CC BY
3
КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ
УДК 577.152.34:582.282.123.4
Изучение спектра активности новых штаммов микромицетов рода Aspergillus в отношении белков системы гемостаза
A.A. Осмоловский1, *©, A.A. Шестакова1, Д.Е. Суркова1'2, Р. Лехотска3, Е. Пецкова3
1 Кафедра микробиологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12; 2Факультет биологии и биотехнологии, Высшая школа экономики, Россия, 101100, г. Москва, ул. Мясницкая д. 20; 3Department of Microbiology, Slovak Medical University in Bratislava, 12 Limbova st., Bratislava, 83303, Slovakia
*e-mail: aosmol@mail.ru_
Изучен спектр активности внеклеточных протеаз в отношении белков системы гемостаза для пяти видов микромицетов рода Aspergillus. Показано отсутствие типов активности, подобных компонентам системы гемостаза — тромбину, плазмину, фактору Xa, урокиназе и протеину C — а также активаторной активности по отношению к предшественникам человеческих гемостатических протеаз для A. athecius, A. caespitosus, A. glaucus, A. tamarii и A. wentii. Для A. glaucus показано наличие протеаз, высокоактивных (58,52 Етир) и высокоспецифичных в отношении фибриногена, а для A. athecius, A. caespitosus и A. wentii — способность синтезировать протеазы, активные в кислых областях рН.
Ключевые слова: протеазы микромицетов, фибринолитические ферменты, тромболитические средства, активаторы белков гемостаза, хромогенные пептидные субстраты, аспергиллы
DOI: 10.55959/MSU0137-0952-16-78-2-7
Микромицеты рода Aspergillus известны как продуценты протеаз, активных в отношении разнообразных субстратов. Хорошо изучены фибринолитические протеазы, синтезируемые A. oryzae, A. terricola, A. kanagawaensis, A. ustus и многими другими видами [1—5] и перспективные как тромболитические препараты экстренного действия. Кроме того, для некоторых протеаз показана ак-тиваторная активность по отношению к белкам системы гемостаза, опосредующая непрямой фи-бринолиз: протеаза A. ochraceus способна активировать протеин C, протеаза A. terreus — прекалли-креин [6, 7]. Такие ферменты, несмотря на то что выявляются у продуцентов довольно редко [8], признаются перспективными агентами для диа-гностикумов, используемых при выявлении заболеваний системы гемостаза ввиду уникальности их протеолитического действия. Низкая стоимость культивирования, простота выделения и очистки, а также ограниченная субстратная специфичность секретируемых протеаз делают микромицеты рода Aspergillus перспективными продуцентами таких ферментов для биомедицины и фармацевтической промышленности.
В данной работе была исследована способность пяти представителей рода Aspergillus секре-тировать протеолитические ферменты с активностью в отношении белков системы гемостаза. Для данных видов изучение протеолитической активности проводилось впервые.
Материалы и методы
Объекты исследования. Объектами исследования были штаммы микромицетов А. МНваш, А. саезрЮш, А. glaucus, А. 1атаги и А. wвпШ из коллекции медицинского факультета Словацкого медицинского университета в г. Братислава. Поддержание штаммов осуществляли в пробирках на скошенном сусло-агаре. В качестве посевного материала использовали культуры, выращенные в течение 7 сут.
Глубинное культивирование микромицетов. Культивирование микромицетов проводили в глубинных условиях в шейкере-инкубаторе Б8-20/80 (ВюВап, Латвия) при 200 об./мин в качалочных колбах объемом 750 мл со 100 мл питательной среды при 28°С в течение 48 ч на среде, содержащей сусло, глюкозу и пептон [9]. Далее 3% (об./об.) посевного материала переносили в среду № 1 (в %: глюкоза — 3,0, глицерин — 7,0, гидролизат рыбной муки - 0,5, - 0,2, КН2Р04 - 0,05, М£804 -
0,05, рН 6,0) и среду № 2 (в %: крахмал - 1,0, глюкоза - 3,5, гидролизат рыбной муки - 0,5, пептон -0,5, М£804 - 0,05, КН2Р04 - 0,05, №С1 - 0,2, рН 6,0) и культивировали в течение 4 сут. После культивирования культуральную жидкость отделяли от мицелия фильтрованием и использовали для определения протеолитической активности.
Определение протеолитической активности с белковыми субстратами. Активность внеклеточ-
ных протеаз определяли с различными белковыми субстратами. Для определения общей протеолити-ческой активности использовали 0,2%-й раствор азоказеина (Merck, Германия), приготовленный на 0,1 М Трис-HCl буфере (рН 8,2) и на 0,1 М ацетатном буфере (рН 5,5). Для определения фибри-ногенолитической активности использовали 1%-й раствор фибриногена (Merck, Германия), приготовленный на 0,1 М Трис-HCl буфере (рН 8,2). Для определения гемоглобинолитической активности использовали 1%-ю суспензию гемоглобина (Merck, Германия), приготовленную на 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,7). Для определения протео-литической активности по отношению к кислым фибриллярным белкам использовали 0,2%-ю суспензию голубого фибрина (Calbiochem, Германия), приготовленную на 0,1 М ацетатном буфере (рН 5,5). Реакции проводили при постоянном перемешивании (600 об./мин) при 37°С в термошей-кере TS-100 (BioSan, Латвия). Для проведения реакции к 200 мкл субстрата добавляли 100 мкл культуральной жидкости. Для остановки реакции после 10 мин (для гемоглобина и фибриногена) или 30 мин (для азоказеина и голубого фибрина) инкубации добавляли 300 мкл 10%-й трихло-руксусной кислоты. Далее образцы центрифугировали в течение 10 мин при 14300 об./мин и в надосадочной жидкости измеряли оптическую плотность на спектрофотометре BioSpectrometer (Eppendorf, Германия). За единицу гемоглобино-и фибриногенолитической активности (Етир) принимали количество фермента, высвобождавшее 1 мкг тирозина за 1 мин в условиях проведения реакции.
За единицы общей протеолитической (Еазк) и фибринолитической (Егф) активности принимали количество фермента, которое вызывало изменение оптической плотности на 0,01 ед. в условиях проведения реакции.
Плазминоподобную и активаторную по отношению к плазминогену активность определяли по методу Аструпа—Мюллертца—Лансена с использованием фибриновых пластин [10]. Для приготовления пластины с фибрином 9 мл 0,47%-го раствора бычьего фибриногена (Merck, Германия) и 0,2 мл 0,4%-го раствора тромбина (приготовленных на 0,9%-м NaCl) смешивали и помещали в стеклянную чашку Петри для полимеризации. После часовой стабилизации одну пластину прогревали в течение 30 мин при 86°С для инактивации примеси плазминогена. Фибриновые пластины с нанесенными образцами (30 мкл) инкубировали при 37°С в течение 3 ч в термостате-инкубаторе Binder (Binder, Германия). После инкубации измеряли диаметры зон гидролиза на прогретых и непрогретых чашках. Для расчета ак-тиваторной по отношению к плазминогену активности диаметр зоны гидролиза на прогретой чашке вычитали из диаметра на непрогретой. За
единицу активности принимали количество фермента, формирующее зону гидролиза с площадью поверхности 1 мм2.
Определение протеолитической активности с хромогенными пептидными субстратами. Активность внеклеточных протеаз микромицетов по отношению к белкам плазмы крови человека определяли в реакциях с хромогенными пептидными субстратами: То8-01у-Рго-Лг£-рНЛ (СЬгошогуш™) и Н-Б-РИе-Р1р-Лг£-рНЛ (8-2238) - субстраты тромбина; Н-Б-Уа1-Ьеи-Ьуз-рНЛ (8-2251) -субстрат плазмина; /-Б-Л^-Иу-Л^-рНЛ (8-2765) и Б7-11е-О1и(0Я)-О1у-Лг£-рНЛ (8-2222) -субстраты Ха-фактора плазмы крови человека; 01р-01у-Лг£-рНЛ (8-2444) - субстрат урокиназы; Ир-Рго-Л^-рНЛ (8-2366) - субстрат протеина С. Реакции проводили при постоянном перемешивании (600 об./мин) при 37°С в термошейкере Т8-100 (Бю8аи, Латвия).
Для проведения реакции 200 мкл пробы добавляли к 50 мкл 0,05 М Трис-НС1 (рН 8,2) и 100 мкл 0,05%-го субстрата, приготовленного на том же буфере, через 5 мин инкубации реакцию останавливали 200 мкл 50%-й уксусной кислоты. Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм.
Активаторные активности по отношению к белкам плазмы крови человека определяли для образцов с низкой прямой активностью по описанному ранее методу [11]. За единицу активности (ЕрМЛ) в обоих случаях принимали количество мкмоль п-нитроанилина, отщепившегося от хро-могенного субстрата за 1 мин.
Результаты и их обсуждение
Протеолитическая активность использованных в работе штаммов микромицетов, определенная с белковыми субстратами, представлена в табл. 1.
Как видно из табл. 1, протеолитическую активность проявляли все штаммы аспергиллов, но наименьшие значения были установлены для ми-кромицета Л. glaucus, у которого единственная существенная активность наблюдалась в отношении фибриногена и достигала 58,52 Етир при культивировании на ферментационной среде № 1, что может свидетельствовать об узкой субстратной специфичности выделяемых этим продуцентом ферментов. Высокую фибриногенолитическую активность также показал Л. аЛвсш (105,46 Етир) при культивировании на среде № 2, что в сочетании с низкой общей протеолитической активностью (18,95 Еазк) также может указывать на узкую субстратную специфичность протеаз этого продуцента. Л. аШваш, кроме того, оказался способен секретировать протеазы, активные в кислой области рН и специфично расщепляющие глобулярные, но не фибриллярные белки. Наибольшую гемоглобинолитическую активность показали
Л. caвspitosus и Л. шпШ (292,60 и 127,14 Етир соответственно), что уменьшает вероятность применения выделяемых ими ферментов в биомедицине и фармацевтике, но может быть использовано в промышленности. Фибринолитическая активность, определенная с голубым фибрином при рН 5,5, для всех штаммов не превосходила 10,1 Егф, что говорит о неспособности исследуемых микромицетов образовывать протеазы, активные в отношении фибриллярных белков в кислых областях рН. Общая протеолитическая активность, определенная с азоказеином при рН 8,2, была достаточно низкой (менее 29 Еазк) для всех штаммов, кроме Л. м>впШ (47,55 Еазк).
Изучение спектра протеолитической активности выделяемых используемыми микромицетами
ферментов проводили с использованием хромо-генных пептидных субстратов, расщепляемых белками системы гемостаза (тромбином, плазми-ном, фактором Xa, урокиназой и протеином C). Результаты представлены в табл. 2.
Исходя из значений, представленных в табл. 2, можно полагать, что микромицеты, использованные в исследовании, не обладают высокими активностями, подобным тем, что проявляются белками системы гемостаза. Незначительную плазминопо-добную активность проявляли A. glaucus и A tamarii, однако она не превышала 16 EpNA.
Результаты изучения способности внеклеточных протеаз исследуемых микромицетов активировать белки системы гемостаза представлены в табл. 3.
Таблица 1
Протеолитическая активность микромицетов, определенная с белковыми субстратами
Микромицет Среда Протеолитическая активность
Общая протеолитическая активность (рН 5,5), Ешк Общая протеолитическая активность (рН 8,2), Ешк Фибриногенолитическая активность, Етир Гемоглобинолитическая активность, Етир Фибринолитическая активность (рН 5,5), Егф
A. athecius 1 27,60 14,50 0,00 29,89 0,00
2 72,05 18,95 105,46 22,95 0,00
A. caespitosus 1 2,55 28,35 0,00 84,20 0,00
2 12,15 10,75 32,63 292,60 0,00
A. glaucus 1 0,00 0,00 58,52 0,00 3,00
2 0,00 0,00 17,26 9,47 1,25
A. tamarii 1 6,25 6,30 0,00 15,99 0,00
2 20,90 27,05 4,21 13,68 10,10
A. wentii 1 33,40 47,55 0,00 127,14 6,00
2 18,95 6,15 17,89 26,10 0,00
Микромицет Среда Активность, EpNA
Chromozym™ S-2238 S-2251 S-2765 S-2222 S-2444 S-2366
A. athecius 1 0,00 1,42±1,42 0,09±0,09 0,55±0,55 5,77±2,70 0,00 0,00
2 2,58±0,32 0,96±0,15 2,93±0,03 1,07±0,44 0,00 0,93±0,06 2,78±0,32
A. caespitosus 1 0,03±0,03 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,22±0,12
2 2,12±0,44 0,09±0,09 0,17±0,03 0,93±0,06 0,00 0,00 1,25±0,09
A. glaucus 1 0,41±0,00 0,00 9,89±1,54 0,00 0,00 5,89±0,03 7,92±0,84
2 7,19±1,86 6,50±1,39 15,60±1,33 7,48±0,17 0,75±0,32 8,50±0,55 8,70±0,15
A. tamarii 1 1,28±0,06 1,04±1,04 2,29±0,44 2,06±0,09 3,68±0,20 2,12±0,61 0,15±0,05
2 5,42±0,20 3,54±0,46 10,41±3,86 2,35±0,26 0,00 0,70±0,12 0,00
A. wentii 1 6,06±0,61 0,00 0,75±0,29 0,55±0,32 0,26±0,03 0,78±0,20 0,00
2 0,29±0,29 0,00 1,89±0,15 2,03±0,46 0,00 1,89±0,09 0,00
Таблица 2
Прямая активность протеаз микромицетов в отношении хромогенных пептидных субстратов белков системы гемостаза
Данные табл. 3 свидетельствуют о том, что внеклеточные протеазы, выделяемые всеми используемыми в исследовании штаммами микро-мицетов рода Aspergillus, не обладают достаточными активаторными активностями по отношению к белкам системы гемостаза. Из пяти штаммов, исследованных на предмет проявления активатор-ной активности в отношении семи субстратов, только A. athecius и A. wentii показали активность, превосходящую 10 ед. (14,97 и 10,20 EpNA соответственно). Однако такие величины активности не позволяют считать данных микромицетов биотех-нологически перспективными.
Для изучения прямой фибринолитической и активаторной по отношению к плазминогену активности был использован метод Аструпа— Мюллертца—Лансена с использованием фибрино-вых пластин. Результаты представлены в табл. 4.
Наибольшую прямую фибринолитическую активность продемонстрировал A. athecius при культивировании на ферментационной среде № 2 (402,93 Е). В то же время, при культивировании на этой же среде активаторная по отношению к плазминогену активность также была наивысшей среди наблюдаемых, что делает протеазы этого микромицета перспективными в качестве препарата для неотложной медицины, однако
потенциально ограничивает их использование для создания диагностикумов. Также выраженная фибринолитическая активность была показана для А. caespitosus, а активаторная по отношению к плазминогену — для А. wentii. Отсутствие фибринолитической и несущественная активаторная по отношению к плазминогену активность наблюдались для A. glaucus, что в сочетании с низкой протеолитической активностью, определенной с белковыми и хромогенными субстратами, доказывает, что использование данного микромицета как продуцента протеолитических ферментов нецелесообразно.
Полученные результаты могут быть объяснены происхождением использованных микромицетов: они были выделены из различных материалов, включая мышцы, кости, кожу и погребальную одежду из мумифицированных человеческих останков из склепа [12]. Поскольку склеп, в котором они были обнаружены, долгое время не вскрывался, метаболическая активность грибов в условиях ограниченного количества питательного субстрата должна быть крайне низкой. Два основных питательных субстрата, обнаруженные в склепе, представляют собой тела умерших и их одежду, то есть богатые белком и целлюлозой материалы. Вполне возможно, что низкая протеолитическая
Таблица 3
Активаторная активность протеаз микромицетов в реакциях с хромогенными пептидными субстратами белков системы гемостаза
Микромицет Среда Активность, Е^
Chromozym™ S-2238 S-2251 S-2765 S-2222 S-2444 S-2366
A. athecius 1 0,00 0,64±0,36 0,00 0,00 0,00 2,78+0,18 0,00
2 14,97±0,99 4,35+1,48 0,00 3,07+0,32 0,00 2,38+0,28 0,00
A. caespitosus 1 6,56±0,97 0,00 1,94+0,04 0,93 0,00 0,00 3,28+0,41
2 0,00 0,00 0,00 1,33 0,00 1,54+0,08 0,00
A. glaucus 1 2,64±0,15 0,00 0,00 0,00 1,13+0,11 0,00 0,00
2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
A. tamarii 1 0,00 0,52+0,08 1,45+0,09 0,00 0,00 4,29+1,00 2,78+2,78
2 0,00 0,75+0,21 0,00 4,06+1,08 0,00 0,81+0,07 1,91+1,91
A. wentii 1 0,00 1,91+0,32 0,00 0,00 3,25+0,23 0,70+0,03 0,06+0,06
2 10,20±0,43 0,41+0,12 0,75+0,20 0,00 0,00 3,60+0,021 0,00
Фибринолитическая и активаторная к плазминогену активность протеаз аспергиллов
Микромицет Фибринолитическая активность, усл.ед/мл Активаторная к плазминогену активность, усл.ед/мл
Среда 1 Среда 2 Среда 1 Среда 2
A. athecius 174,83+16,48 402,93+0,00 37,46+17,66 310,52+8,24
A. caespitosus 241,43+40,03 141,53+30,61 44,12+17,66 0,00
A. glaucus 0,00 0,00 0,00 14,15+20,01
A. tamarii 0,00 83,25+0,00 104,90+7,06 213,12+0,00
A. wentii 0,00 83,25+0,00 53,28+0,00 91,58+11,77
Таблица 4
активность использованных штаммов объясняется метаболической спецификацией в отношении материалов одежды, а не мертвых тканей.
Таким образом, изучена активность внеклеточных протеаз для пяти видов микромицетов рода Aspergillus. Показано отсутствие активностей, подобных активности тромбина, плазмина, фактора Xa, урокиназы и протеина C, а также актива-торных активностей в отношении этих белков. Продемонстрированы высокая и специфическая
фибриногенолитическая, фибринолитическая, а также активаторная по отношению к плазмино-гену активность для Л. аЛваш, а также высокая фибринолитическая активность для Л. caвspitosus.
Работа проведена без привлечения финансирования. Исследования выполнены без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Shirasaka N., Naitou M., Okamura K., Fukuta Y., Terashita T., Kusuda M. Purification and characterization of a fibrinolytic protease from Aspergillus oryzae KSK-3. Mycoscience. 2012;53(5):354-364.
2. Zaikina N.A., Shataeva L.K., Elinov N.P., Samsonov G.V. Some properties of the protease from Aspergillus terricola. Mycopathologia. 1975;56(3):153—157.
3. Osmolovskiy A.A., Popova E.A., Kreyer V.G., Baranova N.A., Egorov N.S. Fibrinolytic and collagenolytic activity of extracellular proteinases of the strains of micromycetes Aspergillus ochraceus L-1 and Aspergillus ustus 1. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2016;71(1):62—66.
4. Kotb E.H., Gamal E.A., Edries F.M. Screening for fibrinolytic filamentous fungi and enzymatic properties of the most potent producer, Aspergillus brasiliensis AUMC 9735. Biologia. 2015:70(12):1565-1574.
5. Yadav S., Siddalingeshwara K. Screening and biosynthesis of fibrinolytic enzyme from Aspergillus japonicum. J. Drug Deliv. Ther. 2015;5(6):60—62.
6. Osmolovskiy A.A., Kreier V.G., Kurakov A.V., Baranova N.A., Egorov N.S. Aspergillus ochraceus micromycetes-producers of extracellular proteinases-protein C activators of blood plasma. Appl. Biochem. Microbiol. 2012;48(5):488—492.
7. Zvonareva E.S., Osmolovskiy A.A., Kreyer V.G., Baranova N.A., Kotova I.B., Egorov N.S. Identification of targets for extracellular proteases activating proteins of the haemostatic system produced by micromycetes Aspergillus ochraceus and Aspergillus terreus. Russ. J. Bioorg. Chem. 2015;41(5):500-505.
8. Osmolovskiy A.A., Kurakov A.V., Kreyer V.G. Baranova N.A., Egorov N.S. Ability of extracellular proteinases of micromycetes Aspergillus flavipes, Aspergillus fumigatus, and Aspergillus sydowii to affect proteins of the human haemostatic system. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2017;72(1):20—24.
9. Osmolovskiy A.A., Kreyer V.G., Baranova N.A., Kurakov A.V., Egorov N.S. Production of extracellular proteinases (protein C activators in blood plasma) by the micromycete Aspergillus ochraceus during submerged and solid-state cultivation. Appl. Biochem. Microbiol. 2013;49(6):580-586.
10. Astrup R., Müllertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. Arch. Biochem. Biophys. 1952;40(2):346—351.
11. Osmolovskiy A.A., Kreier V.G., Kurakov A.V., Baranova N.A., Egorov N.S. Aspergillus ochraceus micromycetes - producers of extracellular proteinases -protein C activators of blood plasma. Appl. Biochem. Microbiol. 2013;45(5):488-492.
12. Simonovicovä A., Krakovä L., Pangallo D., Majorosovä M., Pieckovä E., Bodorikovä S., Dörnhoferovä M. Fungi on mummified human remains and in the indoor air in the Kuffner family crypt in Slädkovicovo (Slovakia). Int. Biodeter. Biodegradat. 2015;99:157-164.
Поступила в редакцию 27.03.2023 После доработки 18.05.2023 Принята в печать 29.05.2023
SHORT COMMUNICATION
Investigation of new Aspergillus strains as producers of hemostatically active proteases
A.A. Osmolovsky1' *©, A.A. Shestakova1, D.Ye. Surkova1, 2, R. Lehotskâ3, E. Pieckovä3
1 Department of Microbiology, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, 1—12 Leninskie gory, Moscow, 119234, Russia; 2Faculty of Biology and Biotechnology, Higher School of Economics University, 20 Myasnitskaya str., Moscow, 101100, Russia; 3Department of Microbiology, Slovak Medical University in Bratislava, 12 Limbova str., Bratislava, 83303, Slovakia
*e-mail: aosmol@mail.ru
For five species of Aspergillus micromycetes, the diversity of proteolytic activities against human hemostasis proteins was assessed. For every strain, absence of activities similar to hemostatic proteases - thrombin, plasmin, factor Xa, urokinase, and protein C was shown. In addition, no
activating activities towards precursors of the named proteases were demonstrated. For A. glaucus, proteases of high activity (58,52 Utyr) and specificity against fibrinogen were found. A. athecius, A. caespitosus и A. wentii, were capable of proteolysis at acidic pH.
Keywords: proteases of micromycetes, fibrinolytic enzymes, thrombolytics, activators of human hemostatic proteins, chromogenic peptide substrates, Aspergillus
Funding: The study was performed without financial support.
Сведения об авторах
Осмоловский Александр Андреевич — канд. биол. наук, доц. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: aosmol@mail.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6672-0551
Шестакова Анна Александровна — аппаратчик синтеза кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: anashestakova2001@gmail.com Суркова Дарья Евгеньевна — аппаратчик синтеза кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: surkovadaria2002@gmail.com Рената Лехотска — сотр. департамента общественного здоровья Словацкого медицинского университета в Братиславе. Тел.: +421 2/593 701 11; e-mail: elena.pieckova@szu.sk Елена Пецкова — Ph.D., доц. департамента общественного здоровья Словацкого медицинского университета в Братиславе. Тел.: +421 2/593 701 11; e-mail: elena.pieckova@szu.sk
