CC BY
133
УДК 634.986: 615.7
ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА ЭТАНОЛЬНОГО ЭКСТРАКТА БЕРЕСТЫ И ЕГО ТОКСИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
© С.А. Кузнецова1, Г.П. Скворцова1, Г.С. Калачева2, И.А. Зайбель3, О.А. Ханчич4
1 Институт химии и химической технологии СО РАН, Академгородок,
Красноярск, 660036 (Россия). E-mail: [email protected]
2Институт биофизики СО РАН, Академгородок, Красноярск, 660036 (Россия)
3Красноярский аграрный университет, пр. Мира, 90, Красноярск, 660049 (Россия)
4Российский государственный университет туризма и сервиса, ул. Главная,
99, пос. Черкизово, Пушкинский р-н, Московская обл., 141221 (Россия)
Изучены состав и биологическая активность этанольного экстракта бересты. С использованием хромато-масс-спектрометрии, показано, что основные компоненты, определяемые в экстракте, относятся к тритерпеноидам лупаново-го ряда, относительное содержание которых составляет 94,3%. Установлено, что этанольный экстракт бересты в дозе 5000 мг/кг не является токсичным и может быть использован в качестве фитоадаптогена.
Ключевые слова: состав, этанольный экстракт бересты, хромато-масс-спектрометрия, тритерпеноиды, фитоадапто-ген, биологическая активность.
Введение
Береста издавна использовалась в народной медицине в качестве антисептика при лечении гнойных ран и различных кожных заболеваний. В последнее время проводятся интенсивные исследования фармакологического действия бетулина и его производных [1-3]. Однако технологии получения бетулина и его производных являются достаточно трудоемкими и энергозатратными. Технически гораздо проще и дешевле получать бету-лин-содержащие экстракты бересты с использованием традиционных методов экстракции, которые имеют перспективы использования при разработке новых лечебных препаратов. Несмотря на то, что химический состав коры многих видов берез и экстрактов изучен достаточно подробно, качественный и количественный составы основных компонентов меняются в зависимости от вида березы, условий и места ее произрастания [4-6].
В последние годы актуальной проблемой медицины и ветеринарии является профилактика и коррекция нарушений, вызванных воздействием ксенобиотиков и других лекарственных веществ. Для нейтрализации вредных воздействий лекарственых и некоторых химических веществ на живой организм могут применяться препараты растительного происхождения - фитоадаптогены, для которых характерна малая токсичность и возможность длительного их применения без существенных побочных явлений.
Ранее мы рассматривали состав и токсико-фармакологические свойства гексанового экстракта бересты [7]. Цель данной работы - изучение состава этанольного экстракта бересты березы Betula pendula Roth. и его токсико-фармакологических свойств.
Экспериментальная часть
В качестве исходного сырья использовали бересту березы Betula pendula Roth., заготовленную в окрестностях Красноярска, измельченную до фракции 1-2 мм и высушенную при температуре 105 °С до влажности менее 1%. Измельченную бересту подвергали исчерпывающей экстракции этанолом в аппарате Соксле-та. После удаления этанола на роторном испарителе получают порошок бежевого цвета с выходом до 34% от массы а.с.с.
* Автор, с которым следует вести переписку.
С использованием элементного анализа, ИК-спектроскопии, тонкослойной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии (ХМС) проведен анализ этанольного экстракта бересты (ЭЭБ). Элементный анализ экстрактов проводили с использованием элементного анализатора FLASH™ 1112. ИК-спектроскопическое исследование выполнено на ИК-Фурье спектрометре «Vector 22». Сухой экстракт прессовали с бромистым калием в специальной матрице. Обработку спектральной информации проводили с использованием программы OPUS/Y (версия 2.2).
Качественный и количественный составы продуктов экстракта исследовали на хромато-масс-спектрометре GCD Plus (Hewlett Packard, USA) с квадрупольным масс-спектрометром в качестве детектора, с газовым хроматографом. Была использована капиллярная колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм HP-5MS (5% дифенил и 95% диметилполисилоксан). Условия хроматографирования были следующими: в качестве газа-носителя использовали гелий; скорость потока составляла 1 мл/мин; температура ввода образца - 250 °C; начальная температура - 220 °С, программа подъема температуры - до 280 °С со скоростью 2 °С/мин, изотермальный режим - 2 мин, подъем температуры - до 300 °С со скоростью 10 °С/мин, изотермальный режим - 20 мин; температура трансферной линии - 280 °С, источника ионов - 175 °С, режим электронного удара при 70 eV, детекция масс от 45 до 450 m/z. Идентификация компонентов осуществлена сопоставлением времен удерживания пиков на хроматограмме и полных масс-спектров отдельных компонентов с соответствующими данными чистых соединений библиотеки масс-спектров. Относительное количественное содержание химических компонентов экстракта рассчитано методом внутренней нормализации площадей пиков без корректирующих коэффициентов чувствительности.
Обсуждение результатов
Данные по элементному составу бересты, бетулина и экстрактов бересты представлены в таблице 1.
Температура плавления этанольного экстракта бересты составляет 260 °С. В таблице 2 и на рисунке 1 приведены идентифицированные компоненты этанольного экстракта бересты.
Более 94% основных компонентов этанольного экстракта бересты относятся к тритерпеноидам лупано-вого ряда. Доминирующими тритерпеноидами этанольного экстракта бересты так же, как и гексанового экстракта, являются бетулин и лупеол, причем доля бетулина составляет 51,1%, а лупеола - 34,4%. Среди минорных примесей идентифицированы альдегиды лупеола и бетулина с молекулярной массой 424, 438 и 440, соответственно и p-ситостерин с молекулярной массой 414. Более 2,5% этанольного экстракта бересты приходится на долю этиловых эфиров жирных кислот, которые представлены в основном насыщенными жирными кислотами с длиной цепи от 16 до 23 атомов углерода, небольшую долю составляет этиловый эфир олеиновой кислоты.
Таблица 1. Элементный состав бересты, бетулина и этанольного экстракта бересты
Образец Содержание элементов, %
С Н О S N
Береста 70,62 9,04 19,57 0,08 007
Бетулин 76,26 11,26 9,78 0,11 0,06
Этанольный экстракт бересты 81,70 11,11 6,86 0,00 0,26
Таблица 2. Идентифицированные компоненты этанольного экстракта бересты
Компонент М+ % от суммы
Бетулин 442 51,1
Лупеол 426 34,4
Альдегид бетулина 440 5,5
Диальдегид бетулина 438 1,7
Альдегид лупеола 424 1,6
Р-ситостерин 414 0,9
Пальмитиновая кислота 256 0,4
Этиловый эфирС16:0 284 1,1
Этиловый эфир С17:0 298 0,1
Этиловый эфир С18:1 310 0,7
Этиловый эфир С18:0 312 0,1
Этиловый эфир С20:0 340 0,1
Этиловый эфир С22:0 368 0,3
Этиловый эфир С23:0 382 0,1
Изучение токсико-фармакологических свойств экстракта бересты
Исследования цитотоксического действия ксенобиотика абиктина проведены на 50-ти беспородных крысах-самцах массой 150 г. Моделирование интоксикации осуществлялось путем введения абиктина подкожно в дозе 1 мг/кг. В качестве корректора использовали этанольный экстракт бересты в дозе 600 мг/кг внутрижелудочно.
Изучение процессов перекисного окисления липидов проводили на 7-е и 14-е сутки опыта, а также в восстановительный период на 21-е и 28-е сутки. Исследование продуктов перекисного окисления липидов костного мозга в тесте с тиобарбитуровой кислотой проводили путем измерения содержания ТБК-активных продуктов [8]. Для анализа брали 0,3 мл суспензии клеток, приливали к ней 3 мл 1% ортофосфорной кислоты, 1 мл 0,6% тиобарбитуровой кислоты (ТБК) и 0,1 мл раствора сернокислого железа. Пробирки ставили в кипящую водяную баню на 1 ч, затем охлаждали в холодной воде, добавляли 4 мл бутанола, тщательно перемешивали и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Оптическую плотность измеряли на фотоэлектрическом концентрационном колориметре КФК-2, при длине волны 535 нм против бутанола. Расчет содержания продуктов, реагирующих с ТБК, проводили с учетом коэффициентов молярной экстинции малонового диальдегида (МДА).
Исследование уровня эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, а также общего белка и его фракции, ас-партатаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ) проводили на 7-е, 14-е сутки. Определение концентрации гемоглобина осуществляли гемоглобинцианидным методом на фотоэлектрическом колориметре КФК-2. Подсчет количества эритроцитов и лейкоцитов проводили в камере Горяева. Общий белок определяли рефрактометрическим методом, белковые фракции в сыворотке крови - нефелометрическим методом. ACT и АЛТ определяли в сыворотке крови общепринятыми методами [9].
Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми, если вероятность случайности не превышала 5% (Р<0,05) [10].
Проведенное токсикологическое исследование показало, что этанольный экстракт бересты в дозе 5000 мг/кг не является токсичным, согласно международной токсикологической классификации его можно отнести к 4 классу малотоксичных веществ.
Свободнорадикальное окисление жирных ненасыщенных кислот имеет прямое отношение как к нормальной жизнедеятельности клетки, так и к возникновению, течению и исходу многих патологических состояний. Дисбаланс в равновесии между антиоксидантной системой и процессами перекисного окисления липидов вызывает лавинообразную реакцию переокисления, приводящую к гибели клетки. По современным данным, в процессе разрушения эритроцитов и их повреждения принимают участие активные формы кислорода, количество которых при токсических воздействиях возрастает.
В проведенных нами исследованиях абиктин индуцировал перекисное окисление липидов (ПОЛ) с проявлением зависимости «доза - эффект» и «время - эффект». Введение ксенобиотика дозе 1 мг/кг увеличивало уровень малонового диальдегида на 51% по сравнению с контрольной группой, что составляло 1,12±0,02 мкмоль/л (Р<0,02), а при 14-дневном курсе на 66%, достигая 1,63±0,11 мкмоль/л (Р<0,01). При совместном введении ЭЭБ в дозе 600 мг/кг и абиктина в дозе 1 мг/кг адаптоген проявлял защитное действие в дозозависимой манере, снижая количество ТБК-активных продуктов в клетках к 7-м суткам на 20%, к 14-м - на 30%, по сравнению с изолированным действием абиктина, составляя соответственно 0,89± 0,02 мкмоль/л (Р<
0,02) и 1,13± 0,12 мкмоль/л (Р< 0,05). К 28-му дню исследования показатели ПОЛ постепенно понижались, при этом экстракт бересты повышал мощность антиоксидантных систем организма и возвращал уровень малонового диальдегида к показателям контроля, что при его введении с абиктином было быстрее, чем при изолированном действии ксенобиотика, достоверно снижаясь до 0,69 ± 0,40 мкмоль/л (рис.).
При введении абиктина в дозе 1 мг/кг совместно с этанольным экстрактом бересты происходило достоверное увеличение количества эритроцитов к 7 суткам на 13% (Р < 0,05), к 14 дню на 7% (Р < 0,05), повышение концентрации гемоглобина к 14 суткам до 138±0,16 г/л (Р < 0,01) по сравнению с отдельным действием абиктина. Количество лейкоцитов увеличивалось до 16,14±0,43-109 /л (Р < 0,05), что в два раза ниже, чем при введении абиктина изолированно, и свидетельствует о гематозащитном эффекте адаптогена (табл. 3).
Установлено, что введение абиктина совместно с этанольным экстрактом бересты берёзы вызывало изменение биохимического состава крови, которые были менее выражены, чем при изолированном действии ксенобиотика. При введении абиктина в дозе 1 мг/кг к 14 суткам количество общего белка снизилось по сравнению с контролем на 14,7%, а при поступлении его с экстрактом берёзы на 8% и составило 65,36±0,38 г/л (Р < 0,02) (табл. 4).
Изменение концентрации малонового диальдегида (МДА) при введении абиктина и этанольного экстракта бересты: 1 - контроль; 2 - введение абиктина в дозе 1 мг/кг; 3 - введение абиктина вместе с экстрактом бересты. Достоверность: *Р < 0,05;
7 суток 14 суток 21 сутки 28 суток **р < 0 02' *** Р < 0 01
Таблица 3. Изменение показателей перефирической крови при введении абиктина и этанольного экстракта бересты
Серия Эритроциты-10 /л Гемоглобин, г/л Лейкоциты-10 /л
7-е сутки
Контроль 10,88±0,15 157,23±2,87 13,41±0,54
Абиктин, 1 мг/кг 6,09±0,12** 123,13±1,78** 22,54±2,08**
Абиктин, 1 мг/кг + ЭЭБ, 600 мг/кг 7,02±0,24* 158,18±0,40* 8,52±1,02***
14-е сутки
Контроль 11,40±0,15 160,0±2,06 15,22±0,16
Абиктин, 1 мг/кг 5,60±0,40*** 62,92±1,08** 36,17±2,93***
Абиктин, 1 мг/кг + ЭЭБ, 600 мг/кг 6,04±0,26* 138±0,16*** 16,14±0,43*
Примечание. Здесь и далее результаты представлены как M± m, где М - генеральная средняя; m - ошибка разности средних.*р < 0,05; **р < 0,01; ***p < 0,01
Таблица 4. Биохимические показатели сыворотки крови при подостром введении абиктина и экстракта березы
Серия опыта Срок опыта Общий белок, Альбумины, Глобулины, аст, АЛТ, ммоль-ч
(сутки) г/л г/л г/л ммоль/л-ч
Контроль до начала 71,09±0,03 32,8±0,18 38,49±0,21 0,30±0,06 0,25±0,15
Абиктин, 7 65,38±0,91* 21,63±0,35* 43,79±0,93** 0,65±0,12** 0,79±0,09***
1 мг/кг 14 60,64±0,27* 16,18±0,09** 44,46±0,11** 0,81±0,08** 1,06±0,04
Абиктин,1 7 69,26±0,11** 26,95±0,23* 42,31±0,04* 0,40±0,20** 0,49±0,04*
мг/кг + ЭЭБ 14 65,36±0,38** 21,91±1,02* 43,42±0,24 0,58±0,05** 0,61±0,24**
*р < 0,05; ** р < 0,02
Наряду с изменением белковых фракций крови наблюдалось изменение соотношения ферментов сыворотки крови, таких как ACT и АЛТ. Достоверное различие между повышением ферментов наблюдалось уже к 7 дню: ACT увеличивалось на 25% (Р<0,02) по сравнению с контролем, АЛТ на 48% (Р<0,05), в то время как эти изменения при изолированном действии абиктина были в 2 раза выше. Это свидетельствует о защитном действии лупановых тритерпиноидов, содержащихся в экстракте бересты березы и понижающих показания маркеров цитолиза гепатоцитов, таких как ACT и АЛТ.
Таким образом, этанольный экстракт бересты при совместном введении с абиктином в дозе 1 мг/кг уменьшал процесс анемии и лейкоцитоза, снижал развивающуюся при отдельном действии препарата гипо-протеинемию и, одновременно корригируя показатели ACT и АЛТ, тем самым проявлял защитное действие от цитотоксического влияния ксенобиот.
Выводы
Изучен химический состав этанольного экстракта бересты березы с использованием хромато-масс-спектрометрии: идентифицированы бетулин, лупеол, альдегиды бетулина и лупола и ситостерол.
Установлено, что этанольный экстракт бересты можно отнести к 4 классу малотоксичных веществ и использовать в качестве фитоадаптогена.
Показано, что этанольный экстракт бересты березы при совместном введении с абиктином проявляет защитное действие от цитотоксического влияния ксенобиотика: уменьшает анемию и лейкоцитоз, снижает гипопротеинемию и одновременно коррегирует показатели АСТ и АЛТ.
Список литературы
1. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А., Толстиков А.Г., Флехтер О.Б. Терпеноиды ряда Лупана -биологическая активность и фармакологические перспективы // Биоорганическая химия. 2006. Т. 32. №1. С. 42-55.
2. Флехтер О.Б., Медведева Н.И., Карачурина Л.Т., Балтина Л.А., Галин Ф.З., Зарудий Ф.С., Толстиков Г.А. Синтез и фармакологическая активность эфиров бетулина, бетулиновой кислоты и аллобетулина // Химикофармацевтический журнал. 2005. Т. 39. №8. С. 9-13.
3. Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстиков А.Г. Бетулин и его производные. Химия и биологическая активность // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. Т. 13. С. 1-30.
4. Похило Н.Д., Уварова Н.И. Изопреноиды различных видов бетулина // Химия природных соединений. 1988. №3. С. 325-341.
5. Кислицин А.Н. Экстрактивные вещества бересты: выделение, состав, свойства и применение // Химия древесины. 1994. №3. С. 3-28.
6. Абышев А.З., Агаев Э.М., Гусейнов А.Б. Исследование химического состава экстракта коры берёзы Cortex-Betula сем. ВеШ1асеае // Химико-фармацевтический журнал. 2007. Т. 41. №8. С. 22-26.
7. Кузнецова С.А., Кузнецов Б.Н., Веселова О.Ф., Кукина Т.П., Калачева Г.С., Скворцова Г.П., Редькина Е.С. Изучение состава гексанового экстракта бересты и его токсико-фармакологических свойств // Химия растительного сырья, 2008. №1. С. 45-49.
8. Андреевич Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекиси липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лабораторное дело. 1988. №11. С. 11-13.
9. Биохимические исследования в токсикологическом эксперименте / под ред. М.Ф. Савченкова, В.М. Прусака. Иркутск, 1990. С. 132-138.
10. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1980. 296 с.
Поступило в редакцию 30 апреля 2009 г.
После переработки 1 марта 2010 г.
