CC BY
42
© Коллектив авторов, 2010 г. УДК 616.62-037-08-084
B. Л. Эмануэль, С. Х. Аль Шукри,
C. Б. Ланда, А. Б. Чухловин,
Е. Т. Голощапов, Ю. В. Эмануэль, Н. А. Лисовая, М. Г. Залеский, М. И. Горбачёв, Н. О. Шабудина, Н. А. Плеханова, А. А. Люблинская, О. С. Напалкова, Е. В. Аплина, М. А. Коваленко
ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯР-НО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ РАЗВИТИЯ МОЧЕКАМЕННОЙ БОЛЕЗНИ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МИШЕНЕЙ ДЛЯ ЕЕ ТЕРАПИИ И ПРОФИЛАКТИКИ
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова; Петербургский институт ядерной физики имени Б. П. Константинова РАН; ООО «Санаторий (курорт) «Краинка» Тульской области; Сибирский государственный медицинский университет
Мочекаменная болезнь (МКБ) является важной проблемой во всех странах мира, о чем свидетельствует пристальное обсуждение этой темы на всемирных, европейских, национальный конгрессах и симпозиумах урологов. По данным Coe et al. (2005), МКБ развивается на протяжении жизни примерно у 5 % женщин и 12 % мужчин, и имеется тенденция к росту заболеваемости. Особенно тревожной остается ситуация с рецидивным камнеобра-зованием, составляющим 42,0-50,0 %.
Развитие МКБ связано с физико-химическими процессами, при которых в результате превышения концентрации солей над порогом их растворимости в почечном фильтрате начинается образование кристаллов в моче-выводящей системе и их постепенный рост. Это свидетельствует о значительном ослаблении у больных МКБ тех механизмов, которые в норме защищают от выпадения нерастворимый конкрементов: цитраты, белки мочи, ингибирующие камнеобразование - остеопонтин, фрагмент протромбина F1, интер-альфа-трипсин, кальграну-лин и, в особенности, белок Тамма-Хорсфалла. В целом у пациентов с МКБ присутствует выраженный сдвиг кри-сталлостаза мочи - интегрального параметра, являющегося новым компонентом гомеостаза и отражающего кристаллогенную стабильность данного биосубстрата.
В то же время недостаточно изучена роль бактериальной флоры в камнеобразовании. Показано, что уреазо-позитивные штаммы бактерий Proteus mirabilis, Cory-nebacterium urealyticum и других способствуют повышению концентрации солей аммония и повышению рН мочи, что ведет к повышенному риску формирования
оксалатнык и струвитнык камней. Особого внимания заслуживает Proteus mirabilis, который может образовытаты биопленки, особенно - на поверхности мочевых катетеров. Интенсивный рост протея приводит к быстрому осаждению калыциевых конкрементов в просвете катетера и появлению потенциалыного источника восходящей мочевой инфекции. Весыма перспективным представляется исследование биологической роли других известных микроорганизмов как факторов защиты от уролитиаза. К ним относится, в частности, Oxalobacter formigenes, которая, находясы в кишечнике, вызывает расщепление оксалата и тем самым снижает его уровены в экскретах организма, в том числе и в моче. Экспериментальное применение подобный бактерий с целыю реколонизации организма (например, после антибиотикотерапии), наряду с сокращением оксалатов в диете, может статы важным средством профилактики камнеобразования в мочевой системе.
Эти данные могут быты существенно дополнены с позиций нового, более общего понятия - феномена микро-организмассоциированного кристаллогенеза в различных биосистемах. Имеющиеся в этой области первичные сведения позволяют предположиты возможносты управления этими процессами. Последнее обстоятелыство представляется особенно актуалыным, так как в настоящее время отсутствует единая система метафилактики камнеобра-зования при МКБ.
Малоизученной остается возможная ролы функцио-налынык генный вариантов в патогенезе МКБ. У болыных МКБ выявлена разная частота генотипов почечного на-трий-цитратного транспортного белка, остеопонина, гена рецептора витамина D (VDR), повышающий цитратурию, гена калыций-транспортирующего мембранного белка кишечника TRPV6 по сравнению с лицами, не страдающими этим заболеванием. Следует, однако, отметиты, что подобные исследования пока проводилисы, главным образом, в азиатских популяциях, они носят единичный характер и требуют подтверждения при обследовании населения России (как среди здоровый, так и болыных МКБ).
Важные стабилизирующие и антибактериалыные функции имеет мочевой белок Тамма-Хорсфалла (БТХ), который, в частности, связывает маннозозависимые фимб-рии бактерий и блокирует контакты E. coli с клетками уротелия. В настоящее время ведется поиск возможных генный мутаций белковой части БТХ и ферментов глико-зилирования этой молекулы. Изоэлектрическая точка чрезвычайно низкая (pI = 3,21), что связано с болышим количеством остатков сиаловых кислот - около 5 % по массе. Локализуется БТХ в дисталынык каналыцах нефро-на. Суточная продукция БТХ не превышает 50-150 мг. Определение молекулярного веса нативного БТХ разными авторами (и разными методами) давало разные значения: от 1,5 MD до 28 MD. С исполызованием различных биофизических методов, таких как вискозиметрия, центрифугирование в градиенте и индикатрисное светорассеяние, быио показано, что БТХ в различных условиях может существует в четырех олигомерных формах.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
Основная форма, названная авторами Т&НЕ(7), имеет молекулярный вес 7 МБ и представляет собой гибкую нить диаметром 4-5 нм и длиной 600 нм с гидродинамическим радиусом 102,4±3,56 нм [17]. Формируется эта форма при соединении двух цепей Т&НБР, которая состоит из двух одинаковый гибких линейнык олигомернык цепей того же диаметра 4-5 нм и длиной 300 нм.
Форма Т&НБР неустойчива и легко распадается на две части, обозначаемые авторами как Т&НЕ>БР. Эти части одинаковы по молекулярному весу (1,7 МБ) и размерам (4x150 нм) и отличаются только поверхностным зарядом.
При повышении ионной силы раствора форма Т&НЕ(7) образует еще одну полимерную форму Т&НЕ(28), состоящую из 4 нитей Т&НЕ(7). Такой тетра-мер Т&НЕ(7) имеет молекулярную массу 28 МБ, ширину 8-10 нм, длину 1200 нм и гидродинамический радиус 500 нм. Эта форма плохо растворима и склонна к образованию коацерватов - слоев раствора с высоким содержанием полимера. При низкой концентрации БТХ, недостаточной для образования полимерного слоя, в растворе образуются мицеллы с гидродинамическим радиусом 2000-3000 нм.
Многие авторы отмечают, что БТХ у здоровых людей и у больных уролитиазом (МКБ) отличаются. В первую очередь, подчеркивается важная роль сиаловых кислот. В серии исследований быио показано, что ингибирова-ние роста кристаллов в нормальной моче обусловлено, в основном, наличием в моче олигомерных форм БТХ, что связано с его полианионной структурой [13, 20].
Итак, в настоящее время диагностика МКБ проводится в стадии отчетливых клинических проявлений по результатам ультразвукового и других методов визуализации. В связи с поздней диагностикой уролитиаза, его лечение включает меры по измельчению мочевых камней (литотрипсию) или их удалению хирургическим путем. Это сложное и дорогостоящее лечение является дополнительным фактором социальной значимости этой проблемы.
Иначе говоря, в настоящее время отсутствует комплексная технология исследования МКБ на молекулярно-биологическом уровне с применением интегральных постгеномных технологий, в том числе протеомики и метаболомики, и методов медицинской информатики. Ранняя, доклиническая диагностика уролитиаза позволит своевременно применить превентивные лечебные меры, снижающие риск развития мочекаменной болезни и меры метафилактики камнеобразования у больных рецидивирующим нефролитиазом.
Целью научного проекта, в реализацию которого вовлечены коллективы различных организаций, является изучение молекулярный механизмов развития МКБ для разработки метода диагностики на доаналитической стадии и алгоритма фармакологической модификации ее течения.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Группа пациентов с МКБ формировалась из лиц, наблюдающихся в специализированном урологическом от-
делении клиники Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова. Верификация диагноза проводилась, на основании комплекса клинических признаков, данный инструментального обследования, включающего ультразвуковое исследование, внутривенную урографию и, при показаниях, компьютерную спиральную томографию. Кроме того, проводился весь комплекс лабораторной диагностики по оценке мочевого синдрома, функционального состояния почек и наличия инфекции мочевы делительного тракта. Обязательным условием включения быто добровольное согласие обследованный людей.
Группа больных МКБ составила 30 человек (14 женщины, 16 мужчины) в возрасте 25-60 лет. У всех больных мочекаменной болезнью быт хронический пиелонефрит в латентной фазе. Группа сравнения быта сформирована из 20 практически здоровых добровольцев и быта сопоставима с группой обследованных по полу и возрасту.
Комплексное исследование, выполненное с участием разнообразный возможностей участников проекта, включало:
- метод динамического светорассеяния, который позволяет получать гистограммы распределения частиц по размерам в диапазоне от единиц нанометров до десятков микрон при сохранении нативных свойств биосубстратов;
- функциональную морфологию биологических жидкостей при фазовом переходе веществ из растворенного состояния в твердое с формированием определенных аморфных, кристаллических и псевдокристаллических структур с визуальной морфометрией;
- методы атомно-силовой микроскопии;
- ДНК-диагностику для количественной оценки патогенных микроорганизмов;
- биохимические и иммунохимические (Beckman Coulter) анализаторы;
- современные методы медицинской информатики Data mainig.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Верификация БТХ показала отсутствие в моче боль-нык МКБ олигомерной формы T&HE(7) диаметром около 200 нм, характерных для здоровых лиц, и присутствие формы T&HE(28) как в свободном состоянии, так и ее агрегатов с кристаллами оксалатов и уратов размером порядка микрона и более. Это согласуется с данными о том, что сиалированныгй БТХ ингибирует развитие МКБ, а БТХ с недостатком сиаловык кислот является ее промотором. Нами выщвинута гипотеза, заключающаяся в том, что за счет отрицательного заряда олигомерная форма T&HE(7) создает в моче структуру типа «коллоидного матрикса», препятствующую слипанию и росту микрокристаллов оксалатов, т. е. развитию МКБ. В случае потери зарядов, в силу различных причин (вероятнее всего, десиалирования), при уменьшения рН и возрастании ос-момолярности мочи происходит полимеризация формы
T&HE(7) до состояния T&HE(28), которая образует фила-менты и «пучки», составляющие основу гиалиновых цилиндров. При взаимодействии с кристаллами оксалатов и уратов эта форма образует нерастворимые конгломераты, которые служат центрами кристаллизации, и, таким образом, БТХ становится промотором МКБ.
С целью исследования динамики распада олигомеров БТХ от изначальных форм T&HE(7) и T&HE(28) и определения отличий этого процесса в образцах БТХ, выделенных из мочи здоровых людей, от людей, страдающих МКБ, было использовано действие 6М-гуанидина, разрушающего нековалентные связи, что приводит к распаду оли-гомеров и других белковых комплексов до мономеров. Было выявлено, что в динамике деградации олигомерных форм БТХ можно выделить две отчетливо различающиеся стадии:
1) короткая стадия, длящаяся в течение 5 минут, - распад форм T&HE(7) и T&HE(28) до T&HE®DF;
2) продолжительная стадия, длящаяся в течение 4 часов, - деградация форм T&HE®DF до мономеров.
Наиболее затрудненной оказалась деградация крупных устойчивых агрегатов формы T&HE(28) с кристаллами оксалатов и уратов. Иначе говоря, именно эти агрегаты могут служить ядрами для роста почечных конкрементов.
Переход от олигомерной формы T&HE(7) к форме T&HE(28) зависит от ионной силы раствора. У людей, страдающих мочекаменной болезнью, этот переход осуществляется при гораздо более низкой ионной силе, чем у контрольной группы.
Методом ПЦР-диагностики Proteus mirabilis и Corynebacterium urealiticum было показано существенное повышение частоты C. urealiticum в мочевых осадках у больных с МКБ по сравнению со здоровыми лицами, что может быть существенным фактором патогенеза МКБ, особенно у лиц старших возрастов. У пациентов, инфицированных Proteus mirabilis, отмечается достоверное снижение скорости клубочковой фильтрации и про-теинурия.
Совокупность данных концептуального характера позволила провести эмпирическое изучение возможности изменения уровня активности кристаллообразования под действием химических факторов. Так, в образцах мочи с активным процессом кристаллообразования после добавления к ним уксусной кислоты в 95,4 % формировалась белковая краевая зона, характерная для мочи без кристаллообразования.
Предположив, что различные муколитики способны воздействовать на муцин не только в трахеобронхиаль-ном тракте, но и в почках, изучено их влияние в пробах мочи больных с активным камнеобразованием. Результаты экспериментов показали, что внесение в мочу с выраженной активностью кристаллообразования мукалти-на и бромгексина вызывает снижение уровня ее кристал-лообразующей активности. На основании проведенных экспериментальных исследований было изучено действие этих муколитиков на кристаллообразующую активность мочи у пациентов на фоне санаторно-курортного лече-
ния МКБ в условиях курорта «Краинка» Тульской области (при информированном согласии).
Результаты наблюдений за пациентами показали уменьшение активности кристаллообразования в контрольной группе в 50,0 %, а в опытной, где пациенты получали му-колитики, - в 80,0 % случаев (р<0,05). Отсутствие эффекта от лечения в группе пациентов, получавших стандартное санаторно-курортное лечение, было 30,0 %, а в группе получавших муколитики -11,1 % (р<0,05). Усиление активности кристаллообразования выявлено в 20,0 % случаев в контрольной группе и только у 8,9 % пациентов, получавших муколитические препараты (р<0,05).
Таким образом, применение муколитических препаратов, наряду со стандартным санаторно-курортным лечением, у больных с МКБ оказывает достоверное снижение уровня активности кристаллообразования в моче, а в ряде случаев вызывает его полное прекращение.
Резюмируя представленный материал, можно констатировать, что результаты исследований подтверждают ранее высказанную концепцию о механизмах развития МКБ при нарушениях формирования БТХ, его сиалиро-вания, проявляющихся при сочетании гиперосмолярно-сти мочи и наличии рН, оптимальной для кристаллизации оксалатов, формирование которой может быть обусловлено и инфицированием мочевых путей уреазо-позитивной микрофлорой. Гиперполимеризация модифицированных форм БТХ, инициурующая кристаллоге-нез, может быть верифицирована биофизическими технологиями (кристаллография, лазерная корреляционная спектроскопия), что позволяет проводить донозологичес-кую диагностику. Апробированная технология деполимеризации макромолекулярных структур БТХ открывает путь для целенаправленной фармакотерапии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аляев, А. В. Мочекаменная болезнь / А. В. Аляев, Р. Г. Григорян, А. И. Рудина. - М. : Литера, 2007. - 80 с.
2. Залеский, М. Г. Клинико-лабораторная информативность исследования процесса структуризации капель мочи и других биологических жидкостей : автореф. дис. канд. мед. наук / М. Г. Залеский. - СПб., 2006. - 35 с.
3. Консервативное лечение мочекаменной болезни : пособие для врачей / под ред. И.С. Колпакова. - М. : МИА, 2009. - С. 8-15.
4. Короткова, О. В. Тамма-Хорсфалла протеин как маркер поражения почек у больных пожилого и старческого возраста с внебольничными пневмониями : автореф. дис. канд. мед. наук / О. В. Короткова. - СПб., 2008. - 28 с.
5. Ланда, С. Б. Применение метода динамического свето-рассеивания для исследования обратимых мегамолекулярных комплексов белка Тамма-Хорсфалла и их роли в ранней диагностике уролитиаза / С. Б. Ланда [и др.] // Клинико-лабораторный консилиум. - 2008. - № 6. - С. 33-38.
6. Ланда, С. Б. Роль белка Тамма-Хорсфалла в развитии мочекаменной болезни / С. Б. Ланда [и др.] // Клинико-лабораторный консилиум. - 2008. - № 3. - С. 35-38.
7. Лисовая, Н. А. Лабораторные подходы к выявлению мочекаменной болезни. Доклиническая диагностика у детей / Н. А. Лисовая // Terra medica. - 2001. - № 3. - С. 50-56.
8. Максимов, С. А. Морфология твердой фазы биологических жидкостей организма как метод диагностики в медицине /
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
С. А. Максимов // Бюллетень сибирской медицины. - 2007. -№ 4. - С. 80-83.
9. Применение лазерной корреляционной спектроскопии для исследования субфракционного состава мочи у больных сахарным диабетом 2 типа : пособие для врачей / под ред. С. Б. Шустова и В. Л. Эмануэля. - СПб., 2004. - 27 с.
10. Чухловин, А. Б. Факторы патогенеза и лабораторная диагностика мочекаменной болезни / А. Б. Чухловин, Ю. В. Эмануэль // Клинико-лабораторный консилиум. - 2009. - № 7. - С. 56-58.
11. Чухловин, А. Б. Факторы солевого баланса и возможная генетическая предрасположенность в развитии мочекаменной болезни / А. Б. Чухловин // Клинико-лабораторный консилиум. -2009. - № 1. - С. 26-29.
12. Эммануэль, В. Л. Пособие для семейного врача по лабораторным технологиям и интерпретации исследование мочи / В. Л. Эмануэль. - СПб. ; Тверь : Триада, 2007. - 128 с.
13. Carvalho, M. Role of Tamm-Horsfall protein and uromodulin in calcium oxalate crystallization / M. Carvalho, R. A. Mulinari, Y. Nakagawa // Brazilial Journal of Medical and biologyical research. -2002. - Vol. 35. - P. 1165-1172.
14. Cavalione, D. Variation of High-mannose Chains of Tamm-Horsfall Glycoprotein Confers Differential Binding to Type 1-fimbri-ated Escherichia coli / D. Cavalione, N. Malagolini, A. Monti // Jour. of biological chemistry. - 2003. - Vol. 3. - P. 35-86.
15. Honow, R. Influence of grapefruit-, orange-, and apple-juice consumption on urinary variables and risk of crystallization / R. Honow [et al] // J. Nutr. - 2003. - Vol. 90. - P. 295-300.
16. Mo Lan. Ablation of the Structural Gene for Tamm-Horsfall Protein Increases the Susceptibility of Mice to Bladder Colonization by Type 1-fimbriated Escherichia coli / Lan Mo [et al] // Departments Articles in Pres S. Am J Physiol Renal Physiol. - 2003. - Vol. 10. -P. 1152.
17. Oliver, C. J. Determination of the Diffusion Coefficient and Molecular Weight of Tamm-Horsfall Glycoprotein by Intensity Fluctuation Spectroscopy / С. J. Oliver [et al] // Biopolymers. - 1971. -№ 9. - P. 1731-1733.
18. Raffi, H. S. Tamm-horsfall protein protects against urinary tract infection by proteus mirabilis / H. S. Raffi [et al] // J. Urol. -2009. - Vol. 5. - P. 334-335.
19. Serafini-CessiFranca. Tamm-Horsfall Glycoprotein : Biology and Clinical Relevance / Franca Serafini-Cessi, Nadia Malagolini, Daniela Cavallone // Am. Jour. of Kidney Diseases. - 2003. - Vol. 42. - № 4. -P. 658-676.
20. Shigara, H. Inhibition of calcium oxalate crystal growth in vitro by uropontin : Another member of the aspartic acid-rich protein super-family / H. Shigara, // J. Medical Sciences. - Vol. 89. - P. 426-430.
21. Soriano, F. Microbiological and clinical features of Coryne-bacterium urealyticum : urinary tract stones and genomics as the Rosetta Stone / F. Soriano, A. Tauch // Clin. Microbiol. Infect. - 2008. -Vol. 14. - P. 632-643.
22. Stankowska, Dorota. Quantification of Proteus mirabilis virulence factors and modulation by acylated homoserine lactones / Dorota Stankowska, Marek Kwinkowski, Wieslaw Kaca // Jour. of Microbiology, Immunology and Infection. - 2008. - № 4. - P. 243-253.
23. Tamm, I. A mucoprotein derived from human urine which reacts with influenza, mumps, and newcastle disease viruses / I. Tamm, F. L. Horsfall // J. Exp. Med. - 1952. - Vol. 95. - P. 71-97.
РЕЗЮМЕ
В. Л. Эмануэль, С. Х. Аль Шукри, С. Б. Ланда, А. Б. Чухловин, Е. Т. Голощапов, Ю. В. Эмануэль, Н. А. Лисовая, М. Г. Залеский, М. И. Горбачев, Н. О. Шабудина, Н. А. Плеханова, А. А. Люблинская, О. С. Напалкова, Е. В. Аплина, М. А. Коваленко
Исследование молекулярно-биологических факторов развития мочекаменной болезни и идентификация молекулярных мишеней для ее терапии и профилактики
Комплексное исследование биофизических и биохимических характеристик (метод динамического светорассеяния, функциональная морфология биологических жидкостей при фазовом переходе веществ из растворенного состояния в твердое, ДНК-диагностика для выявления патогенных микроорганизмов) мочи 30 больных мочекаменной болезнью и 20 здоровых лиц подтвердило концепцию о механизме развития МКБ при нарушении свойств уропротеина Тамма-Хорсфалла в сочетании с гиперосмолярнос-тью и изменениями рН мочи, а также инфицированием мочевых путей уреазопозитивной микрофлорой. Апробирована технология деполимеризации макромолекулярных изменений уропротеина Тамма-Хорсфалла, которая открывает путь для целенаправленной фармакотерапии.
Ключевые слова: мочекаменная болезнь, биофизическое и биохимическое исследование, белок Тамма-Хорсфалла, уреазо-позитивные микроорганизмы, метафилактика, оксалаты, ПЦР-ди-агностика, кристаллография, фармакотерапия.
SUMMARY
V. L. Emanuel, S. H. Al-Shukri, S. B. Landa, A. B. Chukhlovin, E T. Goloshchapoo, Yu. V. Emanuel, N. A. Lysooaya, M. G. Zaleskyi, M. I. Gorbachev, N. O. Shabudina, N. A. Plekhanooa, A. A. Lub-linskaya, O. S. Napalkooa, E. V. Aplina
Studies of molecular factors predisposing for kidney stone disease and identification of molecular targets for its therapy and prophylaxis
A combined study of urine samples from 30 patients with kidney stone disease (KSD) and 20 matched healthy persons was performed using a variety of biophysical and biochemical parameters (dynamic light scatter analysis, functional morphology of biological fluids upon their phase transition to solid state, DNA diagnostics of pathogenic microorganisms). The data obtained confirmed the conceptual mechanism of KSD development in case of functional changes of Tamm-Horsfall protein, along with hyperosmolarity and altered pH of urine, as well as urinary tract infection with urease-positive microflora. A novel technique of macromolecular depolymerization testing was applied for measuring the Tamm-Horsfall protein changes, thus presuming a potential for a targeted pharmacotherapy.
Key words: kidney stone disease, biophysical and biochemical study, Tamm-Horsfall protein, urease-positive microorganisms, metaphylaxis, oxalates, PCR diagnostics, crystallography, pharmaco-therapy.
