CC BY
53
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ТАММ-ХОРСФАЛЛ ПРОТЕИНА В ПАТОГЕНЕЗЕ ВОСХОДЯЩЕЙ УРОИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ Е. COLI
А.В. Ружанская, Э.Г. Кравцов, М.В. Далин, О.В. Короткова
Кафедра микробиологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, 117198 Москва, Россия
Охарактеризованы музейные и клинические штаммы Е. coli по способности Тамм-Хорсфалл протеина (ТХП) блокировать их адгезию к разным клеткам-мишеням. Создана тест-система для количественного определения Тамм-Хорсфалл протеина в моче и детекции аутоантител на ТХП в сыворотке крови. Система испытана на образцах мочи людей, не имевших почечной патологии, у беременных женщин, а также у доноров и реципиентов почечного трансплантата. С помощью антигенного диагностикума у этих групп охарактеризована антителопродукция к ТХП.
Ключевые слова: Тамм-Хорсфалл протеин, восходящая уроинфекция, тест-система.
Гликопротеин, обнаруженный в моче здорового человека в 1950 г. исследователями I. Ташш и F. Horsfall и впоследствии обозначаемый в их честь как Тамм-Хорсфалл протеин (ТХП) [6], синтезируется эпителиальными клетками восходящего отдела петли Генле. ТХП локализуется во всех сегментах петли Генле, на эпителиальных клетках дистальных канальцев со стороны просвета, в гломерулярном пространстве и экскретируется за сутки с мочой в количестве от 50 до 244 мкг/мл.
Основная молекулярная форма ТХП представляет собой нитевидную высоко-гликозилированную молекулу в 80 кДа, на углеводную часть которой приходится до 1/3 от общей массы [1].
В 1980 Orskov и соавт. [5] показали связывание ТХП с фимбриями I типа Escherichia coli. Была выдвинута гипотеза, согласно которой уропатогенные микроорганизмы, связанные с ТХП, не в состоянии колонизовать уроэпителий, что препятствует в итоге развитию восходящей уроинфекции [3].
На сегодняшний день Е. coli определена как один из основных этиологических факторов заболеваний мочевыводящего тракта у человека. В 70-90 % случаев она является причиной цистита, уретрита, пиелонефрита. Фактором, предопределяющим потенциальную патогенность Е. coli, служит адгезия микроорганизмов к клеткам-мишеням, реализуемая микробами с помощью фимбрий. Среди представителей семейства Enterobacteriaceae выделяют два основных типа адгезинов (фимбрий): чувствительных к D-маннозе (МЧ) и устойчивых к ней (МУ). МЧ-фимбрии (фим-брии первого типа) характерны для штаммов Е. coli, выделенных из кишечного содержимого. МУ тип включает варианты, несущие на своей поверхности несколько различных видов фимбрий (Р-фимбрии, S-фимбрии, фимбрии 3-го типа), характерных для уропатогенных штаммов [2].
Имея в своем углеводном составе маннозные и галактозные окончания, ТХП обладает способностью связывать фимбрии Е. соН, препятствуя тем самым их адгезии на клетках-мишенях.
Мы, в своей работе попытались выяснить, способен ли ТХП блокировать адгезивную активность изолятов Е. соН, различающихся по происхождению (уропато-генные или же выделенные из кишечного содержимого). В качестве модели, для исследования адгезивной активности Е. соН и блокирующего действия ТХП, нами были взяты эритроциты барана (ЭБ), морской свинки (ЭМС) и дрожжи (Д) (Бас-саготусея сегеу1.51ае).
Мы охарактеризовали 12 музейных референс-штаммов Е. соН (5 кишечных и 7 уропатогенных) в реакции прямой агглютинации (РПА) с ЭБ, ЭМС и Д. Кроме того, штаммы оценивались по степени блокирования ТХП, маннозой и галактозой в РПА, которая выступала в качестве индикаторной системы и осуществлялась с использованием двух моносахаридов и ТХП. Блокада РПА осуществлялась по ранее описанной методике [6]. Для торможения РПА использовали предварительно оттитрованную дозу ТХП, равную 400 мкг/мл.
Е. соН кишечного происхождения (5 изолятов) не агглютинировали ЭБ, но давали относительно высокие показатели в РПА с Д; с ЭМС наблюдалась средняя степень агглютинации. Уропатогенные (остальные 7 изолятов) Е. соН агглютинировали ЭБ и показывали относительно низкую степень агглютинации с Д и ЭМС. ТХП более интенсивно блокировал адгезию кишечных штаммов Е. соН на Д и ЭМС по сравнению с уроизолятами. При анализе способности ТХП ингибировать адгезию уропатогенных штаммов на разных клетках-мишенях, более низкая степень блокирования наблюдалась на ЭБ.
Нами были поставлены аналогичные опыты с 12 клиническими штаммами, 6 из которых являлись уроизолятами и 6 - кишечного происхождения.
Сравнивая агглютинационные свойства референс- и клинических штаммов Е. соН, последние удалось охарактеризовать по типу адгезинов. При этом среди изолятов Е. соН, выделенных из кишечника, были обнаружены два, по типу адгезинов сходные с музейными уропатогенными вариантами.
Степень блокирования агглютинации уропатогенных и кишечных штаммов ТХП была максимальной в модельных опытах с ЭМС. При постановке РПА на Д индекс блокирования (ИБ), т.е. отношение титра РПА контроля к опыту, был выше у кишечных штаммов (ИБ=5); РПА уропатогенных штаммов блокировалась со средним ИБ=3.
Из приведенных данных следует, что колонизация клеток-мишеней Е. соН с фенотипом адгезинов, характерным для кишечного варианта, может быть эффективно блокирована ТХП, в то время как уроварианты уклоняются от связывания ТХП. Таким образом, из общей популяции Е. соН, попавшей в мочевыводящий тракт, низкоблокирующиеся ТХП варианты имеют преимущество в адгезии перед высокоблокирующимися и могут селекционироваться из контаминирующей флоры. Следует учесть, что такой отбор возможен в том случае, когда ТХП как селективный фактор действует только в определенном диапазоне концентраций, то есть в тех случаях, когда его содержание в моче становится ниже физиологической нормы. При условии, что ТХП блокирует адгезию Е. соН на уроэпителии, можно было предположить, что антитела (АТ) к этому белку, связываясь с ним, должны снимать блокирующий эффект ТХП. Действительно было показано, что если в систему Е. соИ —■ ТХП — клетка-мишень ввести специфические кроличьи АТ к ТХП, ингибирующее действие этого белка на адгезию к клетке-мишени отменяется, т.е. связан-
ный ТХП не препятствует адгезии [3]. Вероятность такой ситуации в организме становится значимой в том случае, если в крови идет продукция аАТ к данному белку.
ТХП является секвестрированным антигеном и, несмотря на отсутствие к нему толерантности, аутоиммунный ответ к этому антигену в норме исключен. В то же время, при патологическом процессе информация о ТХП становится доступна им-мунокомпетентным клеткам и, как следствие, в крови могут накапливаться аутоАТ (аАТ), что может стать причиной снижения секреции ТХП.
С помощью тест-системы в реакции нейтрализации АТ (РНАТ) нам удалось определить концентрацию ТХП в нативной моче людей 3 групп: средний его уровень протеина в утренних образцах клинически здоровых людей составил 574 + 86 мкг/мл; у реципиентов после операции по поводу трансплантации почки — 506 + 94 мкг/мл; у беременных женщин 912 +112 мкг/мл. Статистически значимое увеличение концентрации ТХП отмечено в группе беременных женщин.
При постановке РНАТ нами выявлено наличие аАТ к ТХП в сыворотке крови у части обследованных и выведен диагностический титр, равный ^ 2,3. В группе клинически здоровых людей процент серопозитивных случаев был достоверно ниже, чем в остальных группах. В группе беременных женщин все сыворотки были позитивными, однако уровень аАТ к ТХП не превышал диагностически значимого. В то же время в группе реципиентов почечного трансплантата этот показатель составил 2,7 + 0,2.
Максимальный титр аАТ к ТХП наблюдали у реципиентов, перенесших аллотрансплантацию трупной почки сроком менее полугода; он составил 1§ 2,8+ 0,2. В дальнейшем на протяжении следующих 6 месяцев титр аАТ несколько снижался, но оставался выше диагностического уровня. 1^ титра в группе реципиентов после родственной аллотрансплантации, перенесенной менее, чем за 6 месяцев до исследования, оказался несколько меньше (1^ 2,4+0,1), чем в аналогичной группе после аллотрансплантации трупной почки, однако и в этом случае он был выше диагностического.
Приведенные данные позволяют заключить, что операция по пересадке почки, начинающаяся с нефрэктомии, сопровождается индукцией аутоиммунного ответа к ТХП.
Динамина титров АТ в крови доноров до и после
1д титра нефрЭКТОМИИ
Рис 1.
Оставалось, однако, не ясным, в какой степени именно нефрэктомия может индуцировать выработку аАТ к ТХП.
Более подробное изучение этого вопроса было проведено нами в нескольких клинических случаях, когда почку для пересадки реципиентам давали доноры -родственники. Было решено во всех этих случаях провести мониторинг за изменением титра аАТ к ТХП в крови у этих доноров (по сравнению с титром, зарегистрированным перед опреацией по удалению почки). Всего под наблюдением было 4 донора. Результаты, полученные в ходе мониторинга, представлены на рис. 1, откуда следует, что у всех обследованных до операции титр аАТ не превышал диагностический, тогда как после седьмого дня отмечался резкий подъем уровня аАТ, который сохранялся на высоких цифрах в течение месяца с момента хирургического вмешательства. К концу этого периода титр незначительно снижался, оставаясь, при этом, выше диагностического.
Более продолжительные исследования были выполнены на группе реципиентов. Наибольшее число серопозитивных случаев (95%) мы наблюдали в период 7-21 дня после операции. Максимально высокие показатели титра аАТ к ТХП выявлялись в первый-второй месяц после трансплантации; начиная с 3 месяцев титр достоверно снижался, но оставался выше, чем у клинически здоровых людей.
Отмечено, что у лиц с высоким титром аАТ к ТХП уменьшается уровень секреции этого белка с мочой. При проведении статистического анализа установлена выраженная корреляционная связь между концентрацией ТХП и титрами аАТ к нему (г=0,7). В опубликованных ранее данных мы отмечали, что связывание ТХП аАТ отменяет его блокирующее действие на адгезию Е. соН [4]. Следовательно, снижение уровня этого белка, опосредованное появлением аАТ, снижает защиту мочевыводящего тракта от колонизации Е. соН, т.е. такие пациенты включаются в группу риска развития восходящей уроинфекции.
ВЫВОДЫ:
1. В кишечной субпопуляции Е. соН встречаются варианты, сходные по фенотипу адгезинов с уропатогенными.
2. Штаммы Е. соН, высевающиеся из мочи, блокируются ТХП слабее, чем кишечные изоляты, что может рассматриваться как один из факторов риска в развитии восходящей уроинфекции.
3. Индукция аАТ к ТХП отменяет протективное действие ТХП по отношению к колонизации Е. соН мочевыводящих путей.
4. При операции на почках физиологическая защита от уроинфекции, индуцируемая ТХП, может нарушаться за счет снижения его секреции.
ЛИТЕРАТУРА
Х.Дранник В.Г., Майданник Г.Н. Белок Тамма-Хорсфалла: патогенетическая роль и клиническое значение при урологических и нефрологических заболеваниях // Урология и нефрология. — 1990. — № 5. — С. 69-74.
2. Тринчина Е.В. Структурно-функциональный анализ адгезивной вариабельности пилей первого типа уропатогенных штаммов Е. соН: Автореф. дисс... канд. мед. наук. — М., 2003.
3. Ружанская А.В., Миленина О.Е., Кравцов Э.Г., Далин М.В., Габриэлян Н.И. Методические подходы к определению Татт-НогэГаП протеина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2005. — № 9. — С. 316-319.
4. Ружанская А.В., Кравцов Э.Г., Долин М.В., Габриэлян Н.И. Исследование антителопродукции к Tamm-Horsfall протеину у доноров и реципиентов почечного трансплантата // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2006. — № 5. — С. 559.
5. Orskov L., Ferencz A., Orskov F. Orskov I, Ferencz A, Orskov F. Tamm — Hors-fall protein or uromucoid is the normal urinary slime that traps type I fimbriated Escherichia coli. Lancet 1980; 1:887 //Lancet. — 1980. — Vol. 1. — P. 887.
6. Tamm L, Horsfall F. A mucoprotein derived from human urine which reacts with influenza, mumps, Newcastle disease viruses // J. Exp. Med. — 1952. — Vol. 95. — P. 71.
STUDIES OF THE ROLE OF TAMM-HORSFALL PROTEIN IN PATHOGENESIS OF ASCENDING URINARY TRACT INFECTION, CAUSED BY E. COLI
A.V. Ruzhanskaya, E.G. Kravzov, M.V. Dalin, O.V. Korotkova
Department of Microbiology Peoples’ Friendship University of Russia Miklukho-Maklaya st., 8, 117198 Moscow, Russia
We have characterized museum and clinical E. coli strains to ability of Tamm-Horsfall protein (THP) inhibits their agglutination to different cell targets. It has been elaborated the test-system for the quantitative measurment of THP in urine for the detection of autoantibodies to THP in blood serum. This system was tested with urine samples of humans without kidney pathology, at pregnant women, donors and recipients of kidney transplantate. It has been characterized an autoantibodies production to THP for these groups of patients.
