CC BY
94
Химия растительного сырья. 2011. №4. С. 77-82.
УДК 547.914.4+581.192.2 СИНТЕЗ ДИПРОПИОНАТА БЕТУЛИНА ИЗ БЕРЕСТЫ КОРЫ БЕРЕЗЫ
© С.А. Кузнецова1’2*, Г.П. Скворцова1, Ю. Н. Маляр1, В.А.Соколенко1, Б.Н. Кузнецов1,2
1 Институт химии и химической технологии СО РАН, ул. К. Маркса, 42,
Красноярск, 660049 (Россия), e-mail: ksa@icct.ru
2Сибирский федеральный университет, пр. Свободный,79, Красноярск,
660041 (Россия)
В работе представлен одностадийный синтез дипропионата бетулина непосредственно из бересты березы, исключив отдельную стадию получения бетулина. Показано, что в зависимости от условий ацилирования бересты коры березы пропионовой кислотой можно получить экстракты с разным содержанием дипропионата бетулина. Получен продукт с наибольшим содержанием дипропионата бетулина из исходной бересты березы фракции 2-5 мм и предварительно активированной перегретым водяным паром бересты фракции 10-20 мм. Анализ экстракта бересты проведен методом газовой хроматографии. Структура дипропионата бетулина подтверждена методами элементного анализа, Н1ЯМР, С13ЯМР и FTIR спектроскопии.
Ключевые слова: береста коры березы, дипропионат бетулина, пропионовая кислота, ацилирование, активация, взрывной автогидролиз.
Работа поддержана грантом программы РАН «Фундаментальные науки - медицине»
Тритерпеновые соединения ряда лупана - бетулин, бетулоновая и бетулиновая кислоты и их произ-водные обладают уникальными фармакологическими свойствами - противоопухолевыми, ангиоксидантны-ми, противовирусными и другими [1-9], кроме того, они могут быть использованы для получения полимер -ных материалов [10] и органических синтезов [11]. Пропионовая кислота входит в состав некоторых лекарственных средств (ибупрофен, феноболин, напроксен и другие ненаркотические анальгетики, а также нестероидные противовоспалительные средства), душистых веществ. Кроме того, пропионовая кислота препятствует росту плесени и некоторых бактерий, поэтому используется в качестве консервантов продуктов [12]. Целенаправленная химическая модификация природных биологически активных соединений приводит в ряде случаев к получению веществ, которые обладают более широким спектром действия и низкой токсичностью.
Дипропионат бетулина - 3Р,28-дипропиокси-луп-20(29)-ен (1) является сложным эфиром пропионовой кислоты и бетулина.
Известные способы получения эфиров бетулина в основном базируются на реакциях ацетилирова-ния бетулина и требуют обязательной стадии выделения бетулина из бересты березы Betula pendula Roth
Введение
Структурная формула дипропионата бетулина
* Автор, с которым следует вести переписку.
[6, 13, 14]. Ранее авторами были предложены одностадийные способы получения диацилов бетулина из бересты коры березы, основанные на совмещении стадии экстракции бетулина из бересты и их ацилирова-ния уксусной, пропионовой и масляной кислотами [15-19].
На примере получения диацилов бетулина из бересты березы было показано, что предварительная кратковременная активация бересты перегретым водяным паром в условиях «взрывного автогидролиза» в течение 60 сек позволяет сократить продолжительность процесса ацилирования до 30 мин [18, 19].
В продолжение наших работ по получению тритерпеновых соединений из бересты коры березы и изучению их свойств [15-23] целью данной работы являлся синтез дипропионата бетулина и его идентификация, изучение влияния предварительной активации и ацилирования бересты пропионовой кислотой на выход и состав продуктов.
Экспериментальная часть
В качестве исходного сырья использовали бересту коры березы Betula pendula Roth, измельченную до фракции 2-5 мм, 10-20 мм, и бересту, активированную перегретым водяным паром. Активацию бересты перегретым водяным паром в условиях «взрывного автогидролиза» проводили на установке, описанной в работах [24, 25]. Анализ химического состава бересты был проведен по известным в химии древесины методикам по схеме, описанной в работе [18]. Дипропионат бетулина синтезировали в круглодонной колбе с обратным холодильником. В колбу загружали измельченную до необходимой фракции бересту, добавляли пропионовую кислоту и выдерживали на масляной бане при температуре 120-130 °С в течение 0,5-8 ч. Затем бересту отфильтровывали, раствор упаривали, а получившийся концентрат выливали в дистиллированную воду. Выпавший светло-серый экстракт отфильтровывали и высушивали в эксикаторе. Полученный продукт перекристаллизовывали из этанола с применением активированного угля марки ОУ-Г [16]. Анализ и идентификацию продуктов проводили на газовом хроматографе 6890N (Agilent, США). Условия хроматографии были следующими: капиллярная колонка НР-5 длиной 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм. Газ-носитель - азот; скорость потока - 1,5 мл/мин; температура ввода проб - 250 °С; начальная температура - 180 °С, подъем температуры до 320 °С со скоростью 10 °С/мин, 10 мин изотермального режима. Детектор пламенно-ионизационный (ПИД).
ИК-спектроскопическое исследование дипропионата бетулина выполнено на FTIR-Фурье спектрометре Vector 22 (Bruker). Очищенные продукты прессовали с бромистым калием в специальную матрицу. Обработку спектральной информации проводили с использованием программы OPUS/Y (версия 2.2).
ПМР-спектры и 13С-ЯМР были сняты на спектрометре Bruker Avance 600 при частоте 600 MHz=(1H), растворитель - CDCl3.
Элементный анализ дипропионата бетулина проводили с использованием элементного анализатора FLASH™ 1112.
Обсуждениерезультатов
Представлен одностадийный синтез дипропионата бетулина непосредственно из бересты березы, исключив отдельную стадию получения бетулина. При обработке бересты коры березы пропионовой кислотой наряду с экстракцией бетулина в раствор протекает также реакция ацилирования бетулина с получением дипропионата бетулина. Реакция получения дипропионата представлена на следующей схеме (рис. 1).
Для получения экстракта с наибольшим выходом дипропионата бетулина варьировали гидромодуль (соотношение массы бересты к объему пропионовой кислоты) от 1 : 10 до 1 : 30, фракцию бересты 2-5 мм и 10-20 мм и продолжительность ацилирования.
На диаграмме представлены результаты проведенных исследований по влиянию гидромодуля (ГМ) на выход продуктов ацилирования бересты кипящей пропионовой кислотой (рис. 2).
При гидромодуле 1 : 10 выход продукта ацилирования бересты кипящей пропионовой кислотой составил 31% от массы а.с.б., а при гидромодуле 1 : 20 выход достиг 45% от массы а.с.б. Увеличение объема пропионовой кислоты до гидромодуля 1 : 30 не привело к значительному повышению выхода продукта, поэтому все последующие серии экспериментов были проведены при гидромодуле 1 : 20.
Изучено влияние степени измельчения бересты и продолжительности ацилирования бересты березы пропионовой кислотой на выход экстракта. В таблице 1 представлены результаты проведенных экспериментов.
Рис. 1. Схема ацилирования бетулина пропионовой кислотой
Рис. 2. Влияние гидромодуля на выход продуктов ацилирования бересты пропионовой кислотой
Таблица 1. Влияние степени измельчения бересты и продолжительности ее ацилирования пропионовой кислотой на выход продуктов
Продолжительность ацилирования, ч
Фракция бересты, мм 0,5 2,0 4,0 8,0
Выход продуктов ацилирования, % от массы а.с.б.
2-5 23 31 39 43
10-20 29 38 48 50
Из таблицы 1 следует, что с увеличением продолжительности обработки бересты кипящей пропионовой кислотой возрастает выход продуктов ацилирования бересты. Причем наибольший выход - 43% от массы а.с.б. - получен из исходной бересты фракции 2-5 мм при продолжительности ацилирования 8 чи 48-50% от массы а.с.б. для фракции 10-20 мм при продолжительности ацилирования 4-8 ч. Уменьшение выхода экстракта при измельчении бересты до более мелкой фракции можно объяснить тем, что бетулин находится в широких, тонкостенных клетках наружного слоя коры березы [18, 26] и поэтому легко высыпается наружу при механическом измельчении бересты, в результате чего может происходить потеря бетулина.
Изучение состава продуктов ацилирования бересты
Методом газовой хроматографии был изучен состав экстрактов ацилирования бересты кипящей пропионовой кислотой.
В таблице 2 и на рисунке 3 представлены данные по выходу и составу продуктов ацилирования исходной бересты кипящей пропионовой кислотой.
В составе продуктов ацилирования бересты кипящей пропионовой кислотой были обнаружены следующие компоненты: дипропионат бетулина, монопропионат бетулина, бетулин и лупеол.
Таблица 2. Влияние продолжительности ацилирования исходной бересты фракции 2-5 и 10-20 мм кипящей пропионовой кислотой на выход и состав продуктов
Продолжительность ацилирования, ч Выход продуктов, % от массы а.с.б. Состав продуктов, % массы продукта*
ДПБ МПБ Бетулин Лупеол
Степень измельчения бересты, мм
2-5 10-20 2-5 10-20 2-5 10-20 2-5 10-20 2-5 10-20
0,5 23 29 13 8 60 64 22 23 5 5
2,0 31 38 30 38 64 52 3 6 3 4
4,0 39 48 58 50 39 44 2 4 1 2
8,0 43 50 85 59 13 37 1 3 1 1
ДПБ - дипропионат бетулина, МПБ - монопропионат бетулина
Рис. 3. Влияние продолжительности ацилирования бересты фракции 2-5 мм кипящей пропионовой кислотой на состав продуктов (1 - дипропионат;
2 - монопропионат; 3 - бетулин; 4 - лупеол)
Представленные в таблице 2 и на рисунке 3 данные свидетельствуют о том, что с увеличением продолжительности ацилирования исходной бересты фракции 2-5 мм до 8 ч содержание дипропионата бетулина в продукте увеличивается от 13 до 85% от массы продукта, а содержание остальных компонентов снижается: монопропионата бетулина от 60 до 13%, бетулина - от 22 до 1%, а лупеола от 5 до 1%.
Для бересты фракции 10-20 мм с увеличением продолжительности ацилирования до 8 ч содержание дипропионата бетулина в продукте увеличивается лишь до 59%, при этом содержание монопропионата бетулина уменьшается от 64 до 37%, бетулина - от 23 до 3% и лупеола - от 5 до 1%.
Активация бересты березы перегретым водяным паром
С целью интенсификации увеличения выхода продукта, содержания в нем дипропионата бетулина и сокращения продолжительности ацилирования была проведена кратковременная активация бересты фракции 10-20 мм перегретым водяным паром в условиях «взрывного» автогидролиза [18, 27]. В таблице 3 представлены результаты проведенных экспериментов.
Из таблицы 3 следует, что после предварительной активации бересты березы перегретым водяным паром в условиях «взрывного» автогидролиза возрастает выход продуктов. При продолжительности ацилирования 0,5 ч выход продукта из исходной бересты составляет 29%, а из активированной - 47% от массы а.с.б. Однако основным компонентом в данных экстрактах является монопропионат бетулина. С увеличением продолжительности ацилирования бересты кипящей пропионовой кислотой до 8 ч выход продуктов возрастает до 54% массы а.с.б., и содержание дипропионата бетулина в нем составляет 85%.
Выделенный и перекристаллизованный из этилового спирта дипропионат бетулина (30-, 28-дипропиокси-луп-20(29)-ен-1) представляет собой порошок белого цвета с т.пл. 149 °С.
Идентификация дипропионата бетулина подтверждена методами элементного анализа, РТГЯ , ПМР и С13ЯМР-спектроскопии.
Найдено,0/«: С 80; Н 10; О 10; Вычислено,0/«: С 78; Н 11; О 11.
ИК-спектр (V, см-1): 3067,02 (С=С); 2956,98; 2871,82 (С-Н); 1735,79; 1641,88 (С=0); 1461,80; 1423,84; 1389,97; 1355,27 (С-С); 1276,09; 1261,10; 1185,80; 1148,72; 1105,54; 1083,88 (С-О-С).
Таблица 3. Влияние продолжительности активации и ацилирования бересты фракции 10-20 мм пропионовой кислотой на выход и состав продуктов*
Продолжительность ацилирования, ч Продолжительность активации, с Выход продуктов, % от массы а.с.б. Состав продуктов, % от массы продукта
ДПБ МПБ Бетулин Лупеол и производные
Неакгивированная береста 29 8 64 23 5
0,5 120 45 20 64 10 6
180 47 8 53 32 7
240 47 15 58 19 8
Неакгивированная береста 40 50 44 4 2
4,0 120 51 61 35 0 6
180 49 50 48 0 2
240 54 55 38 1 6
Неакгивированная береста 50 59 37 3 1
8,0 120 53 68 26 1 5
180 50 55 39 1 5
240 54 85 10 0 5
*Условия взрывного автогидролиза: Т - 180 °С, Р - 3,4 МПа, ДПБ - дипропионат бетулина, МПБ - монопропионат
бетулина
ЯМР 13С дипропионата бетулина (СБС13, мд, 5, импульсная последовательность jmod): 174,92 , 174,30(2С=0, С-31 и С-34; 150,17(С20); 109,86 (=СН2, С-29; 80,63 (СН, С-3); 62,56 (СН2,С-28); 55,39 (СН, С-5); 50,30 (СН, С-9); 48,91 (СН, С-18); 47,44 (СН, С-19); 46,44 (С, С-17); 42,71 (С, С-14); 40,91 (С, С-8); 38,38 (СН2, С-1); 37,89 (С,С-4), 37,57 (СН,С-13 ); 37,08 (С,С-10); 34,56, 34,13 (2СН2, С-22, С-7); 29,80, 29,61 (2СН2, С-16, С-21); 28,08, 27,74 (2СН2, С-35, С-32); 27,96 (СН3, С-23); 27,05 (СН2, С-15); 25,18 (СН2, С-12); 23,72 (СН2, С-2); 20,81 (СН2, С-11); 19,13 (СН3, С-30); 18,17 (СН2, С-6); 16,53, 16,15, 16,04 (3СН3, С-24, С-25, С-26); 14,75 (СН3, С-27); 9,35, 9,24 (2СН3, С-33, С-36).
Спектр ПМР дипропионата бетулина (СБС13, мд, 5): 4,71 т (1Н ,=СН2); 4,61 т (1Н, =СН2); 4,49 dd (I 10,75 гц , I 5,65 гц, Н-3); 4,29 dd (1Н, I 12,1 гц, I 1,4 гц, Н-28); 3,87 d (1Н, I 12,1 гц, Н-28); 2,49 (1Н, ddd, I 11,2, I 11,2, I 5,76 гц, Н-9); 2,37(2Н, q, I 7,56 гц, Н-32); 2,345 q, 2,347 (2Н, I 35,36 7,56 гц, Н-35); 1,70 8 (3Н, Н-30); 1,18 г, 1,17 г (6Н, 2СН3, I 32,33= I 35,36 7,76 гц, Н-33 и Н-36); 1,16 8, 0,99 8, 0,88 8 0,86 8, 0,86 8 (15Н, 5СН3, Н-23, Н-24, Н-25, Н-26, Н-27).
Спектр ЯМР 13С дипропионата бетулина имеет 36 сигналов, что соответствует брутто-формуле С36Н5604, В отличие от бетулина в спектре ЯМР 13С дипропионата бетулина имеется 6 дополнительных сигналов пропионильной группы: 174,92 мд и 174,30 мд (две карбонильные группы, 28,08 и 27,74; (две метиленовые, С-35 и С-32), 9,35 и 9,24 (две метальные группы, С-33 и С-36). Остальные сигналы спектра дипропионата бетулина близки к сигналам спектра диацета бетулина. Это указывает на то, что остов бетулина остался незатронутым в ходе реакции.
В отличие от бетулина в спектре ПМР дипропионата бетулина имеются сигналы, которые по химическим сдвигам, константам спин-спинового расщепления относятся к двум пропионильным группам: 2,37 q (СН2), 2,345 q, 2,347 q (СН2), 1,17 г и 1,18 г (2СН3). Два сигнала метиленовой группы в одной из пропио-нильных групп указывает на существование конформационных изомеров.
Испытания на токсичность полученного дипропионата бетулина были проведены в аккредитованном испытательном центре Красноярска на белых мышах. Дипропионат бетулина в дозе 4000 мг/кг нетоксичен.
Выводы
Таким образом, представлен синтез дипропионата бетулина непосредственно из бересты березы. Установлено, что в зависимости от условий ацилирования бересты можно получить экстракты с разным содержанием дипропионата бетулина, монопропионата бетулина, бетулина и лупеола. Показано, что продукт с наибольшим содержанием в нем 85% дипропионата бетулина можно получить из исходной бересты фракции 2-5 мм бересты и предварительно активированной бересты фракции 10-20 мм. Структура производного бетулина - дипропионата бетулина подтверждена методами элементного анализа, БТІЯ , ПМР и С13ЯМР-спектроскопии. Установлено, что дипропионат бетулина в дозе 4000 мг/кг нетоксичен.
Список литературы
1. Василенко Ю.К., Семенченко В.Ф., Фролова Л.М. Фармакологические свойтсва тригерпеноидов коры березы // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1993. Т. 56, №4. С. 53-55.
2. Толстиков А.Г., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А. Бетулин и его производные. Химия и биологическая активность // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. №13. С. 1-30.
3. Флехтер О.Б., Бореко Е.И., Нигматулина Л.Р. Синтез и фармакологическая активность ацилированных оксимов бетулоновой кислотні и 28-оксо-аллобетулона // Химико-фармацевтический журнал. 2004. Т. 38, №3. С. 31-34.
4. Matsuda H., Ishikado A., Nishida N. Hepatoprotective, superoxide scavenging and antioxidantive activities of aromatic constituents from the bark of betula platyphylla var. japonica // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 1998. V. 8. Pp. 2939-2944.
5. Флехтер О.Б., Бореко Е.И., Нигматулина Л.Р. Синтез и противовирусные свойства производных лупановых тригерпеноидов // Химико-фармацевтический журнал. 2004. Т. 38, №7. С. 10-14.
6. Сымон А.В., Веселова Н.Н., Каплун А.П. Синтез циклопропановых производных бетулиновой и бетулоновой кислот и их противоопухолевая активность // Биоорганическая химия. 2005. Т. 31, №3. С. 320-325.
7. Patent 7041701 (US). Triterpenoid derivatives / M. Hajduch, J. Sarek / 09.04.2006.
8. Maurya S.K., Devi S., Pandey V.B., Khosa R.I. Content of betulin and betulinic acid, antiturmor agents Zizyphus species // Fitoterapia. 1989. V. 60, N5. Pp. 468-469.
9. Fulda S., Scaffidi C., Susin S.A. Activation of mitichondria and release of mitochondrial apoptogenic factors by betulinic acid // J. Biol. Chem. 1998. V. 8, N51. Pp. 33942-33948.
10. Немилов B.E., Начинкин О.И., Царев Г.И. Полиэфиры на основе бетулина и бетулиновой кислоты // Физико-химия полимеров: сб. науч. тр. Тверь, 1996. Вып. 2. С. 124-127.
11. Шелевич И.С., Рыбина А.В., Галкин Ф.З., Талипов Р.Ф. Трансформация диацетата бетулина в различных средах // Химия и технология растительных веществ: матер. Всерос. конф. Сыктывкар, 2006. С. 453.
12. Бартон Д., Оллис У.Д. Общая органическая химия: пер. с англ. М., 1983. Т. 4. 728 с.
13. Патент №2150473 (РФ). Способ получения диацетата бетулинола / А.Н. Кислицын, А.Н. Трофимов / опубл. 10.06.2000.
14. Patent 2001-288222 (Japan). Polymer obtained from betulin and its production method / K. Kobubshi, H. Kensetsu / 16.10.2001.
15. Патент №2324700 (РФ). Способ получения диацетата бетулинола / С.А. Кузнецова, Б.Н. Кузнецов, Е.С. Редь-кина, В.А. Соколенко, Г.П. Скворцова / опубл. 20.05.2008.
16. Патент №2415148 (РФ). Способ получения дипропионата бетулинола / С.А. Кузнецова, Е.С. Скурыдина, Б.Н. Кузнецов, Г.П. Скворцова / опубл. 27.03.2011.
17. Кузнецова С.А., Васильева Н.Ю., Калачева Г.С., Титова Н.М., Редькина Е.С., Скворцова Г.П. Получение диацетата бетулина из бересты коры березы и изучение его антиоксидантной активности // Журнал Сибирского федерального университета. Химия. 2008. Т. 1, №2. С. 151-165.
18. Кузнецова С.А., Кузнецов Б.Н., Скворцова Г.П., Скурыдина Е.С., Калачева Г.С. Влияние условий ацетилиро-вания и предварительной обработки бересты коры берёзы на выход и состав тритерпеновых продуктов // Журнал Сибирского федерального университета. Химия. 2010. Т. 3, №2. C. 174-182.
19. Кузнецова С.А., Кузнецов Б.Н., Скворцова Г.П., Васильева Н.Ю., Скурыдина Е.С., Калачева Г.С. Разработка способов получения диацилов бетулина из коры березы // Химия в интересах устойчивого развития. 2010. Т. 18, №3. С. 313-320.
20. Кузнецов Б.Н., Кузнецова С.А., Левданский В.А., Судакова И.Г., Веселова О.Ф. Совершенствование методов выделения, изучение состава и свойств экстрактов березовой коры // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. Т. 13, №3. С.391-400.
21. Кузнецова С.А., Титова Н.М., Калачева Г.С., Зайбель И.А. Изучение состава и антиоксидантных свойств гексанового и этанольного экстрактов бересты // Вестник Красноярского государственного университета, Есте-ственныенауки. 2005. №2. С. 113-118.
22. Кузнецова С.А., Кузнецов Б.Н., Веселова О.Ф., Кукина Т.П., Калачева Г.С., Скворцова Г.П., Редькина Е.С. Изучение состава гексанового экстракта бересты и его токсико-фармакологических свойств // Химия растительного сырья. 2008. №1. С. 45-49.
23. Кузнецова С.А., Скворцова Г.П., Калачева Г.С., Зайбель И.А., Ханчич О.А. Изучение состава этанольного экстракта бересты и его токсико-фармакологических свойств // Химия растительного сырья. 2010. №1. С. 137-141.
24. Гравитис Я.А. Теоретические и прикладные аспекты метода взрывного автогидролиза // Химия древесины. 1987. №7. С. 3-21.
25. Кузнецова С.А., Александрова Н.Б., Кузнецов Б.Н. Состав и превращения основных компонентов автогидроли-зованной древесины сосны, ели и осины // Химия в интересах устойчивого развития. 2001. Т. 9, №5. С. 655-665.
26. Комаров В.Л. Практический курса анатомии растений. М., 1941, 311 с.
27. Кузнецов Б.Н., Левданский В.А., Еськина А.П., Полежаева Н.И. Выделение бетулина и суберина из коры березы, активированной в условиях «взрывного автогидролиза» // Химия растительного сырья. 1998. №1. С. 5-9.
Поступило в редакцию 12 июля 2011 г.
После переработки 18 сентября 2011 г.
