Научная статья на тему 'Изучение состава гексанового экстракта бересты и его токсико-фармакологических свойств'

Изучение состава гексанового экстракта бересты и его токсико-фармакологических свойств Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
577
102
Поделиться

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Кузнецова С. А., Кузнецов Б. Н., Веселова О. Ф., Кукина Т. П., Калачева Г. С.

Изучены состав и биологическая активность гексанового экстракта бересты. Используя хромато-масс-спектрометрию, показано, что основными компонентами экстракта бересты являются бетулин и лупеол, в небольших количествах содержатся альдегиды бетулина илупеола идругие вещества лупанового ряда. Установлено, что экстракт бересты относится к 4му классу малотоксичныхвеществиобладаетвыраженнымикапилляроукрепляющими свойствами.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Кузнецова С. А., Кузнецов Б. Н., Веселова О. Ф., Кукина Т. П., Калачева Г. С.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Текст научной работы на тему «Изучение состава гексанового экстракта бересты и его токсико-фармакологических свойств»

УДК 634.986: 615.7

ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА ГЕКСАНОВОГО ЭКСТРАКТА БЕРЕСТЫ И ЕГО ТОКСИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

© С.А. Кузнецова1, Б.Н. Кузнецов1, О.Ф. Веселова2, Т.П. Кукина3, Г.С. Калачева4, Г.П. Скворцова1,

Е.С. Редькина1

1 Институт химии и химической технологии CO РАН, Красноярск,

Академгородок, 660036 (Россия) E-mail: ksa@icct.ru

2Красноярская государственная медицинская академия, Красноярск (Россия)

3Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, ул. Лаврентьева, 9, Новосибирск (Россия)

4Институт биофизики СО РАН, Красноярск (Россия)

Изучены состав и биологическая активность гексанового экстракта бересты. Используя хромато-масс-спектрометрию, показано, что основными компонентами экстракта бересты являются бетулин и лупеол, в небольших количествах содержатся альдегиды бетулина и лупеола и другие вещества лупанового ряда. Установлено, что экстракт бересты относится к 4му классу малотоксичных веществ и обладает выраженными капилляроукрепляющими свойствами.

Введение

Кора березы содержит разнообразные экстрактивные вещества, обладающие биологической активностью и представляющие потенциальный интерес для получения новых продуктов и фармакологических препаратов [1-3]. В экстрактах внешней коры различных видов берез преобладают пентациклические тритерпенои-ды ряда лупана, основным компонентом которых является бетулин, обусловливающий белый цвет коры березы. Содержание бетулина во внешней коре варьируется от 10 до 40% в зависимости от вида березы, места и условий ее произрастания, возраста дерева, сезона [4-6].

В последнее время проводятся интенсивные исследования биологических свойств бетулина и его производных. Известна противовирусная, противоопухолевая активность и противовоспалительные свойства производных бетулина и лупеола [7-10], однако недостаточно изучены состав и биологические свойства экстрактов бересты.

Цель работы - изучение состава гексанового экстракта бересты и его токсико-фармакологических свойств.

Экспериментальная часть

В качестве исходного сырья использовали бересту березы Betula pendula Roth., заготовленную в районе Красноярска.

Для получения гексанового экстракта бересты (ГЭБ) измельченную до фракции 1-2 мм и высушенную при температуре 105 °С бересту подвергали экстракции гексаном в аппарате Сокслета в течение 36-40 ч. После удаления гексана на роторном испарителе получили порошок белого цвета.

Был проведен анализ гексанового экстракта бересты (ГЭБ) методами тонкослойной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии (ХМС). Тонкослойная хроматография была проведена по стандартной методике [11].

Для ХМС в первом варианте была подготовлена проба путем очистки экстракта от свободных и связанных кислот, упаривания и растворения сухого остатка в этилацетате. Во втором варианте был проведен анализ гексанового экстракта методом ХМС без пробоподготовки растворением в смеси хлороформа и метано-

* Автор, с которым следует вести переписку.

ла (1 : 1 по объёму). Качественный и количественный состав продуктов исследовался на хромато-масс-спектрометре GCD Plus (Hewlett Packard, USA) с квадрупольным масс-спектрометром в качестве детектора, с газовым хроматографом. Была использована капиллярная колонка длиной 30 м, внутренним диаметром

0,25 мм HP-5MS (5% дифенил и 95% диметилполисилоксан). Условия хроматографирования были следующими: в качестве газа-носителя использовали гелий; скорость потока составляла 1 мл/мин; температура ввода образца 250 °C; начальная температура 220 °C, программа подъема температуры до 280 °С со скоростью 2 °С/мин, изотермальный режим - 2 мин, подъем температуры до 300 °С со скоростью 10 °С /мин, изотер-мальный режим - 20 мин; температура трансферной линии 280 °C, источника ионов - 175 °C, режим электронного удара при 70 eV, детекция масс от 45 до 450 m/z.

Идентификация компонентов осуществлена сопоставлением времён удерживания пиков на хроматограмме и полных масс-спектров отдельных компонентов с соответствующими данными чистых соединений библиотеки масс-спектров. Относительное количественное содержание химических компонентов экстракта рассчитано методом внутренней нормализации площадей пиков без корректирующих коэффициентов чувствительности.

Обсуждение результатов

Основной фракцией гексанового экстракта являются два тритерпеноида: бетулин и лупеол. Структурные формулы бетулина и лупеола представлены на рисунке 1.

Хроматограмма нейтральных компонентов гексанового экстракта бересты (ГЭБ) после предварительной пробоподготовки представлена на рисунке 2. Установлено, что нейтральные компоненты гексанового экстракта бересты содержат 88,3% бетулина, 9,6% лупеола и 2 неидентифицированных компонента, общим содержанием 1,9%, хроматограмма на рисунке 2. Свободные кислоты, составляющие 1,3% от массы исходного образца, содержат до 5% олеаноловой кислоты.

Хроматограмма гексанового экстракта бересты без пробоподготовки представлена на рисунке 3. Относительное содержание бетулина в данном случае составляет 59,4%. Идентификация бетулина при сравнении с базой данных библиотеки масс-спектрометра была проведена с хорошей вероятностью. Основным ионом, совпадающим с его молекулярной массой, является m/z 442. Идентифицирующим фрагментом, который получается при отщеплении спиртовой группы в положении 28, является фрагмент с m/z 411. Характер фрагментации исследуемого вещества (m/z 69, 81, 95, 107, 189, 207) явно свидетельствует о принадлежности данного соединения к лупановому ряду. Другим идентифицированным соединением является лупеол, с молекулярной массой 426, относительное содержание которого в ГЭБ составляет 32%. При отщеплении ме-тильной группы в положении 28 образуется фрагмент с m/z 411, кроме него идентифицированы фрагменты лупеола с m/z 69, 81, 95, 107, 189, 207.

В таблице 1 приведены идентифицированные соединения гексанового экстракта бересты без предварительной пробоподготовки. Кроме бетулина и лупеола, в экстракте присутствуют другие соединения лупано-вого ряда и фитостерины, относительное содержание которых составляет от 0,6 до 2,5%. Среди минорных примесей были идентифицированы по масс-спектрам альдегиды бетулина и лупеола с молекулярной массой 440 и 424 соответственно (пики 4 и 5 на рис. 3), p-ситостерол с молекулярной массой 414. Компоненты с молекулярной массой 426, вероятно, являются изомерами лупеола (пики 3, 6 и 7 на рис.3). Фрагментация этих соединений характерна для тритерпенов лупанового ряда, в их спектрах обнаруживаются фрагменты с m/z 95, 81, 69, 107, 189, 207 и 411.

CH2

II

CH2

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

II

h3c—С

H3C—С,

CH2OH

'СН3

HO'

HO'

Н3С^ XH3

H3^ XH3

(А)

Рис. 1. Структурные формулы бетулина (А) и лупеола (Б)

(Б)

50.00 55.00 60.00 <5.00 10.00 75.00 80.00 «5.00 90.00

Время, МИН

5

Ер ЄМЯ, МИН

Рис. 2. Хроматограмма гексанового экстракта Рис. 3. Хроматограмма гексанового экстракта

бересты после предварительной пробоподготовки бересты без пробоподготовки

1 - неидентифицирован; 2 - р-ситостерол;

3, 6, 7 - изомеры лупеола, 4 - альдегид лупеола, 5 - лупеол; 8 - альдегид бетулина; 9 - бетулин

Таблица 1. Относительное содержание основных компонентов гексанового экстракта бересты

Компонент М+ Процент от суммы

Бетулин 442 59,4

Лупеол 426 31,7

Р-ситостерол 412 0,6

Изомер лупеола 426 1,4

Альдегид лупеола 424 2,4

Изомер лупеола 426 0,7

Изомер лупеола 426 0,8

Альдегид бетулина 440 2,5

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Фитостерин 426 0,7

Изучение токсико-фармакологических свойств экстракта бересты

По данным Ю.К. Василенко с соавторами, бетулин является малотоксичным веществом, однако в работе не приводятся точные цифры ЛД50 [12]. Нами была изучена острая токсичность гексанового экстракта бересты по методике Ю.И. Иванова и О.Н. Погорелюка [13] на группах линейных белых мышей обоего пола. ГЭБ вводили внутрижелудочно в виде 10% крахмальной взвеси в дозах от 1000 до 7000 мг/кг. Токсичность оценивали по клиническим симптомам отравления и выживаемости животных в течение 2-х недель. Показатели острой токсичности ГЭБ и бетулина приведены в таблице 2. При внутрижелудочном введении ГЭБ в дозах от 1000 до 6000 мг/кг гибели животных не отмечено, у животных наблюдалось только незначительное угнетение центральной нервной системы (ЦНС). При введении ГЭБ в дозе 7000 мг/кг отмечена гибель части животных, в картине острого отравления наблюдалось нарушение дыхания и снижение двигательной активности.

Проведенное токсикологическое исследование показало, что гексановый экстракт бересты не является ядовитыми и согласно международной токсикологической классификации относится к 4-му классу малотоксичных веществ.

Повышение проницаемости сосудистой стенки, в том числе и капилляров, является одним из патогенетических этапов вирусных, бактериальных, аллергических, аутоиммунных, эндокринных и других заболеваний. Следовательно, изыскание веществ растительного происхождения, обладающих высокой капилляро-протекцией и при этом практически не токсичных для организма, позволит улучшить патогенетическое лечение очень многих заболеваний.

Таблица 2. Основные показатели острой

токсичности гексанового экстракта бересты

Вещество Показатели токсичности, мг/кг

ЛД16 ЛД50

ГЭБ 5750 >7000

Изучение влияния ГЭБ и бетулина на проницаемость сосудов кожи проводили по методу Ойвина и Монаковой на группах линейных белых мышей массой 15-17 г. Критерием сосудистой проницаемости служило время выхода 1% водного метиленового синего в очаг воспаления, вызываемого нанесением на депили-рованную поверхность кожи 0,05 мл ксилола [14].

Опытным группам мышей (по 15 животных в каждой) за 1 ч до внутрибрюшинного введения 0,25 мл 1% раствора метиленового синего внутрижелудочно вводили исследуемые вещества в дозе 200 и 400 мг/кг в виде 1% спиртового раствора. Контрольной группе мышей за час до введения раствора метиленового синего вводили этиловый спирт. Регистрировали время выделения метиленового синего в очаге воспаления. Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики с применением программы Excel. Для оценки статистической достоверности различий сравниваемых средних величин использовали критерий Стъюдента [15].

Результаты изучения влияния ГЭБ и бетулина на проницаемость сосудов кожи мышей представлены в таблице 3. Эталоном сравнения служил дигидрокверцетин (ДКВ), капилляроукрепляющий эффект которого известен [16].

В контрольной группе животных время выхода метиленового синего составило 14,7±1,5 сек, тогда как в опытных группах мышей, получающих ГЭБ, время выхода метиленового синего оказалось достоверно большим и составило 23,7±3,4 сек, что свидетельствует о проявлении данным экстрактом капилляроукрепляющего эффекта. При этом у ГЭБ обнаружено дозозависимое влияние на проницаемость сосудов, так как при введении мышам дозы 400 мг/кг капилляроукрепляющий эффект существенно выше, чем при введении дозы 200 мг/кг. На основании проведенных исследований выявлено, что ГЭБ проявляет выраженный капилляроукрепляющий эффект, сопоставимый с дигидрокверцетином.

Таблица 3. Влияние ГЭБ на проницаемость сосудов кожи мышей

Вещество Доза, мг/кг Время выхода метиленовой сини, сек* Капилляроукрепляющий эффект, разница в % от контроля

Контроль - 14,7±1,5 -

200 23,7±3,4 60,5

ГЭБ 400 29,8±4,2 102,7

ДКВ 100 21,5±2,6 33,9

300 25,4±2,8 77,7

*р<0,05 по отношению к контролю Выводы

Изучен химический состав гексанового экстракта бересты березы с использованием хромато-масс-спектрометрии: идентифицированы бетулин, лупеол, альдегиды бетулина и лупола и ситостерол.

Установлено, что гексановый экстракт бересты не является ядовитым и, согласно международной токсикологической классификации, относится к 4 классу малотоксичных веществ. Среднесмертельная доза (ЛД50) гексанового экстракта бересты составляет более 7000 мг/кг.

Показано, что ГЭБ проявляет выраженную дозозависимую капилляроукрепляющую активность, сопоставимую с дигидрокверцетином.

Список литературы

1. Кузнецов Б.Н., Рязанова Т.В., Щипко М. Л., Кузнецова С.А. и др. Оптимизация термических и биохимических методов утилизации отходов экстракционной переработки березовой коры // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. Т. 13. С. 441-449.

2. Кузнецова С.А., Левданский В.А., Кузнецов Б.Н., Щипко М.Л. и др. Получение дубильных веществ, красителей и энтеросорбентов из луба березовой коры // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. Т. 13. С. 401409.

3. Кузнецов Б.Н., Кузнецова С.А., Левданский В.А., Судакова И.Г., Веселова О.Ф. Совершенствование методов выделения, изучение состава и свойств экстрактов березовой коры // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. Т. 13. С. 391-400.

4. Кислицын А.Н. Экстрактивные вещества бересты: выделение, состав, свойства, применение // Химия древесины. 1994. № 3. С. 3-28.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

5. Ukkonen F.K., Era V.P. Birch bark extractives // Kemia-Kemi. 1979. №5. С. 217-220.

6. Похило Н.Д., Уварова Н.И. Изопреноиды различных видов betula // Химия природных соединений. 1988. №3.

С. 325-341.

7. Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстиков А.Г. Бетулин и его производные // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. Т. 13. С. 1-30.

8. Флехтер О.Б., Медведева Н.И., Карачурина Л.Т., Балтина Л.А. и др. Синтез и фармакологическая активность эфиров бетулина, бетулиновой кислоты и аллобетулина // Химико-фармацевтический журнал. 2005. Т. 39. №8. С. 9-13.

9. Флехтер О.Б., Бореко Е.И., Нигматулина Л.Р., Павлова Н.И. и др. Синтез и противовирусные свойства производных лупановых тритерпеноидов // Химико-фармацевтический журнал. 2004. Т. 38. №8. С. 10-13.

10. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А., Толстиков А.Г., Флехтер О.Б. Терпеноиды ряда Лупана -

биологическая активность и фармакологические перспективы // Биоорганическая химия. 2006. Т. 32. №1.

С. 42-55.

11. Кейтц М. Техника липидологии. М., 1975. 322 с.

12. Василенко Ю.К., Семенченко В.Ф., Фролова Л.М. Фармакологические свойства тритерпеноидов коры березы // Экспериментальная и клиническая фармаколология. 1993. Т. 56. №4. С. 53-55.

13. Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н. Вычисление эффективных и летальных доз методом наименьших квадратов на микрокалькуляторах по программам // Фармакология и токсикология. М., 1986. 9 с.

14. Патент РФ № 2014841 Антиоксидантное, капилляропротекторное, противовоспалительное и антигистаминное средство / Соколов С.Я., Тюкавкина Н.А., Колхир В.К. // БИ. 1994. №12.

15. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1980. 296 с.

16. Патент Р.Ф. № 2045957. Способ получения средства, обладающего противоязвенным действием / Пашинский В.Г., Чучалин В.С., Рапп О. А. // БИ. 1995. №29

Поступило в редакцию 15 марта 2007 г.

После переработки15 января 2008 г.