.0±34.5 1:262.0±43.6 1:320.0±33.9
Таким образом, введение субстанции «АДВА» приводило к значительному увеличению титра реакции гемагглютинации с сыворотками мышей, иммунизированных белковой вакциной — столбнячным анатоксином, т. е. к увеличению способности образовывать специфические антитела: в эквитерапевтической дозе — в 8.41 раза; в дозе в 10 раз большей, чем эквитерапев-тическая, — в 10.9 раза; в дозе в 40 раз большей, чем эквитерапевтическая, — в 13.3 раза.
Результаты влияния субстанции «АДВА» на титр антител, образующихся при вакцинации мышей (СБА х С57Б16)Р1 гриппозной вакциной, представлены в табл. 5.
Внутривенное однократное введение субстанции «АДВА» приводило к увеличению титра реакции аг-глютинации/гемагглютинации с сыворотками мышей, иммунизированных гликопротеиновой вакциной (гемаг-глютинины вируса гриппа), т. е. к увеличению способности образовывать специфические антитела: в экви-терапевтической дозе — в 2.9 раза; в дозе в 10 раз большей, чем эквитерапевтическая, — в 4.51 раза; в дозе в 40 раз большей, чем эквитерапевтическая, — в 5.8 раза.
Таблица 5
Влияние субстанции «АДВА» на титр антител, образующихся при вакцинации мышей (CBA х C57Bl6)Fl гриппозной вакциной
Титр реакции, п = 6
Контроль На фоне введения субстанции «АДВА»
0.0084 мг/кг 0.084 мг/кг 0.336 мг/кг
ад 1:20 1:50 1:80 1:240
И3Ы2 1:20 1:60 1:80 1:320
ад 1:20 1:40 1:60 1:340
Н3Н2 1:20 1:50 1:80 1:300
ад 1:20 1:60 1:70 1:340
Н3Ы2 1:10 1:60 1:80 1:340
ад 1:30 1:60 1:80 1:360
Н3Ы2 1:20 1:60 1:70 1:320
ад 1:20 1:60 1:80
Н3Ы2 1:20 1:60 1:100 1:300
1:10 1:50 1:100
Н3Ы2 1:10 1:50 1:100 1:340
М ± БЭ ^N1 1 : 20.0 ± 6.3 1 : 51.60 ± 7.52 1 : 78.3 ± 13.3 1 : 101.0 ± 14.7
Н3Ы2 1 : 16.60 ± 5.16 1 : 55.00 ± 8.36 1 : 85.00 ± 12.24 1 : 111.6 ± 19.4
Таким образом, титр реакции агглютина-ции/гемагглютинации с сыворотками мышей, иммунизированных стандартными антигенами, на фоне введения субстанции «АДВА» увеличивался во всех сериях. Увеличение титра реакции свидетельствовало о повышении способности образовывать специфические антитела, т. е. о наличии у субстанции иммуноадъ-ювантных свойств. Выраженность иммуноадъювантных свойств зависела от применяемой дозы субстанции «АДВА».
При введении минимальной дозы субстанции «АДВА» как иммуноадъюванта наиболее сильный иммунный ответ (т. е. более чем в 4 раза) у мышей наблюдался к белковому антигену (столбнячный анатоксин), наименьший (увеличение титра в 2 раза) — к полиса-харидному (менингококковая полисахаридная вакцина) антигену, что соответствует представлениям о степени иммуногенности данных разновидностей химических веществ [22]. Таким образом, субстанция «АДВА», раствор для внутривенных инъекций, обладает имму-ноадъювантными свойствами, наиболее выраженными в отношении белкового антигена.
Поскольку ЛПС грамотрицательных бактерий очень часто являются примесью в образцах соединений, выделяемых из биологических материалов, и стимуляторами иммунной системы, был проведен анализ образцов «АДВА» в ЛАЛ-тесте. Было показано отсутствие контаминации ЛПС.
Токсичность «АДВА» исследовали на мышах в интервале доз от 10 до 5000 мг/кг. «АДВА» при парэн-теральных способах введения (подкожный, внутримышечный, внутривенный) малотоксичен в острых опытах на животных (по данным параметров количественной токсичности). Максимально переносимая доза для под-
кожного введения (МПД (ЛД10)) препарата составила 2650 мг/кг, средняя летальная доза (ЛД50) — 3480 ± 205 мг/кг. При этом не обнаружено зависимости токсичности препарата от половой и линейной принадлежности мышей.
Эти эксперименты продемонстрировали низкую токсичность полисахарида «АДВА».
Заключение
«АДВА» имеет молекулярную массу в интервале 20 • 103 — 30 • 104 Да. Плохо растворим в воде, но хорошо растворим в солевых растворителях; практически нерастворим в органических растворителях, таких как эфир, хлороформ, ацетон, спирт, диметилсульфоксид, практически не содержит а-связей, содержит преимущественно в-(1-4)-глюкозидные связи. Методами ГЖХ и ИК-спектроскопии определено, что глюкан состоит из глюкозы (не более 85%), арабинозы и галактозы (в следовых количествах), уроновых кислот (не более 15%).
Основной неразрешенной проблемой вакцинных штаммов остается сочетание безопасности и эффективности. Однако известный факт снижения иммуноген-ности антигена в зависимости от степени его чистоты ставит новую проблему — проблему оптимального адъ-юванта. «АДВА» не обладает сильностимулирующим воздействием на лимфоретикулярную ткань, не угнетает клеточный иммунитет, нетоксичен даже при высоких превышениях ЭТД, стимулирует гуморальный иммунитет к различного рода антигенам, но не вызывает реакции гиперчувствительности, не вызывает активный синтез специфических к его структуре антител и имеет высокую скорость биодеградации, что делает его безопасным и эффективным. Экспериментальные данные
позволяют сделать вывод, что «АДВА» пригоден для использования в качестве иммуноадъюванта.
Работа выполнена при технической и материальной поддержке лаборатории Polylab Ltd. Pte. (Science Park 2, Сингапур).
Список литературы
1. Vogel F.R. // Dev. Biol. Stand. 1998. 92. P. 241.
2. Glenny A.T., Pope C.G., Waddington H., Wallace V. // J. Path. Bact. 1926. 29. P. 38.
3. Vogel F.R., Powell M.F. // Vaccine Design: the Subunit and Adjuvant Approach. N.Y., 1995. P. 234.
4. Houston W.E., Crabbs C.L., Kremer R.J., Springer J.W. // Infect. Immun. 1976. 13, N 6. P. 1559.
5. Ara Y., Saito T., Takagi T. et al. // Immunology. 2001. 103, N 1. Р. 98.
6. Mohagheghpour N., Dawson M., Hobbs P. et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1995. 383. Р. 13.
7. Schijns V. // Curr. Opin. Immunol. 2000. 12. P. 456.
8. Usov A.I., Bilan M.I., Klochkova N.G. // Botanica Marina. 1995. 38. Р. 43.
9. Vogel F.R. // Clin. Infect. Dis. 2000. 30, N 3. Р. 266.
10. Северин С.Е. Практикум по биохимии. М., 1989.
11. Albersheim P. // Methods Enzimol. 1987. 118. Р. 3.
12. Хорлин А.Я. Методы исследования углеводов. М., 1975.
13. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств. М., 2005.
14. Воробьева А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. М., 2004.
15. Медуницын Н.В. Вакцинология. М., 1999.
16. Freireich E.J., Gehan E.A., Rall D.P. et al. // Cancer Chemother. Rep. 1966. 50, N 4. Р. 219.
17. Чекановская Л.А. Новый растительный глюкан как им-муноадъювант. Патент № 2331433. 2004.
18. Gutierrez A., Prieto A., Martinez A.T. // Carbohydr. Res. 1996. 281. Р. 143.
19. Sekkal M., Dincq V., Legrand P., Huvenne J.P. //J. Mol. Struct. 1995. 349. Р. 349.
20. Kacurakova M., Wilson R.H. // Carbohydr. Pol. 2001. 44. Р. 291.
21. Proniewicz L.M., Paluszkiewicz C., Weselucha-Birzyn-ska A. et al. // J. Mol. Struct. 2001. 596. Р. 163.
22. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М., 2010.
Study of the structure and immunoenhancing activity of glucan «ADVA» E. A. Generalov
Department of Biophysics, Faculty of Physics, M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow 119991, Russia.
E-mail: generals1179@gmail.com.
Experimental data to support possibility of usage of polysaccharides as adjuvants were obtained. Immunoadjuvant activity of polysaccharide «ADVA» when used in conjunction with antigens of different structure and chemical nature: a sheep red blood cell, meningococcal polysaccharide antigen, tetanus exotoxin protein, hemagglutinin of influenza virus was studied. The structure of the polysaccharide «ADVA» was characterized by IR-spectroscopy and GC methods. It was shown that «ADVA» is non-toxic. The possibility of using «ADVA» as immunoadjuvant is discussed.
Keywords: immunoenhancing activity, «ADVA», glucan, carbohydrates, polysaccharides. PACS: 87.15.-v, 87.14.-g. Received 14 June 2013.
English version: Moscow University Physics Bulletin 6(2013). Сведения об авторе
Генералов Евгений Александрович — студент; тел.: (905) 730-50-73, e-mail: generals1179@gmail.com.
