Модуляторы оксалатного нефролитиаза. Ингибиторы кристаллизации Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

© Я.Ф.Зверев, А.Ю.Жариков, В.М.Брюханов, В.В.Лампатов, 2010 УДК 616.63-003.7:621.376]:532.781

Я.Ф. Зверев1, А.Ю. Жариков1, В.М. Брюханов1, В.В. Лампатов1

МОДУЛЯТОРЫ ОКСАЛАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА. ИНГИБИТОРЫ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ

Ya.F. Zverev, A.Yu. Zharikov, V.M. Brukhanov, V.V. Lampatov

MODULATORS OF OXALATE NEPHROLITHIASIS. INHIBITORS' CRYSTALLIZATION

1 Кафедра фармакологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул, Россия

РЕФЕРАТ

Обзор литературы посвящен описанию факторов, препятствующих нуклеации, агрегации и росту кристаллов оксалата кальция. Основными белковыми макромолекулами, ингибирующими образование почечных камней, являются протеин Тамма-Хорсфалла, остеопонтин, бикунин и фрагмент 1 протромбина. В обзоре анализируются особенности структуры и функции данных гликопротеинов, обсуждаются их вероятные механизмы действия и роль в патогенезе мочекаменной болезни.

Ключевые слова: оксалатный нефролитиаз, ингибиторы кристаллизации.

ABSTRACT

Review of the literature focuses on barriers to nucleation, aggregation-navigation and the growth of crystals of calcium oxalate. Main proteins, inhibiting the formation of kidney stones, are protein Tamm-Horsfalla, osteopontin, bikunin and prothrombin fragment 1. In particular, we analyze the-sti structure and function of these glycoproteins, discusses their likely mechanism of action and role in the pathogenesis of urolithiasis.

Key words: оxalate nephrolithiasis, inhibitors of crystallization.

Как известно, нормальная моча человека пересыщена солями и, в первую очередь, оксалатом и фосфатом кальция, способными индуцировать образование почечных камней [1]. Это адаптационный процесс, являющийся следствием гомеостатического сохранения воды в организме. Однако далеко не у всех людей возникает склонность к развитию нефролитиаза. По всей видимости, это в значительной степени обусловлено наличием в моче белковых макромолекул (в основном - гликопротеинов), препятствующих кристаллизации. Многие исследования показали, что нарушение функции этих ингибиторов кристаллизации следует рассматривать как один из пусковых факторов развития нефролитиаза [2, 3]. Поэтому вполне вероятно, что у людей, склонных к образованию почечных камней, имеются определенные количественные или качественные изменения структуры и/или функции этих макромолекул. И действительно, давно показано, что при добавлении ионов ок-салата и кальция к моче пациентов с оксалатным нефролитиазом процесс кристаллизации происходит более активно, чем в моче здоровых людей, а

Зверев Я.Ф. Алтайский медицинский университет. 656038, г.Бар-наул, пр.Ленина, 40, тел. (3852) 26-08-35, [email protected]

добавление нормальной мочи в значительной степени ингибирует адгезию кристаллов оксалата кальция к культивируемым почечным клеткам [4, 5].

Данный обзор литературы посвящен роли основных белковых макромолекул, ингибирующих кристаллизацию оксалата кальция, к каковым относятся протеин Тамма-Хорсфалла (THP), остеопонтин (OPN), бикунин и фрагмент 1 мочевого протромбина.

Протеин Тамма-Хорсфалла

История изучения протеина Тамма-Хорсфалла (в оригинальной транскрипции Tamm-Horsfall protein, THP) берет начало с 1950 г., когда американские исследователи I.Tamm и F.L.Horsfall выделили из человеческой мочи мукопротеин, обладающий способностью ингибировать гемагглю-тинацию вирусов [6]. Оказалось, что этот протеин принимает участие во многих патологических процессах в почках, в том числе играет важную роль в патогенезе нефролитиаза [7, 8]. На протяжении всех этих десятилетий перед научным сообществом стоит вопрос: в чем же в действительности заключается эта роль? К сожалению, однозначного и исчерпывающего ответа по-прежнему нет. Одни авторы считают, что ТХП защищает почеч-

ные канальцы от адгезии кристаллов, другие - приводят экспериментальные доказательства обратного, т.е. позиционируют ТХП в качестве стимулятора камнеобразования. Как часто бывает, истина, по всей видимости, находится где-то на стыке обеих точек зрения. Поэтому мы попытаемся хотя бы отчасти прояснить роль протеина Тамма-Хор-сфалла в патогенезе мочекаменной болезни.

Сведения о структуре ТХП начали появляться уже вскоре после его открытия. В 1952 г. было установлено, что он в высокой степени гликозилиро-ван. Количество гликозилированных группировок составляет примерно 30% от общего содержания углеводов в молекуле ТХП [9]. Выяснено, что ТХП является самым обильным гликопротеином мочи здоровых людей, а его молекулярная масса составляет примерно 90 kDa [10]. Хроматографическое разделение гликопептидов, входящих в структуру ТХП, и их дальнейшее изучение при помощи спектроскопии показало, что они относятся к N-глико-зильному и N-ацетиллактозаминному типам [11]. Важное событие в понимании структуры ТХП произошло в 1985 г., когда A.V.Muchmore и J.M.Decker выделили из мочи беременных женщин гликопротеин массой 85 kDa, получивший название «уро-модулин» [12]. Дальнейшее исследование первичной структуры этого белка показало, что она гомологична структуре ТХП. Именно поэтому в ряде публикаций ТХП и уромодулин упоминаются как тождественные понятия. Возможно, это не совсем верно, поскольку показано, что указанные вещества по-разному фосфорилируются, а это предопределяет некоторые особенности их функционирования [13]. Не вдаваясь в подробности этой дискуссии, отметим, что открытие уромодулина позволило значительно точнее идентифицировать структуру ТХП. Установлено, что белковая часть гликопротеина состоит из 616 аминокислот, включая 48 цистеиновых последовательностей, вовлеченных в построение 24 дисульфидных мостиков, важных для конформации белка. Выявлено наличие 8 участков N-гликозилирования, объясняющих высокое содержание карбогидратов в молекуле ТХП [12]. Кроме того, уромодулин содержит 4 домена эпидермального фактора роста, включающих кальций-связывающие последовательности, которые, по-видимому, определяют процесс взаимодействия с другими белками [14]. Отличительной структурной особенностью ТХП является наличие так называемого домена Zona Pellucida [15]. Известно, что Zona Pellucida - это белковая часть оболочки яйцеклетки, обеспечивающая взаимодействие со сперматозоидами [16]. Наличие в структуре ТХП Zona Pellucida позволяет предположить

существование регуляторной связи между ним и эстрогенами, что подтверждается некоторыми экспериментальными данными [17].

Изучение локализации протеина Тамма-Хорс-фалла в организме первоначально показало, что соответствующая мРНК экспрессирована только в почках [18], хотя были проведены попытки выявить экспрессию ТХП и в других тканях. Так что сегодня с определенностью можно говорить лишь о почечной локализации ТХП. Установлено, что ТХП в нефроне присутствует в основном в клетках толстого восходящего отдела петли Ген-ле, включая сегмент выше плотного пятна, переходящий в начальные отделы дистальных канальцев [19, 20]. Внутриклеточный транспорт ТХП можно представить следующим образом: ТХП образуется из прекурсоров, депонирующихся в эн-доплазматическом ретикулуме. При этом установлено, что для выхода в цитоплазму принципиально важно образование правильной сети дисульфидных мостиков [21]. После этого протеин транспортируется в комплекс Гольджи, где завершается процесс образования гликанов, а затем перемещается к люминальной поверхности клетки. К поверхности клеток ТХП прикрепляется с помощью фосфатидилинозитольного якоря [15]. Конечным этапом высвобождения является расщепление фос-фатидилинозитольной группы специфической фос-фолипазой, что приводит к отсоединению ТХП от мембраны и накоплению его в моче [14].

Процесс синтеза ТХП находится под контролем специфического гена (иМОБ). Установлено, что этот ген локализуется на хромосоме 16р [22]. Проблема регуляции образования и экскреции ТХП довольно сложна. В разных опытах статистический разброс экскреции ТХП весьма высок - от 5 до 600 мг/сут [23-26]. Было предложено несколько объяснений наблюдаемых различий. Во-первых, на точность результатов оказывает влияние различие методических подходов. Во-вторых, ключевым фактором для определения ТХП в моче является степень дизагрегации его молекулы, максимальная величина которой проявляется в щелочной среде. В этих условиях резко увеличивается количество участков взаимодействия со специфическими антителами, используемыми в анализе [23, 26]. Однако в некоторых ситуациях, например, при сдвиге pH в кислую сторону у больных нефролитазом, усиливается агрегация молекул ТХП [23, 24]. В результате активируется флокуляция и увеличивается адгезия молекул на клетках уротелия, что приводит к уменьшению выделения с мочой детектируемого ТХП [23, 27, 28]. Таким образом, можно обозначить pH

как первый важнейший фактор регуляции экскреции ТХП.

Кроме того, было установлено, что уровень почечной экскреции ТХП напрямую зависит от скорости клубочковой фильтрации. Выяснилось, что величина ТНР/Сг (отношение ТХП к креатинину) подвержена гендерным колебаниям. Так, у здоровых женщин показатель ТНР/Сг был значительно больше, чем у женщин, страдающих МКБ, равно как у здоровых и больных мужчин [23, 25]. Кроме того, была показана корреляция суточной экскрецией ТХП с параметрами тела человека [23]. Авторы последнего исследования отметили, что у здоровых женщин продуцируется гораздо больше ТХП относительно параметров тела и показателей функции почек, чем у здоровых мужчин и больных с МКБ. Нам представляется, что этому факту можно найти вполне логичное объяснение. Как уже отмечалось [14], очень близкую структуру с ТХП имеет белок уромодулин, выделяемый с мочой беременных женщин. Возможно, повышенная продукция ТХП у женщин является эволюционно сформировавшимся защитным механизмом, направленным на предотвращение камнеобразования в условиях мощной нагрузки нефрона кальцием, что наблюдается во время беременности. Таким образом, количество ТХП, выделяемого с мочой, напрямую зависит от функционального состояния почек, параметров тела и половой принадлежности.

Большой интерес представляют возможные регуляторные функции ТХП, вытекающие из его локализации. Напомним, что указанный гликопротеин располагается преимущественно в клетках толстого восходящего отдела петли Генле. Поэтому возникли предположения относительно возможных взаимодействий ТХП с локализованными здесь транспортными системами. И действительно, имеются экспериментальные данные, подтверждающие эти предположения. Установлено, например, что антенатальная форма синдрома Бартера сопровождается абсолютным дефицитом содержания ТХП как внутри клеток, так и в моче [29, 30]. Как известно, синдром Бартера развивается в результате мутации №+, К+2С1- -котранспортера (№КСС), располагающегося на люминальной мембране клеток толстого восходящего отдела петли Генле [31]. Учитывая это, можно предположить, что между транспортером ККСС и ТХП существуют определенные, скорее всего, реципрокные взаимоотношения. Это предположение подтверждается экспериментальными данными. Оказалось, что введение крысам петлевого диуретика фуро-семида, который, как известно, блокирует данный симпортер, сопровождается существенным увели-

чением мРНК ТХП [32, 33]. С другой стороны -опыты показали, что при недостатке ТХП существенно увеличивается продукция мРНК целого ряда различных почечных транспортеров. Кроме того, было обнаружено, что при недостатке ТХП снижается клубочковая фильтрация. При этом ТХП-дефицитные мыши не могли концентрировать мочу в нормальной степени, что сопровождалось усилением диуреза, но без существенного увеличения экскреции электролитов [34]. Таким образом, было установлено, что между уровнем продукции ТХП и активностью почечных транспортеров существует определенная связь. Другими исследователями было подтверждено наличие обратно пропорциональной зависимости между уровнем экспрессии ККСС2 и количеством ТХП у крыс [35, 36]. С современных позиций эту зависимость можно объяснить следующим образом. Установлено, что котранспортер ККСС2 и ТХП совместно локализуются на так называемых детергент-устойчивых доменах клеточной мембраны. При этом оба они вовлечены в трансмембранный трафик и взаимодействуют друг с другом, а значит, при изменении количества одного может меняться и количество другого [34, 37, 38]. Справедливости ради отметим, что в проблеме взаимодействия ТХП с почечными транспортерами достаточно много пока не ясных моментов. Представляют также интерес взаимоотношения ТХП и анти-диуретического гормона (АДГ). Установлено, что снижение синтеза ТХП влечет за собой увеличение активности вазопрессина, и наоборот, активация АДГ сопровождается ослаблением синтеза ТХП [33, 36, 38]. Нельзя, правда, исключать, что уменьшение количества ТХП на фоне вазопресси-на может являться лишь следствием стимулирующего влияния последнего на экспрессию котран-спортера ККСС [38].

Впервые интерес к ТХП как к молекуле, участвующей в развитии мочекаменной болезни, возник в начале 1970-х годов, когда было обнаружено, что этот гликопротеин в большом количестве присутствует в оксалатных камнях [39, 40]. При этом оказалось, что характер данного присутствия имеет важные отличительные особенности. Во-первых, ТХП является самым представительным компонентом органической матрицы почечных камней [41]. Во-вторых, как известно, с кальциевыми кристаллами в почках могут взаимодействовать макромолекулы, имеющие достаточно большой отрицательный заряд. Чаще всего эти макромолекулы необратимо инкорпорируются в кристалл, становясь частью его органической матрицы [42]. Однако, как показали эксперименты, ТХП далеко не

всегда можно обнаружить в пределах кристалла оксалата кальция [43]. Данное наблюдение указывает на то, что взаимодействие ТХП с кристаллом не является строго необратимым. В любом случае, факт присутствия молекулы ТХП в почечных камнях может трактоваться двояко: это может свидетельствовать как о его стимулирующей, так и о его ингибирующей роли в патогенезе кам-необразования.

В настоящее время значительная часть проводимых экспериментов показывает, что ТХП является одним из важнейших ингибиторов камнеоб-разования. Во-первых, ингибирующую способность нормального ТХП (уточнение «нормальный» имеет важное значение, смысл которого будет раскрыт ниже) достаточно наглядно демонстрируют опыты по изучению процессов кристаллизации in vitro. Одна из методик базируется на спектрофотометрическом измерении оптической плотности раствора, получающегося при смешивании растворов хлорида кальция и оксалата натрия [44]. Как показывают эксперименты, нормальный ТХП в концентрации порядка 30-40 мг/л ингибирует нук-леацию и особенно (на 76-81%) - агрегацию кристаллов кальция оксалата моногидрата, не уступая по эффективности цитрату [28, 45]. Второй методический подход, касающийся изучения динамики преципитации кристаллов кальция оксалата моногидрата на клеточной культуре MDCK, показал, что ТХП в значительной степени блокирует их адгезию [5]. Аналогичные данные были получены и при исследовании свойств ТХП, выделенного из мочи здоровых людей [46]. Более того, был установлен механизм, с помощью которого ТХП ингибирует нуклеацию и агрегацию кристаллов CaOx. Имея большой отрицательный поверхностный заряд, он взаимодействует с положительно заряженными частями кристаллов, создавая своеобразное покрывало. В результате такие кристаллы не способны прикрепляться к клеткам почечной ткани и выводятся с мочой [5, 46]. Подтверждение этих результатов было получено и в экспериментах in vivo. Так, ТХП-нокаутные мыши не могли противостоять камнеобразованию на фоне этиленглико-левого нефролитиаза [47].

Переходя к клиническим наблюдениям, отметим, что еще в 1981 г. впервые был зафиксирован факт снижения экскреции ТХП при нефролитиазе [48]. Похожие исследования были проведены спустя 13 лет в медицинском центре Нового Орлеана (США). В экспериментах были задействованы 53 пациента с оксалатным нефролитиазом и 22 здоровых добровольца. Оказалось, что у больных за сутки экскретировалось с мочой значительно мень-

ше ТХП и пропорционально снижалась способность мочи предотвращать агрегацию кристаллов кальция оксалата [49]. В другой работе подтвердилось, что почечная экскреция ТХП у здоровых людей превышает таковую у больных МКБ [50]. Подчеркнем, однако, одну важную деталь - практически ни в одном исследовании не выявлено существенных различий в абсолютных цифрах экскреции ТХП у больных и здоровых людей. Дифференциация проявлялась только тогда, когда показатели выделения ТХП с мочой соотносились с экскрецией креатинина. С одной стороны, данное наблюдение еще раз подтверждает факт зависимости экскреции ТХП от функционального состояния не-фрона, как это уже отмечалось выше [23]. Но, с другой стороны - показывает, что в условиях не-фролитиаза не наблюдается количественных изменений почечной экскреции ТХП. Фиксируемые относительные изменения, по-видимому, являются литтть следствием изменений функции почек. Почему же тогда ингибирующая способность мочи в отношении камнеобразования в условиях нефролитиаза существенно снижается? Логично было предположить, что причина утраты протеином Там-ма-Хорсфалла своих ингибирующих свойств может заключаться не в количественных, а в качественных изменениях его структуры. Подтверждения этой идеи появились в начале 1990-х годов [51]. А впервые серьезные доказательства этого были получены в 1994 г.

Группа немецких и швейцарских ученых провела исследование структурных различий ТХП, выделенного из мочи 12 здоровых добровольцев и 11 людей с подтвержденным диагнозом «нефроли-тиаз». Оказалось, что нормальный ТХП (нТХП) имеет гораздо более высокую степень сиализации, чем патологический ТХП (пТХП). Количество си-аловой кислоты в нТХП равнялось 51±9 г/кг, тогда как пТХП содержал лишь 21±4 г/кг данного субстрата [41]. Учитывая, что других структурных различий выявлено не было, возникло предположение, что именно уменьшение степени сиализации является причиной того, что пТХП теряет свои ингибирующие свойства и даже становится стимулятором камнеобразования. Параллельно в Нидерландах были идентифицированы различия величин поверхностного заряда и размеров молекул нТХП и пТХП [52]. Было установлено, что пТХП может подвергаться флокуляции и образовывать большие гелеподобные частицы. Эти частицы, осевшие на клетках уротелия, выступают в качестве нуклеатора кристаллизации и, более того, действуя подобно клею, создают «ловушку» для протекающих по канальцу кристаллов, стимулируя их

агрегацию [27, 45]. Описанные результаты подтвердились в экспериментах in vitro. В любых концентрациях пТХП стимулировал агрегацию кристаллов оксалата кальция [45].

Таким образом, в утрате протеином Тамма-Хорсфалла своих ингибирующих свойств решающее значение имеет модифицирование его молекулы. Точные причины этого модифицирования остаются неизвестными. Возможно, пТХП образуется вследствие дефекта ферментов, участвующих в процессе синтеза олигосахаридных цепей. Это может происходить, например, при хронической алкогольной интоксикации, когда существенно возрастает количество асиалотрансферин-гликоформ [53]. Кроме того, некоторые врожденные заболевания сопровождаются генетически обусловленными нарушениями функционирования гликозидаз и гликозилтрансфераз, что может свидетельствовать о важном значении наследственности в патогенезе мочекаменной болезни [54]. Весьма интересными представляются данные, демонстрирующие роль оксидативного стресса в модификации ТХП [55]. От себя добавим еще одно предположение: не исключено, что определенное значение в образовании пТХП могут иметь вирусные инфекции. Широко известно, что многие вирусы используют в процессе репродукции фермент нейраминидазу. Вполне возможно, в результате вирусной «атаки» на почки ТХП, обладающий способностью ингибировать гемагглютинацию вирусов [6], нейтрализует нейраминидазу, но сам при этом теряет часть сиаловой кислоты, трансформируясь в пТХП.

Протеин Тамма-Хорсфалла является одним из основных ингибиторов камнеобразования. По-видимому, механизм его действия заключается в создании вокруг кристаллов оксалата кальция защитного «покрывала», предотвращающего их адгезию к клеткам уротелия. Однако в некоторых патологических условиях происходит модификация ТХП, приводящая к утрате значительной части сиаловой кислоты. Как следствие, ТХП не способен проявлять ингибирующие свойства и даже может становиться стимулятором камнеобразова-ния, что, возможно, является одним из пусковых механизмов развития нефролитиаза.

Остеопонтин

Остеопонтин (OPN), мультифункциональный фосфорилированный гликопротеин, впервые был выделен из костного матрикса быка в 1985 г. шведскими исследователями А.Бга^еп и D.Heinegаrd из отделения физиологической химии университета Лунда [56]. Вскоре этими же авторами была установлена первичная структура полученного си-алопротеина, который получил название «остеопон-

тин». Предложенное название подразумевает, что протеин является продуктом клеток костного матрикса и что он образовывает в матриксе мостики (от латинского «pons») между клетками и минералами [57]. За истекшие почти два с половиной десятилетия опубликовано более 1000 работ, посвященных этому гликопротеину, однако его роль в организме выяснена далеко не до конца.

Остеопонтин (OPN) представляет собой отрицательно заряженный кислый фосфорилированный гликопротеин, который состоит приблизительно из 300 аминокислот с очень высоким содержанием остатков аспарагиновой (48) и глутаминовой (27) аминокислот. Важной особенностью строения OPN является наличие интегрин-связывающей последовательности RGD (Arg-Glu-Asp). Кроме того, установлено, что OPN является лигандом некоторых вариантов рецептора CD44. Аминокислотная последовательность OPN содержит также 42 сериновых и 14 треониновых остатков [57-66]. Молекулярная масса изоформ OPN колеблется в зависимости от степени посттрансляционных модификаций протеина от 40 до 70 kDa [67].

Выяснилось, что остеопонтин продуцируется не только костной тканью, но и многими другими органами, включая почку, легкие, печень, мочевой пузырь, поджелудочную и молочную железы [68, 69]. Экспрессия протеина была также продемонстрирована in vitro и in vivo в клетках гладкой мускулатуры и в макрофагах [70-72], а присутствие OPN было выявлено в таких биологических жидкостях организма, как кровь, моча, молоко, жидкость внутреннего уха [64, 73-75]. Более того, в зависимости от цели исследования и локализации экспрессии один и тот же гликопротеин встречается под различными названиями: «крысиный костный сиалопротеин I» [57], «2 ar» [76], «Eta-1» [77], «уро-понтин» [78], «протеин мочевого камня» [79]. Все это указывает на полифункциональность описываемого протеина [80, 81]. И действительно, оказалось, что остеопонтин играет важную роль в регулировании целого ряда физиологических и патологических процессов. Получены неопровержимые свидетельства участия OPN в модулировании воспаления, репарации, нейропротекции, туморогене-за, хемотаксиса и апоптоза [64, 82-91].

Но важнейшее значение, без сомнения, имеет участие остеопонтина в процессе биоминерализации. В норме биоминерализация является тонко регулируемым физиологическим процессом и ограничена у млекопитающих костной и зубной тканью. Показано, что в ходе нормальной минерализации костей OPN обеспечивает дифференциров-ку и рекрутирование остеокластов, а также

ингибирует образование и развитие гидроксиапа-тита [92-95]. Кроме того, имеются свидетельства вовлечения OPN в процесс костной резорбции. Так, нокаутные мыши, лишенные OPN, в значительной мере защищены от потери костной ткани, индуцированной овариэктомией [96].

Участие остеопонтина в процессе биоминерализации подтверждается и тем, что экспрессия протеина в значительной степени зависит от уровня гормонов, регулирующих содержание кальция в организме [97-101].

Особую роль играет участие остеопонтина в ходе патологической минерализации. Этот процесс, называемый эктопической, внескелетной или дистрофической кальцификацией, подразумевает отложение кальциевых солей в мягких тканях с развитием впоследствии целого ряда нежелательных эффектов. При определенных патологических условиях в результате повреждения, возраста, метаболического дисбаланса эктопической кальцификации могут подвергаться кровеносные сосуды, сердечные клапаны и почка. Эктопическая кальцификация часто выявляется у лиц с атеросклерозом, сахарным диабетом, терминальной стадией почечной болезни и, как правило, определяет неблагоприятный исход заболевания [102-106]. При этом у больных с дистрофической кальцификацией очень часто обнаруживается резко повышенная экспрессия остеопонтина [107-111]. Эти наблюдения указывают на возможную ингибирующую роль остеопонтина в отношении эктопической кальцификации. Высказанное предположение нашло подтверждение в экспериментах in vitro с использованием модели кальцификации клеток гладкой мускулатуры сосудов, в которых OPN подавлял указанный процесс [112].

Первые данные о почечной экспрессии остео-понтина были получены на почках грызунов. При этом OPN был идентифицирован в почках мышей и крыс как в норме [76, 113-115], так и в условиях почечной патологии [116-119]. Отметим, что в большинстве экспериментов наибольшая экспрессия остеопонтина выявлялась в эпителии петли Генле, дистальных канальцев, собирательных трубок и папиллярной поверхности [79, 114, 117, 120, 121]. В первых исследованиях, посвященных изучению почки человека, локализация мРНК соответствующего протеина была определена в дистальных канальцах, собирательных трубках и в эпителии почечной лоханки. В фундаментальном исследовании с использованием современных методических подходов проанализировали экспрессию мРНК и протеина OPN в различных отделах фетальной и зрелой почек человека [122]. Оказа-

лось, что почечная экспрессия остеопонтина проявляется, начиная с 75-80-го дня внутриутробного развития, растет с увеличением срока беременности и сохраняется на высоком уровне в зрелом возрасте. В нормальной зрелой почке человека OPN локализован преимущественно в дистальных отделах нефрона, в наибольшей степени - в восходящем отделе петли Генле. В случаях проявления фокального интерстициального фиброза, сочетающегося с накоплением макрофагов в интерстиции, экспрессия OPN была значительно усилена во всех сегментах нефрона, включая проксимальные канальцы [122].

Сегодня господствует точка зрения, согласно которой основная роль почечного остеопонтина состоит в предотвращении образования камней почек, состоящих преимущественно из оксалата кальция и гидроксиапатита. Такой эффект четко продемонстрирован в экспериментах in vitro. В опытах с использованием различных клеточных модельных систем показано, что остеопонтин ингибировал нуклеацию, агрегацию и рост кристаллов оксалата кальция [78, 123-127]. Так, было зафиксировано 50% ингибирование агрегации кристаллов CaOx при добавлении 28±4 нмоль/л мочевого остеопонтина, а 50% подавление роста кристаллов происходило при использовании уже 16±2 нмоль/л. При этом указанные концентрации OPN были значительно ниже тех, которые определяются в нормальной моче [128]. Одновременно было установлено, что описываемый гликопротеин прямо ингибирует связывание кристаллов CaOx с культивируемыми клетками почечного эпителия, а экспозиция почечных клеток с кристаллами кальция оксалата моногидрата стимулирует продукцию OPN [129, 130].

Полученные in vitro результаты нашли свое подтверждение в экспериментах in vivo. Косвенные данные, указывающие на возможную ингибирующую роль остеопонтина, были получены на моделях нефролитиаза у крыс. У этих животных отложение кристаллов оксалата кальция происходило параллельно с повышением экспрессии протеина OPN и его мРНК. Причем повышенная экспрессия регистрировалась именно в тех отделах нефрона, где происходил процесс кристаллизации [131-134]. Наиболее убедительные свидетельства in vivo получены в экспериментах на нокаутных животных. Так, у мышей с делецией гена OPN на фоне приема этиленгликоля наблюдали образование кальций-оксалатных камней, в то время как у обычных мышей этого не происходило [135-137]. При этом у нормальных мышей развитие гиперок-салурии сочеталась с увеличением в 2-4 раза по-

чечной экскреции остеопонтина. Полученные результаты позволили цитируемым авторам сделать вывод о том, что остеопонтин играет ключевую ренопротективную роль in vivo в качестве ингибитора образования кристаллов CaOx. Подобным образом в другом исследовании 10% мышей, лишенных OPN, спонтанно образовывали почечные камни, а в условиях индуцированной гипероксал-урии число таких животных возрастало до б5% [13S].

Pоль остеопонтина в патогенезе мочекаменной болезни у человека в силу отсутствия адекватных методик выяснена недостаточно. И все же отметим два важных момента в пользу ингибирующего воздействия OPN на образование почечных камней. Первый: в ряде клинических исследований показано значительное снижение содержания ос-теопонтина в моче пациентов, страдающих МКБ, в сравнении со здоровыми людьми [139-142]. Справедливости ради отметим, что не во всех исследованиях были зарегистрированы подобные различия [143-145]. Второй важный момент состоит в наличии единичных мутаций гена OPN, которые обнаружены у значительно большего числа пациентов с нефролитиазом по сравнению с лицами без МКБ [14б, 14?]. Tаким образом, в целом можно считать установленным, что остеопонтин играет ингибирующую роль в процессе кристаллизации солей оксалата кальция и препятствует образованию почечных камней.

Анализируя особенности строения остеопонти-на, очевидно, что его молекула содержит ряд доменов, определяющих мультифункциональность этого гликопротеина. С одной стороны - это уже упоминавшаяся аминокислотная последовательность RGD (Arg-Gly-Asp), обеспечивающая его активное интегрин-зависимое связывание с клетками. Этому же способствует связывание через мотив SVVYGLR, а также взаимодействие с известным рецептором CD44, чувствительным к ги-алуронану [б5, 13б, 14S]. С другой стороны - OPN имеет достаточно возможностей для связывания с поступающими в мочу ионами кальция, что обусловливает нарушение нуклеации, агрегации и роста кальциевых кристаллов. Способность остеопон-тина связывать кальций обеспечивается целым рядом причин. Во-первых, наличием большого количества электроотрицательных аминокислотных остатков, в первую очередь - аспарагиновой и глутаминовой кислот. Tак, на 50 остатков аспарагиновой кислоты, собранных в кластеры вблизи N-терминального конца, приходится от 20 до 25% величины молекулы OPN. Между тем, установлено, что протеины, богатые аспарагиновой кислотой, тесно связаны с процессом минерализации во

многих органах и тканях [78, 149]. Так что высоко насыщенные анионами участки молекулы OPN, составленные из остатков кислых аминокислот, по-видимому, определяют потенциальные места связывания Ca2+. Эти анионные регионы дают возможность остеопонтину образовывать растворимые комплексы с ионами Ca2+ и посредством этого ингибировать отложение и кристаллизацию кальциевых солей [67]. И действительно, добавление аспарагиновой кислоты в экспериментах in vitro сопоставимо с OPN подавляло рост кристаллов кальция оксалата моногидрата и гидроксиапатита [150, 151]. Относительно роли глутаминовой кислоты существует мнение, что ее присутствие в молекуле остеопонтина определяет, скорее, изменение величины и формы образующихся кристаллов [152, 153].

Вторым моментом, определяющим активность остеопонтина вообще и его способность связывать ионы Ca2+ в частности, является степень фосфо-рилирования молекулы этого гликопротеина. Здесь уместно привести ряд наблюдений, не укладывающихся в общую концепцию остеопонтина как ингибитора кристаллизации. В цикле работ японских исследователей из университета Осаки остеопон-тин позиционируется как промоутер кристаллизации и формирования кальций-оксалатных почечных камней [154]. В экспериментах in vitro был продемонстрирован повышенный аффинитет кристаллов CaOx к эпителию клеточной линии дистальных почечных канальцев (почки собак Madin-Darby, MDCK), когда они инкубировались с остеопонти-ном [155, 156], и получены косвенные свидетельства повышенной адгезии кристаллов оксалата кальция на канальцевых клетках [157]. Кроме того, в этой же лаборатории было установлено, что ингибирование синтеза OPN подавляло осаждение и агрегацию кристаллов CaOx на почечных клетках крыс, как и добавление поликлональных антител к остеопонтину [156, 158]. И наконец, недавние эксперименты на нокаутных мышах показали, что у животных, лишенных OPN, под влиянием глиокса-лата образовывалось значительно меньше кристаллов оксалата кальция, чем у нормальных мышей [159].

Как совместить эти противоречивые результаты до конца не ясно, однако появляется все больше свидетельств, указывающих на то, что ключ к разгадке этих интригующих различий лежит в области посттрансляционных изменений протеина OPN. Установлено, что полипептидная последовательность остеопонтина подвергается обширным посттрансляционным модификациям, включая фос-форилирование, гликозилирование и сульфатирова-

ние. Причем эти модификации варьируются в зависимости от вида животного и типа ткани [160— 162]. Как уже отмечалось, в структуре OPN содержится значительное количество сериновых и треониновых остатков, которые представляют собой подходящие места для фосфорилирования. Была предложена гипотеза, согласно которой, чем большее количество таких остатков подвергается фосфорилированию, тем большую активность по ингибированию кристаллизации демонстрирует молекула OPN. Иными словами, вариации фосфо-рилирования молекулы остепонтина существенно регулируют процесс минерализации [75]. Выдвинутая гипотеза получила многочисленные подтверждения. Например, дефосфорилирование молекулы остеопонтина приводило к ослаблению его способности подавлять рост кристаллов гидроксиапатита in vitro [92, 163-165]. В другом исследовании искусственно воспроизведенные фос-форилированные молекулы остеопонтина в концентрации 200 нмоль/л на 50% ингибировали рост кристаллов кальция оксалата моногидрата, в то время как дефосфорилированные молекулы OPN не обладали такой способностью [166]. Отметим также предположение, согласно которому более полно фос-форилированный пептид в процессе взаимодействия с кальциевыми депозитами подвергается легкому конформационному изменению, повышая посредством этого аффинитет к зонам роста кристалла [75, 167]. Как бы там ни было, комбинация большого числа остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, значительного количества мест для фосфорилирования и наличия предполагаемых кальций-связывающих мотивов, по-видимому, обеспечивает способность остеопонтина активно связывать ионы Ca2+. По некоторым данным, величина этого связывания составляет 50 моль кальция на 1 моль OPN. Согласно другим расчетам, при концентрации Ca2+ 1-2 ммоль/л занятыми оказывается 25 из 50 потенциальных мест связывания в молекуле остеопонтина, а полная их оккупация происходит при концентрации Ca2+ на уровне 5-10 ммоль/л [80, 168]. Кроме того, возможно анионные свойства OPN, как и в случае с протеином Тамма-Хорсфалла, обеспечивают образование на поверхности кальций-содержащих кристаллов своеобразное «покрывало», что задерживает дальнейший рост и пролиферацию последних [167].

Этим, однако, механизм действия остеопонтина не исчерпывается. Эксперименты in vitro показали, что некоторые белковые макромолекулы, в том числе и остеопонтин, ингибируют рост кристаллов кальция оксалата моногидрата (COM), направляя кристаллизацию по пути образования каль-

ция оксалата дигидрата (COD) [126]. Исследование, позднее проведенное в этой же лаборатории с использованием нокаутных животных, показало, что в почечных канальцах мышей с делецией гена OPN задерживались исключительно кристаллы COM [137]. 1992; Denhardt, Guo, 1993/.50 потенциальных мест связывания в молекуле остеопонти-нанному изменению. Давно известно, что наиболее термодинамически стабильная форма оксала-та кальция COM является основным ингредиентом почечных камней, примерно вдвое превосходя содержание COD [169]. По неизвестным пока причинам COD имеет значительно более низкую способность образовывать в моче крупные агрегаты кристаллов и формировать прочные адгезивные контакты с клетками почечного эпителия. Поэтому конечная моча часто содержит отдельные микрокристаллы COD, изначально неспособные к активной агрегации и адгезии в пределах канальцев. Это позволяет считать образование кристаллов кальция оксалата дигидрата защитным процессом в условиях мочекаменной болезни [170]. По крайней мере, осаждение из одних и тех же порций мочи различных форм кристаллов оксалата кальция с помощью манипулирования концентрациями Ca2+ в окружающей среде показало, что преципитация COM происходила при содержании Ca2+ 2 ммоль/л, а COD - 7 ммоль/л [171].

Факт различного влияния белковых макромолекул на процесс кристаллизации хорошо известен в природе и носит название «кристаллический полиморфизм». Он обеспечивает, например, вариабельность форм кристаллов кальция карбоната в различных раковинах моллюсков. Основа и механизмы возникновения кристаллического полиморфизма неизвестны, но для нас важным является то, что протеины, влияющие на этот процесс, как правило, являются полианионами, причем многие богаты мономерами аспарагиновой кислоты [149, 172]. Так что, по-видимому, такой эффект остео-понтина не должен вызывать чрезмерного удивления. Что касается более высокой адгезивности кристаллов COM, этот вопрос также не выяснен. Возможно, это зависит от большего содержания в структуре COM фосфолипидных групп, в первую очередь фосфатидилсерина, известного стимулятора кристаллизации [173]. Кроме того, давно существует предположение о том, что различия в порядке расположения молекул воды в кристаллических решетках COM и COD, а также в величине заряда их поверхности обусловливают особенности их взаимодействия с адсорбентом и мембранолитические свойства COM [174-177].

На основе описанных механизмов действия

Кристаллы СОМ

Кристаллы COD

Увеличение размеров кристаллов вторично к росту и агрегации кристаллов

Адгезия кристаллов СаОх (СОМ) к канальцевым эпителиальным клеткам и последующая задержка в пределах почки

Один из предполагаемых механизмов действия остеопон-тина (по J.A. Wesson et al., 2003). - Ингибирование остео-понтином; + Стимулирование остеопонтином.

остеопонтина рядом исследователей была предложена гипотетическая схема, отражающая его ингибирующий эффект в отношении образования кальций-оксалатных камней почек [136, 137].

В последние годы благодаря активным усилиям австралийских исследователей группы R.L.Ryall разрабатывается новая идея дополнительного механизма действия белковых макромолекул, в том числе и остеопонтина, по ослаблению процесса мочевой кристаллизации. Проводимый с использованием современных методов анализ почечных конкрементов показал наличие в них, кроме неорганической структуры, большого количества органических включений, главным образом протеинов. Некоторые из них остаются пока неидентифици-рованными, другие - являются непременным атрибутом воспалительного процесса, третьи - представляют собой рассматриваемые здесь защищающие от нефролитиаза макромолекулы [178-182]. Среди последних детектирован и остеопонтин [171, 183-185]. M.C.Chauvet и R.L.Ryall культивировали почечные клетки в условиях добавления трех типов кристаллов оксалата кальция: COMt, содержащих только неорганическую фракцию кристалла; COMCF, преципитированных из нормальной процен-трифугированной и профильтрованной мочи человека, и COMUF, осажденных из мочи, подвергнутой ультрафильтрации и содержащих протеины, не

превышающие 10 kDa [186]. Оказалось, что наиболее активно прикреплялись к клеткам кристаллы COM, менее активно - COM,TO и наименьшей

г UF

адгезивностью обладали кристаллы COMCF. Затем с помощью сканирующей электронной микроскопии определили, что последний тип кристаллов наиболее быстро (в течение 2 мин) поглощался клетками и подвергался быстрой и полной деструкции в течение 60 мин, в то время как кристаллы COMUF значительно медленнее интернализовались и деградировали. Полученные результаты позволили авторам выдвинуть следующую гипотезу. По-видимому, мочевые протеины могут играть двойную протективную роль. Первая: за счет инкорпорирования в кристаллы они снижают аффинитет последних к почечным клеткам. Вторая: облегчают внутриклеточную деструкцию кристаллов после их поглощения почечными клетками [171, 179, 180, 186]. В другом исследовании эти же авторы изучали скорость растворения меченных по [14C] кристаллов оксалата кальция в культуре клеточной линии почек MDCK II при добавлении возрастающих концентраций экстракта, полученного из матрикса кристаллов COM [187]. Оказалось, что повышение концентрации экстракта приводило к пропорциональному уменьшению размеров кристаллов и к увеличению выхода радиоактивной метки в культуральную среду. Полученные результаты подтвердились данными сканирующей электронной микроскопии и явились очередным свидетельством участия внутрикристаллических протеинов в деградации и растворении кристаллов CaOx.

Каков механизм обнаруженного эффекта? По-мнению приведенных авторов, события разворачиваются следующим образом. Проникновение белковых макромолекул в кристалл создает определенные дефекты в его структуре и повышает напряжение кристаллической решетки, что делает образовавшуюся структуру более чувствительной к протеолитическому воздействию лизосомальных энзимов. Через своеобразные каналы, пронизывающие кристалл, создаваемые и заполненные протеинами, протеазы проникают в структуру кристалла, что способствует его деструкции и последующему растворению [187]. Что касается ферментативной активности, в эпителии различных отделов почечных канальцев выявлен целый набор протеаз, способных осуществить описанный эффект [188-191]. При этом не исключено, что в процессе деградации кристаллов принимают участие лизосомальные энзимы не только почечных клеток, но и окружающих макрофагов и мульти-ядерных гигантских клеток, которые способны по-

глощать микрокристаллы [192-196]. По крайней мере, кристаллы оксалата кальция были зафиксированы внутри фаголизосом культивируемых макрофагов, так же как и в лизосомах почечных клеток in vivo и in vitro [194, 197, 198]. По-видимому, фагоцитирование кристаллов, прикрепленных к клеточным мембранам, следует за образованием фаголизосом, чья внутренняя среда, имеющая кислый pH и содержащая комплекс лизосомальных протеаз, создает идеальные условия для разрушения кристалла. Протеазы расщепляют протеиновую фазу кристалла, образуя за счет этого дефекты в минерале, что должно увеличить площадь его поверхности и облегчить растворение кристалла в кислой среде [187].

Учитывая отмеченную роль кислой среды в растворении кристаллов, нельзя не остановиться на очередной интересной гипотезе, имеющей прямое отношение к рассматриваемому вопросу. Но-каутным мышам, лишенным нормального гена ос-теопонтина, подкожно имплантировали фрагменты аортальных клапанов для изучения эктопической кальцификации [167]. Оказалось, что процесс кальцификации клапанов у нокаутных мышей в 4-5 раз превосходил таковой у нормальных животных. Авторами было предположено, что OPN не только ингибирует отложение кристаллов, но и активно стимулирует их растворение. Последнее авторы связывают с тем, что, как установлено в эксперименте, остеопонтин стимулирует индукцию энзима карбоангидразы II, катализирующего, как известно, внутриклеточное образование угольной кислоты из двуокиси углерода. В приведенных экспериментах экспрессия карбоангидразы II резко повышалась в макрофагах и многоядерных гигантских клетках, окружающих имплантаты. Это обусловило повышенное образование угольной кислоты, диссоциация которой резко увеличивала внутриклеточное содержание ионов водорода. Выброс протонов из клетки с помощью вакуольной Н+-АТФа-зы приводит к подкислению окружающей среды, что, в свою очередь, создает условия для растворения кристаллов. Важным является тот факт, что активность карбоангидразы четко коррелировала как со степенью минерализации имплантата, так и с уровнем остепонтина в образовавшихся кристаллах апатита. Это позволило авторам высказать предположение, согласно которому OPN индуцирует локальную экспрессию карбоангидразы в окружающих макрофагах и гигантских клетках, что способствует деструкции образующихся кристаллов за счет ацидификации окружающей микросреды [167]. Вполне вероятно, что аналогичный процесс происходит и в почках и является одним из

способов зашиты от эктопической кальцификации. От себя добавим, что, возможно, подавление описываемого процесса лежит в основе хорошо известного факта образования почечных камней под влиянием ингибитора карбоангидразы ацетазола-мида [199].

Суммируя приведенные данные, отметим, что гликопротеин остеопонтин является важной макромолекулой, модулирующей процесс эктопической кальцификации в почке. Ингибирующий эффект остеопонтина, по-видимому, обусловлен как способностью связывать кальциевые микрокристаллы, нарушая их контакт с клетками почечного эпителия, так и активацией процесса деградации и последующего растворения кристаллов. Ингибирующая активность остеопонтина зависит от уровня его посттрансляционной модификации и, в первую очередь, от степени фосфорилирования его молекулы.

Бикунин

В начале 1960-х годов из плазмы крови человека был выделен, очищен и идентифицирован новый трипсиновый ингибитор. По результатам электрофореза на бумаге протеин получил название «интер-альфа-трипсиновый ингибитор» [200, 201]. Однако впоследствии, исходя из того, что в норме трипсин в плазме крови отсутствует, название было редуцировано до «интер-альфа-ингибитор» (1а1), хотя и первое до сих пор встречается в литературе [202]. Вскоре выяснилось, что семейство ин-тер-альфа-ингибиторов включает целый ряд внеклеточных протеинов, которые являются важными модуляторами состава внеклеточного матрикса различных органов [203].

Изучение строения интер-альфа-ингибитора показало, что он состоит из трех полипептидных цепей: двух тяжелых с молекулярной массой около 80 кОа каждая, названных НС1 и НС2, и легкой цепи (30-40 кОа), получившей название «бикунин». Тот же бикунин, как оказалось, является структурным элементом другого близкого протеина, в состав которого входит также одна тяжелая цепь (НС3), гомологичная таковым в 1а1. Этот новый плазменный протеин получил название «пре-аль-фа-ингибитор» [204-207]. В обоих отмеченных протеинах семейства интер-альфа-ингибиторов бикунин несет хондроитин сульфатную цепочку, с помощью которой ковалентно связывается с тяжелыми цепями. Кроме того, молекула бикунина содержит два домена типа Кунитца, имеющих важное значение в механизме действия протеинов. Выяснилось также, что оба протеина обладают мощным антипротеазным действием, игибируя активность трипсина, химотрипсина, катепсина,

эластазы, плазмина, калликреина, а также ряда факторов каскада свертывания крови [208-214]. Показано, что ингибирующая способность обусловлена, главным образом, наличием бикунина [215]. Это, в конечном счете, и определяет функциональную роль описываемых протеинов. Было установлено, что бикунин предотвращает инвазию и ме-тастазирование раковых клеток, обеспечивает процесс нормальной овуляции и оплодотворения, регулирует продукцию цитокинов, интенсивность воспалительной реакции, внутриклеточное содержание кальция. Относительно роли тяжелых цепей протеинов семейства 1а1 существует мнение, что они образуют связи с гиалуроновой кислотой и за счет этого стабилизируют внеклеточный матрикс различных органов [202, 213, 216-219].

В контексте обсуждаемой здесь проблемы большое значение имеет бесспорный факт ингибирующего воздействия бикунина на процесс образования кальций-оксалатных камней почек. В этой связи отметим два важных момента. Первый: установлено, что бикунин встречается не только в составе интер-альфа-ингибиторов, но и в свободном состоянии в виде отдельных молекул в плазме крови и моче [211, 215, 220-223]. При этом существует точка зрения, согласно которой в связанном состоянии бикунин теряет некоторые виды своей функциональной активности. А его высвобождение при протеолитической деградации протеинов 1а1 играет роль регуляторного механизма и приводит к восстановлению этих свойств [213]. Второй момент касается происхождения бикуни-на. Выяснено, что протеины семейства интер-аль-фа-ингибиторов синтезируются в печени, после чего секретируются в общий кровоток. Вопрос об ином происхождении бикунина на протяжении длительного времени не обсуждался.

В 1993 г. Р.А1шаш и соавт., исследуя макромолекулы, ингибирующие образование кальциевых мочевых камней, обнаружили в моче гликопротеин, содержащий остатки уроновой кислоты, который был выделен из мочи здоровых лиц, пациентов с мочекаменной болезнью и крыс и получил название «протеин, богатый уроновой кислотой» [220]. Углубленное изучение этого протеина показало, что по молекулярной массе и химической структуре он близок к семейству 1а1 [222, 224, 225]. Но еще до этого 8.8огешеп и соавт. изолировали из нормальной человеческой мочи неидентифицированный протеин с молекулярной массой около 40 кОа, близкий к интер-альфа-ингибиторам, кристаллизаций оксалата кальция [226]. В специальном исследовании проведен всесторонний сравнительный анализ протеина, богатого уроновой кислотой, и бикунина [227].

Результаты показали следующее: 1. Секвенирова-ние молекул выявило идентичность первых 25 аминокислотных остатков у N-терминального конца. 2. Western блоттинг с использованием поликлональных антител к бикунину иммунологически подтвердил факт выявленной идентичности. 3. У обоих протеинов зарегистрирована ингибирующая активность в отношении кристаллизации оксалата кальция. Был сделан вывод о том, что протеин, богатый уроновой кислотой, является бикунином, который в почке подавляет процесс кристаллизации CaOx. Интересно, что молекулярная масса изученных протеинов не совпала. Если у «классического» бикунина этот показатель был равен 45 kDa, то у сравниваемого протеина молекулярная масса составила 35 kDa. Это позволило авторам сделать вывод о двух мочевых бикунинах 35 и 45 kDa. Различие между ними, вероятно, обусловлено особенностями происхождения. Возможно, что один из них изначально находился в плазме крови в составе протеина из семейства IaI, а второй - в свободном виде. В процессе протеолитического расщепления первого могли произойти незначительные модификации, обусловившие его отличие от второго [227]. Не исключено, что и известный ингибитор мочевой кристаллизации нефрокальцин так же аналогичен HI-14, известному фрагменту бикунина [223]. По крайней мере, выявлены идентичность их молекулярной массы, последовательности первых 20 аминокислотных остатков и сопоставимая ингибиторная активность в отношении кристаллизации оксалата кальция.

Возвращаясь к происхождению мочевого би-кунина, сегодня можно считать установленной возможность его образования не только в печени, но и при определенных условиях - в почках. По крайней мере, у крыс с экспериментальным кальций-оксалатным нефролитиазом почечная экспрессия мРНК бикунина после 8 нед потребления этиленгликоля в 17 раз превосходила исходный уровень [228]. Авторы связывают этот эффект с ги-пероксалурией и повреждающим провоспалитель-ным действием оксалата кальция, провоцирующими образование бикунина. Это хорошо укладывается в известную теорию S.R.Khan, в лаборатории которого было проведено цитируемое исследование, о роли повреждающих факторов, лежащих в основе развития оксалатного нефроли-тиаза [229, 230]. Не так давно это предположение получило подтверждение в экспериментах на культуре почечных клеток LLC-PK1. Воздействие оксалата приводило к резкому повышению экспрессии этими клетками гена AMBP, кодирующего в том числе и образование бикунина [231].

Приведенные результаты относительно почеч-

ного происхождения бикунина получили подтверждение в целом ряде экспериментальных исследований. Иммуногистохимический анализ почек здоровых крыс показал наличие всех основных протеинов семейства IaI лишь на люминальной поверхности эпителия проксимальных канальцев. В то же время, после 8 нед экспериментальной гипероксалурии положительное окрашивание, указывающее на наличие как интер-альфа-ингибито-ра, так и бикунина, фиксировалось и в просвете канальцев, и в цитоплазме эпителиальных клеток различных отделов нефрона [232-234]. В другой работе иммуногистохимическое окрашивание продемонстрировало наличие бикунина в эпителии проксимальных канальцев, а также вблизи тонкого нисходящего отдела петли Генле нефрона человека [235].

Способность бикунина существенно ингибировать процесс образования кристаллов CaOx была четко продемонстрирована в экспериментах in vitro [224, 227, 233, 236, 237]. Так, на культуре почечных клеток MDCK добавление 10 нг/мл бикунина ингибировало адгезию кристаллов кальция оксалата моногидрата, а концентрация 200 нг/мл полностью подавляла процесс кристаллизации [238]. В другом исследовании присутствие в среде 8 мкг/мл бикунина на 80% ингибировало образование CaOx из хлорида кальция и оксалата аммония, что оценивалось по изменению радиоактивности супернатанта после 60 мин инкубирования [239]. А добавление мочевого бикунина в концентрациях от 2,5 до 20 мкг/мл замедляло нуклеацию образующихся кристаллов на 67 и 58% и ингибировало их агрегацию на 59 и 80% соответственно [240].

Для оценки роли функциональных доменов ин-тер-альфа-ингибиторов в подавлении кристаллизации оксалата кальция исследовали влияние отдельных фрагментов молекулы комплексного протеина, в том числе тяжелых цепей IaI, бикунина, а также карбокси-терминального домена бикунина. Оказалось, что бикунин и его карбокси-терминаль-ный фрагмент эффективно и сопоставимо ингибировали кристаллизацию оксалата кальция. Цельная же молекула IaI оказывала значительно более слабое воздействие [241]. Полученные результаты позволили авторам сделать вывод, согласно которому за угнетение процесса кристаллизации оксалата кальция в почке ответствен, главным образом, карбокси-терминальный домен бикунина.

Соответствуют ли приведенные данные роли бикунина в патогенезе образования оксалатных камней in vivo до конца не ясно. Имеющиеся скудные данные часто носят противоречивый харак-

тер и порой с трудом поддаются интерпретации. Так, с одной стороны, протеины семейства интер-альфа-ингибиторов более часто определялись в моче мужчин с оксалатным нефролитиазом, чем у здоровых людей [242]. В соответствии с результатами, полученными на животных, у людей, страдающих оксалатным нефролитиазом, фрагменты IaI фиксировались в эпителии собирательных трубок, тонкого отдела петли Генле и в клетках почечного интерстиция, тогда как у здоровых лиц -только в интерстициальном матриксе почки [243]. С другой стороных - имеется данные, согласно которым средняя концентрация бикунина в моче у 18 здоровых людей была на 50% выше, чем у 31 пациента, страдающего кальций-оксалатным не-фролитиазом [239]. Точного ответа, способного привести к консенсусу, пока нет. Тем более, не совсем ясными выглядят здесь причинно-следственные связи. Или увеличение бикунина в моче является, как в случае с экспериментальным нефроли-тиазом, следствием воздействия гипероксалурии на почечную ткань, или нефролитиаз развивается как следствие недостатка образования в почках бикунина, что и обусловливает усиление кристаллизации. Возможно, ответ следует искать в качественных различиях рассматриваемых протеинов. Так, иммунологическое определение бикунина в моче у 18 пациентов с мочекаменной болезнью и у 77 здоровых контрольных лиц показало, что среднее соотношение мочевого содержания бикунина и креатинина у больных было почти вдвое выше, чем в контрольной группе. Однако Western блот-тинг образцов мочи дал весьма неожиданные результаты. Оказалось, что значительно большее количество пациентов с нефролитиазом имело в моче аберрантный бикунин с молекулярной массой 25 kDa (10 из 18 - 55,6%), в то время как среди здоровых лиц таких было лишь 19,5% (15 из 77). Основная же часть образцов мочи людей из контрольной группы содержала «нормальный» бикунин с молекулярной массой 40 kDa [244]. Сравнение этих двух протеинов, проведенное авторами, продемонстрировало, что более мелкие фрагменты (25 kDa) были идентичны дегликозилированному бикунину и проявляли значительно меньшую активность в отношении ингибирования кристаллизации. Так что, вполне возможно, что, как и в случае с остеопонтином, функциональная активность бикунина определяется степенью посттрансляци-онных изменений его молекулы.

Касаясь механизмов действия бикунина, мы вынуждены ограничиваться исключительно предположениями. Сегодня ясно лишь, что молекула бикунина содержит места, имеющие высокий аф-

финитет к ионам Ca2+. Поэтому вполне можно ожидать, что бикунин осуществляет хелатирование ионов кальция, предотвращая его участие в кристаллизации. Однако это предположение не является единственным.

Не исключено, что молекула бикунина ингибирует связывание Ca2+ с кристаллами благодаря электростатическому эффекту, что обусловлено наличием положительно заряженного кластера в карбокси-терминальном домене протеина. Присутствие положительно заряженного протеина изменяет электростатический потенциал поверхности рядом с кристаллами. А это, в свою очередь, отталкивает катионы и может привести к уменьшению локальной концентрации ионов Ca2+ [245].

Следующий возможный механизм предполагает связывание бикунина с кристаллами окса-лата кальция, что индуцирует определенные изменения структуры кристаллов и их матриксных протеинов. Это ведет к изменению организации кристаллической решетки и нарушает обычную кинетику формирования кальциевых кристаллов [241].

В любом случае, точные механизмы, с помощью которых бикунин ингибирует процесс образования кристаллов оксалата кальция, нуждаются в серьезном изучении.

Таким образом, бикунин является одним из протеинов, угнетающих процесс кристаллизации в почках. Являясь частью молекулы протеинов семейства интер-альфа-ингибиторов, а также синтезируясь в нефроне под влиянием гипероксалурии и повышенного содержания оксалата в почках, бикунин нарушает образование полноценных кристаллов оксалата кальция за счет взаимодействия с ионами Ca2+ или нарушения кинетики образования кальциевых кристаллов.

Фрагмент протромбина 1

В начале 1990-х годов в ходе исследования состава органической матрицы оксалатных камней было обнаружено, что большая ее часть состоит из некоего белка, который изначально получил название «белок кристаллической матрицы» (БКМ) [246]. Значимый вклад в изучение этого протеина внесла группа австралийских исследователей под руководством R.L.Ryall и A.M.Stapleton. В 1993 г. они установили, что последовательность N-терминальных аминокислот белка на 81,8% идентична N-терминалям протромбина [247]. Через год в Японии определили молекулярный вес описываемого протеина - 31 kDa [248]. В этой же работе было показано, что поликлональные антитела к БКМ и протромбину проявляли перекрестную чувствительность в ходе Western блоттинга, что позволило сделать вывод - БКМ является активи-

рованным пептидом протромбина [248]. В очередном эксперименте индуцировали кристаллизацию оксалата кальция в ультрафильтрате мочи с добавлением плазмы и сыворотки крови, взятых у здоровых людей. Образовавшиеся кристаллы деми-нерализовывали и проводили исследование белкового экстракта. Анализ показал, что белковая матрица кристаллов, выращенных в ультрафильтрате мочи с добавлением сыворотки крови, содержала значительное количество фрагментов протромбина 1 и 2, один из которых, как показал электрофорез, являлся белком кристаллической матрицы. Затем при использовании стандартных образцов фрагментов протромбина 1 и 2 удалось точно идентифицировать БКМ как фрагмент протромбина 1 [249]. Эти результаты были подтверждены и другими исследованиями [250-253]. Таким образом, было установлено, что наряду с остео-понтином, протеином Тамма-Хорсфалла и бикуни-ном, фрагмент протромбина 1 (ФП1) является структурным компонентом белковой матрицы ок-салатных камней. При этом, как и в отношение других протеинов, факт присутствия ФП1 в органической матрице кристаллов может интерпретироваться двояко: либо он является ингибитором камнеобразования, либо, напротив, стимулирует этот процесс.

В настоящее время ФП1 принято считать ингибитором литогенеза, хотя и здесь все не столь однозначно. Первые результаты, позиционирующие ФП1 в качестве ингибитора камнеобразования, были также получены австралийскими исследователями. В условиях экспериментальной кристаллизации в человеческой моче они показали, что ФП1 не влиял на концентрацию ионов оксалата, необходимую для образования кристаллов, но увеличивал количество кальций-оксалатных депозитов. Однако, что принципиально важно, величина этих частиц был значительно меньше обычных и уменьшалась обратно пропорционально содержанию ФП1 в моче. Данное наблюдение продемонстрировало, что ФП1 в первую очередь ингибирует агрегацию кристаллов CaOx. Более того, в дальнейшем удалось зафиксировать зависимое от дозы ФП1 уменьшение депонирования кристаллического материала. Это могло означать, что ФП1 встраивается в архитектуру кристаллов и нарушает их склеивание, что и обусловливает увеличение количества более мелких депозитов [254]. Сравнительное изучение протромбина, тромбина и фрагментов протромбина 1 и 2 на процесс кристаллизации in vitro показало, что все эти вещества в определенной степени ингибируют агрегацию кристаллов. Их активность характеризовалась следующей

последовательностью: ФП1 > протромбин > ФП2 > тромбин. Параллельно 14С-оксалатный анализ показал, что ФП1 в наибольшей степени уменьшал так же и количество минеральных депозитов [255, 256]. Исходя из полученных результатов, было сделано предположение, что для антилитогенного эффекта протромбина или продуктов его распада принципиально важно наличие в их структуре домена у-карбоксиглутаминовой кислоты, который имеется у протромбина и ФП1, но отсутствует у тромбина и ФП2. При этом превосходящий по силе ингибирующий эффект ФП1 в сравнении с протромбином определяется большим по величине соотношением заряда молекулы к ее массе [255, 256]. Так что, согласно современным представлениям, механизм антилитогенного действия ФП1 выглядит следующим образом. За счет значительного количества отрицательно заряженных групп у-кар-боксиглутаминовой кислоты и небольшой молекулярной массы ФП1 связывается с положительно заряженными областями кристаллов оксалата кальция и образует протеиновое «покрывало», препятствуя нуклеации и агрегации кристаллического материала [5, 123, 257, 258].

Тем не менее, ФП1 все же не всегда способен предотвращать развитие нефролитиаза. Прямых экспериментальных доказательств того, что ФП1 может становиться стимулятором камнеобразова-ния, нам не встретилось. Однако есть ряд свидетельств, указывающих на возможные изменения структуры ФП1, ведущие к ослаблению его анти-литогенных свойств. Так, в университете Кейптауна (ЮАР) было проведено сравнительное исследование ингибирующей активности ФП1, выделенного из мочи чернокожих и белых людей [259]. Известно, что коренное население африканского континента страдает нефролитиазом гораздо реже, чем белые (1% против 12-15%). Авторы предположили, что данный факт может быть обусловлен межрасовыми различиями состава мочи, в том числе, структурными особенностями ФП. И действительно, эксперименты показали, что ингибирующая активность ФП1 чернокожих людей существенно превышает таковую для ФП1 белых: 46,5% против 31,7%. При этом данный показатель существенно снижался, если указанный белок добавляли в мочу людей другой расы [259]. Учитывая данные наблюдения, было сделано предположение: на антилитогенную активность ФП1 может оказывать влияние состав мочи через изменение конформации гликопротеина. В более поздних экспериментах были изучены структурные различия М-конце-вых и О-концевых олигосахаридов, выделенных из ФП1 больных МКБ и здоровых людей обеих рас.

Оказалось, что ключевым различием является степень сиализации ФП1. О-гликаны ФП1 обеих контрольных групп и М-гликаны ФП1 здоровых чернокожих людей в значительно большей степени сиализированы по сравнению с таковыми у больных МКБ белой расы [260]. Кроме того, появились сведения о том, что способность ФП1 предотвращать нуклеацию и агрегацию кристаллов определяется степенью гликозилирования молекулы [261].

Интересные данные были получены в экспериментах по изучению кристаллизации в условиях применения непрямого антикоагулянта варфарина

[262]. Как известно, варфарин блокирует в печени гамма-карбоксилирование витамин К-зависимых белков, в том числе - фрагмента протромбина 1

[263]. Поэтому возникло предположение, что ан-тикоагулянтная терапия может ослабить ингибирующую активность ФП1. В опытах была изучена способность ФП1 предотвращать кристаллизацию в моче больных, длительно получавших варфарин в связи с кардиохирургическими вмешательствами. Оказалось, что органическая матрица почечных камней, выращенных в этих условиях, в основном содержит слабо карбоксилированные молекулы ФП1. Однако на выраженность антилитогенного эффекта данное обстоятельство практически не влияло. Учитывая сказанное, можно предположить, что наличие правильной последовательности остатков у-карбоксиглутаминовой кислоты в молекуле ФП1 имеет важное, но не определяющее значение в механизме его ингибирующего действия.

Естественно, что, помимо качественных деструкций, молекулы ФП1 на выраженность антилитогенного эффекта могут оказывать влияние количественные изменения его концентрации в моче. Часть молекул ФП1 может попадать в нефрон из крови после распада протромбина. Однако выяснено, что синтез ФП1 осуществляется и непосредственно в нефроцитах, поскольку экспрессия специфической мРНК обнаружена в почке человека

[264]. При этом на фоне развития МКБ уровень экспрессии данной мРНК претерпевает существенные изменения, о чем свидетельствуют экспериментальные данные. Исследования показали, что в условиях экспериментального нефролитиа-за, вызванного ежедневным потреблением крысами 0,75% раствора этиленгликоля в течение 8 нед, количество мРНК ФП1 снижается на 42% [265]. Правда, установить, что послужило непосредственной причиной этого снижения, не удалось. Существуют сведения, что количество ФП1 в моче и его активность зависят от концентрации ионов кальция. Так, было показано, что ФП1 активен в боль-

шей мере при низкой концентрации свободных ионов Ca2+ в моче, тогда как, например, остеопон-тин - при высокой [116]. Возможно, зависимость ФП1 от содержания кальция в моче объясняется конформационными изменениями, которые вызывает этот ион при взаимодействии с молекулой гликопротеина [266, 267]. Показано также, что ФП1 in vitro стимулирует преобразование моногидратов оксалата кальция (COM) в дигидрат (COD), который, как уже отмечалось, является значительно менее литогенным [71]. Вместе с тем, встречаются данные, противоречащие этому наблюдению. Показано, что в моче людей ФП1 встраивается преимущественно в кристаллы COM, а в органической матрице COD он практически не обнаруживается [267]. Возможно, эти противоречия обусловлены различиями экспериментальных условий либо какими-то особенностями камнеобразования in vivo. В любом случае, данный вопрос нуждается в дополнительных исследованиях.

Таким образом, согласно современным представлениям, фрагмент протромбина 1 является одним из основных ингибиторов кристаллизации. Его действие основано на взаимодействии с кристаллами и образовании вокруг них протеинового «покрывала», которое препятствует адгезии кристаллического материала к клеткам уротелия и его дальнейшей агрегации. Не исключено, что анти-литогенная активность ФП1 зависит от степени сиализации, гликозилирования и гамма-карбокси-лирования молекулы.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Зверев ЯФ, Брюханов ВМ, Лампатов ВВ, Жариков АЮ. Современные представления о роли физико-химических факторов в патогенезе кальциевого нефролитиаза. Нефрология 2009; 13 (1): 39-50

2. Khan SR, Kok DJ. Modulators of urinary stone formation. Front Biosci; 2004; 9: 1450-1482

3. Kumar V, Lieske JC. Protein regulation of intrarenal crystallization. Curr Opin Nephrol Hypertens 2006; 15 (4): 374380

4. Dent CE, Sutor DJ. Presence or absence of inhibitor of calcium-oxalate crystal growth in urine of normals and of stone-formers. Lancet 1971; 1: 776-778

5. Kumar V, Farell G, Lieske JC. Whole urinary proteins coat calcium oxalate monohydrate crystals to greatly decrease their adhesion to renal cells. J Urol 2003; 170 (1): 221-225

6. Tamm I, Horsfall FL. Characterization and separation of an inhibitor of viral hemagglutination present in urine. Proc Soc Exp Biol Med 1950; 74: 108-114

7. Майданник ВГ, Дранник ГН. Белок Тамма-Хорсфал-ла: патогенетическая роль и клиническое значение при урологических и нефрологических заболеваниях. Урол и нефрол 1990; (5): 69-74

8. Kumar S, Muchmore S. Tamm-Horsfall protein-uromodulin (1950-1990). Kidney Int 1990; 37: 1395-1401

9. Gottschalk A. Carbohydrate residue of a urine mucoprotein inhibiting influenza virus haemagglutination. Nature 1952; 170: 662-663

10. Grant AM, Neuberger A. The development of a

radioimmunoassay for the measurement of urinary TammHorsfall glycoprotein in the presence of sodium dodecyl sulphate. Clin Sci 1973; 44: 163-179

11. Williams J, Marshall RD, van Halbeek H, Vliegenthart JF. Structural analysis of the carbohydrate moieties of human TammHorsfall glycoprotein. Carbohydr Res 1984; 134 (1): 141-155

12. Muchmore AV, Decker JM. Uromodulin: a unique 85-kilodalton immunosuppressive glycoprotein isolated from urine of pregnant women. Science 1985; 229: 479-481

13. Peraldi MN. Tamm-Horsfall protein. Nephrologie 1992; 13 (1): 7-11

14. Devuyst O, Dahan K, Pirson Y Tamm-Horsfall protein or uromodulin: new ideas about an old molecule. Nephrol Dial Transplant 2005; 20 (7): 1290-1294

15. Serafini-Cessi F, Malagolini N, Cavallone D. TammHorsfall glycop-rotein: biology and clinical relevance. Am J Kidney Dis 2003; 658-676

16. Gadella BM. The assembly of a zona pellucida binding protein complex in sperm. Reprod Domest Anim 2008; 43 (5): 12-19

17. Oelschlaeger T, Funfstuck R. Recurrent urinary tract infections in women. Virulence of pathogens and host reaction. Urologe A 2006; 45 (4): 412, 414416, 418-420

18. Pennica D, Kohr WJ, Kuang WJ et al. Identification of human uromodulin as the Tamm-Horsfall urinary glycoprotein. Science 1987; 236: 83-88

19. Bachmann S, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. Ultrastructural localization of Tamm-Horsfall glycoprotein (THP) in rat kidney as revealed by protein A-gold immunocytochemistry. Histochemistry 1985; 83 (6): 531-538

20. Bachmann S, Metzger R, Bunnemann B. Tamm-Horsfall protein-mRNA synthesis is localized to the thick ascending limb of Henle’s loop in rat kidney. Histochemistry 1990; 94 (5): 517-523

21. Malagolini N, Cavallone D, Serafini-Cessi F Intracellular transport, cell-surface exposure and release of recombinant Tamm-Horsfall glycoprotein. Kidney Int 1997; 52 (5): 1340-1350

22. Pook MA, Jeremiah S, Scheinman SJ et al. Localization of the Tamm-Horsfall glycoprotein (uromodulin) gene to chromosome 16p12.3-16p13.11. Ann Hum Genet 1993; 57 (4): 285-290

23. Glauser A, Hochreiter W, Jaeger P, Hess B. Determinants of urinary excretion of Tamm-Horsfall protein in non-selected kidney stone formers and healthy subjects. Nephrol Dial Transplant 2000; 15: 1580-1587

24. Bichler KH, Kirchner Ch, Ideler V. Uromucoid excretion in normal individuals and stone formers. Br J Urol 1976; 47: 733-738

25. Samuell CT. Uromucoid excretion in normal subjects, calcium stone formers and in patients with chronic renal failure. Urol Res 1979; 7: 5-12

26. Thornley C, Dawnay A, Cattell WR. Human TammHorsfall glycoprotein: urinary and plasma levels in normal subjects and patients with renal disease determined by a fully validated radioimmunoassay. Clin Sci 1985; 68: 529-535

27. Scurr DS, Robertson WG. Modifiers of calcium oxalate crystallization found in urine. II. Studies on their mode of action in an artificial urine. J Urol 1986; 136: 128-131

28. Hess B, Zipperle L, Jaeger Ph. Citrate and calcium effects on Tamm-Horsfall glycoprotein as a modifier of calcium oxalate crystal aggregation. Am J Physiol 1993; 265: F784-779

29. Hebert SC. Bartter syndrome. Curr Opin Nephrol Hypertens 2003; 12: 527-532

30. Peters M, Ermert S, Jeck N et. al. Classification and rescue of ROMK mutations underlying hyperprostaglandin E syndrome/antenatal Bartter syndrome. Kidney Int 2003; 64: 923932

31. Зверев ЯФ, Брюханов ВМ, Лампатов ВВ. Заболевания и синдромы, обусловленные генетическими нарушениями почечного транспорта электролитов. Нефрология 2004; 8 (4): 11-24

32. Ying WZ, Sanders PW. Dietary salt regulates expression of Tamm-Horsfall glycoprotein in rats. Kidney Int 1998; 54 (4):1150-1156

33. Bachmann S, Dawnay AB, Bouby N, Bankir L. TammHorsfall protein excretion during chronic alterations in urinary concentration and protein intake in the rat. Renal Physiol Biochem 1991; 14: 236-245

34. Bachmann S, Mutig K, Bates J et al. Renal effects of Tamm-Horsfall protein (uromodulin) deficiency in mice. Am J Physiol Renal Physiol 2005; 288: F559-F567

35. Rampoldi L, Caridi G, Santon D et al. Allelism of MCKD, FJHN and GCKD caused by impairment of uromodulin export dynamics. Hum Mol Genet 2003; 15: 3369-3384

36. Schmitt R, Kahl T, Mutig K, Bachmann S. Selectively reduced expression of thick ascending limb Tamm-Horsfall protein in hypothyroid kidneys. Histochem Cell Biol 2004; 121 (4): 319-327

37. Fruhauf JH, Welker P, Mutig K et. al. Lipid raft association of essential proteins of the thick ascending limb. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 561A

38. Kim GH, Ecelbarger CA, Mitchell C et. al. Vasopressin increases Na-K-2Cl cotransporter expression in thick ascending limb of Henle’s loop. Am J Physiol Renal Physiol 1999; 276: F96-F103

39. Grant AMS, Baker LRI, Neuberger A. Urinary TammHorsfall glycoprotein in certain kidney diseases and its content in renal and bladder calculi. Clin Sci 1973; 44: 377-384

40. Bichler KH. Thirty-eight years of stone meetings in Europe. Urol Res 2006; 34 (2): 70-78

41. Knorle R, Schnierle P, Koch A et. al. Tamm-Horsfall Glycoprotein: Role in Inhibition and Promotion of Renal Calcium Oxalate Stone Formation Studied with Fourier-Transform Infrared Spectroscopy. Clin Chem 1994; 40 (9): 1739-1743

42. Khan SR. Interactions between stone-forming calcific crystals and macromolecules. Urol Int 1997; 59: 59-71

43. Doyle IR, Ryall RL, Marshall VR. Inclusion of proteins into calcium oxalate crystals precipitated from human urine: a highly selective phenomenon. Clin Chem 1991; 37: 1589-1594

44. Kulaksizoglu S, Sofikerim M, Cevik C. Impact of various modifiers on calcium oxalate crystallization. J Urol 2007; 14: 214218

45. Hess B, Jordi S, Zipperle L et. al. Citrate determines calcium oxalate crystallization kinetics and crystal morphology-studies in the presence of Tamm-Horsfall protein of a healthy subject and a severely recurrent calcium stone former. Nephrol Dial Transplant 2000; 15 (3): 366-374

46. Kumar V, Peсa de la Vega L, Farell G, Lieske JC. Urinary macromolecular inhibition of crystal adhesion to renal epithelial cells is impaired in male stone formers. Kidney Int 2005; 68 (4): 1784-1792

47. Mo L, Huang HY Zhu XH et al. Tamm-Horsfall protein is a critical renal defense factor protecting against calcium oxalate crystal formation. Kidney Int 2004; 66 (3): 1159-1166

48. Wiks^m B, Wieslander J. Excretion of Tamm-Horsfall urinary glycoprotein (uromucoid) in renal stone formers. In: Smith LH et al. eds. Urolithiasis, Clinical and Basic Research. Plenum Press, New York, 1981; 685-688

49. Erwin DT, Kok DJ, Alam J et al. Calcium oxalate stone agglomeration reflects stone-forming activity: citrate inhibition depends on macromolecules larger than 30 kilodalton. Am J Kidney Dis 1994; 24 (6): 893-900

50. Romero MC, Nocera S, Nesse AB. Decreased TammHorsfall protein in lithiasic patients. Clin Biochem 1997; 30 (1): 63-67

51. Hess B, Nakagawa Y, Parks JH, Coe FL. Molecular abnormality of Tamm-Horsfall glycoprotein in calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol 1991; 260 (4 Pt 2): F569-578

52. Boevй ER, Cao LC, De Bruijn WC et. al. Zeta potential distribution on calcium oxalate crystal and Tamm-Horsfall protein surface analyzed with Doppler electrophoretic light scattering. J Urol 1994; 152 (2 Pt 1): 531-536

53. Storey EL, Anderson GJ, Mack U et. al. Desialylated transferrin as a serological marker of chronic excessive alcohol ingestion. Lancet 1987; i: 1292-1294

54. Rademacher TW, Parekh RB, Dwek RA. Glycobiolor. Ann Rev Biochem 1988; 57: 785-838

55. Sumitra K, Pragasam V, Sakthivel R et al. Benefecial

effect of vitamin E supplementation on the biochemical and kinetic properties of Tamm-Horsfall glycoprotein in hypertensive and hyperoxaluric patients. Nephrol Dial Transplant 2005; 20: 1407 -1415

56. FranzMn A, Heinegerd D. Isolation and characterization of two sialoproteins present only in bone calcified matrix. Biochem J 1985; 232 (3): 715-724

57. Olberg A, Franzen A, Heidengard D. Cloning and sequence analysis of rat bone sialoprotein (osteopontin) cDNA reveals an Arg-Gly-Asp cell-binding sequence. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83 (23): 8819-8823

58. Helfrich MH, Nesbitt SA, Dorey EL, Horton MA. Rat osteoclasts adhere to a wide range of RGD (Arg-Gly-Asp) peptide-containing proteins, including the bone sialoproteins and fibronectin, a b3 integrin. J Bone Miner Res 1992; 7: 335-343

59. Butler WT. Structural and functional domains of osteopontin. Ann N YAcad Sci 1995; 760: 6-11

60. Hu DD, Lin EC, Kovach NL et al. A biochemical characterization of the binding of osteopontin to integrins alpha v beta 1 and alpha v beta 5. J Biol Chem 1995; 270: 2623226238

61. Liaw L, Skinner MP, Raines EW et al. The adhesive and migratory effects of osteopontin are mediated via distinct cell surface integrins: Role of alpha v beta 3 in smooth muscle cell migration to osteopontin in vitro. J Clin Invest 1995; 95: 713724

62. Weber GF, Ashkar A, Glimcher MJ, Cantor H. Receptor-ligand interaction between CD44 and osteopontin (Eta-1). Science 1996; 271: 509-512

63. Sibalic V, Fan X, Loffing J, Wuthrich RP Upregulated renal tubular CD44, hyaluronan, and osteopontin in kdkd mice with interstitial nephritis. Nephrol Dial Transplant 1997; 12: 1344-1353

64. Sodek J, Ganss B, McKee MD. Osteopontin. Crit Rev Oral Biol Med 2000; 11: 279-303

65. Verhulst A, Asselman M, Persy VP et al. Crystal retention capacity of cells in the human nephron: involvement of CD44 and its ligands hyaluronic acid and osteopontin in the transition of a crystal binding - into a nonadherent epithelium. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 107-115

66. Yokosaki Y, Tanaka K, Higashikawa F et al. Distinct structural requirements for binding of the integrins alphavbeta6, alphavbeta3, alphavbeta5, alpha5beta1 and alpha9beta1 to osteopontin. Matrix Biol 2005; 24 (6): 418-427

67. Christensen B, Petersen TE, Swrensen ES. Post-translational modification and proteolytic processing of urinary osteopontin. Biochem J 2008; 411: 53-61

68. Butler WT. The nature and significance of osteopontin. Connect Tissue Res 1989; 23: 123-136

69. Brown LF, Van de Water L, Papadopoulos-Sergiou A et al. Expression and distribution of osteopontin in human tissues: Widespread association with luminal epithelial surfaces. Mol Biol Cell 1992; 2: 1169-1180

70. Giachelli C, Bae N, Lombardi D et al. Molecular cloning and characterization of 2B7, a rat mRNA which distinguishes smooth muscle cell phenotypes in vitro and is identical to osteopontin (secreted phosphoprotein I, 2aR). Biochem Biophys Res Commun 1991; 177: 867-873

71. Giachelli CM, Liaw L, Murry CE et al. Osteopontin expression in cardiovascular diseases. Ann N Y Acad Sci 1995; 760: 109-126

72. Murry CE, Giachelli CM, Schwartz SM, Vracko R. Macrophages express osteopontin during repair of myocardial necrosis. Am J Pathol 1994; 145: 1450-1462

73. Sorensen S, Justesen SJ, Johnsen AH. Identification of a macromolecular crystal growth inhibitor in human urine as osteopontin. Urol Res 1995; 23: 327-334

74. Min W, Shiraga H, Chalko C et al. Quantitative studies of human urinary excretion of uropontin. Kidney Int 1998; 53: 189-193

75. Gericke A, Qin C, Spevak L et al. Importance of phosphorylation for osteopontin regulation of biomineralization. Calcif Tissue Int 2005; 77 (1): 45-54

76. Nomura S, Wills AJ, Edwards DR et al. Developmental

expression of 2ar (osteopontin) and SPARC (osteonectin) RNA as revealed by in situ hybridization. J Cell Biol 1988; 106: 441-450

77. Patarca R, Freeman GJ, Singh RP et al. Structural and functional studies of the early T lymphocyte activation 1 (Eta-1) gene: Definition of a novel T cell-dependent response associated with genetic resistance to bacterial infection. J Exp Med 1989; 170: 145-161

78. Shiraga H, Min W, VanDusen WJ et al. Inhibition of calcium oxalate crystal growth in vitro by uropontin: Another member of the aspartic acid-rich protein superfamily. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 426-430

79. Kohri K, Nomura S, Kitamura Y et al. Structure and expression the mRNA encoding urinary stone protein (osteopontin). J Biol Chem 1993; 268 (15): 15180-15184

80. Denhardt DT, Guo X. Osteopontin: A protein with diverse functions. FASEB J 1993; 7: 1475-1482

81. Uede T, Katagiri X Iizuka J, Murakami M. Osteopontin, a coordinator of host defense system: A cytokine or an extracellular adhesive protein? Microbiol Immunol 1997; 41: 641-648

82. O’Brien EK, Garvin MR, Stewart DK et al. Osteopontin is synthesized by macrophage, smooth muscle, and endothelial cells in primary and restenotic human coronary atherosclerotic plaques. Arterioscler Thromb 1994; 14: 1648-1656

83. Giachelli CM, Lombardi D, Johnson RJ et al. Evidence for a role of osteopontin in macrophage infiltration in response to pathological stimuli in vivo. Am J Pathol 1998; 152: 353-358

84. Liaw L, Birk DE, Ballas CB et al. Altered wound healing in a mice lacking a functional osteopontin gene (spp1). J Clin Invest 1998; 101: 1468-1478

85. Scatena M, Almeida M, Chaisson ML et al. NF-kappaB mediates alphavbeta3 integrin-induced endothelial cell survival. J Cell Biol 1998; 141: 1083-1093

86. Katagiri X Sleeman J, Fujii H et al. CD44 variants but not CD44s cooperate with 11-containing integrins to permit cells to bind to osteopontin independently of Arg-Gly-Asp acid, thereby stimulating cell motility and chemotaxis. Cancer Res 1999; 59: 219-226

87. Ophascharoensuk V, Giachelli CM, Gorant K et al. Obstructive uropathy in the mouse: role of osteopontin in interstitial fibrosis and apoptosis. Kidney Int 1999; 56: 571-580

88. Sodek J, Batista Da Silva AP, Zohar R. Osteopontin and mucosal protection. J Dent Res 2006; 85 (5): 404-415

89. Denhardt DT, Noda M, O’Regan AW et al. Osteopontin as a means to cope with environmental insults: regulation of inflammation, tissue remodeling, and cell survival. J Clin Invest 2001;107: 1055-1061

90. Carlinfante G, Vassiliou D, Svensson O et al. Differential expression of osteopontin and bone sialoprotein in bone metastasis of breast and prostate carcinoma. Clin Exp Metastasis 2003; 20 (5): 437-444

91. Meller R, Stevens SL, Minami M et al. Neuroprotection by osteopontin in stroke. J Cereb Blood Flow Metab 2005; 25 (2): 217-225

92. Hunter GK, Kyle CL, Goldberg HA. Modulation of crystal formation by bone phosphoproteins: structural specificity of the osteopontin-mediated inhibition of hydroxyapatite formation. Biochem J 1994; 300: 723-728

93. Hunter GK, Hauschka PV, Poole AR et al. Nucleation and inhibition of hydroxyapatite formation by mineralized tissue proteins. Biochem J 1996; 317: 59-64

94. Rittling SR, Matsumo HN, McKee MD et al. Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro. J Bone Miner Res 1998; 13: 1101-1111

95. Boskey AL, Spevak L, Paschalis E et al. Osteopontin deficiency increases mineral content and mineral crystallinity in mouse bone. Calcif Tissue Int 2002; 71: 145-154

96. Yoshitake H, Rittling SR, Denhardt DT, Noda M. Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 156-160

97. Prince CW, Butler WT. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 regulates the biosynthesis of osteopontin, a bone-derived cell

attachment protein, in clonal osteoblast-like osteosarcoma cells. Collagen Rel Res 1987; 7: 305-313

98. Noda M, Rodan GA. Transcriptional regulation of osteopontin production in rat osteoblast-like cells by parathyroid hormone. J Biol Chem 1989; 108: 713-718

99. Noda M, Vogel RL, Craig AM et al. Identification of a DNA sequence responsible for binding of the 1,25-dihydroxyvitamin D3 receptor and 1,25-dihydroxyvitamin D3 enhancement of mouse secreted phosphoprotein 1 (SPP-1 or osteopontin) gene expression. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 9995-9999

100. Chang PL, Prince CW. 1 Alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 stimulates synthesis and secretion of nonphosphorylated osteopontin (secreted phosphoprotein 1) in mouse JB6 epidermal cells. Cancer Res 1994; 51: 2144-2150

101. Ihara H, Denhardt DT, Furuya K et al. Parathyroid hormone-induced bone resorption does not occur in the absence of osteopontin. J Biol Chem 2001; 276: 13065-13071

102. Niskanen LK, Suhonen M, Siitonen O et al. Aortic and lower limb artery calcification in type II (non-insulin-dependent) diabetic patients and non-diabetic control subjects: a five year follow-up study. Atherosclerosis 1990; 84: 61-71

103. Locker TH, Schwartz RS, Cotta CW, Hickman JR. Fluoroscopic coronary artery calcification and associated coronary disease in asymptomatic young men. J Am Coll Cardiol 1992; 19: 1167-1172

104. Puentes G, Detrano R, Tang W et al. Estimation of coronary calcium mass using electron beam computed tomography: a promising approach for predicting coronary events? Circulation 1995; 92: I313

105. Deneke T, Langner K, Gewe PH et al. Ossification in atherosclerotic carotid arteries. Z Kardiol 2001; 90 (Suppl 3): III/106-III/115

106. Olson JC, Edmundowicz D, Becker DJ et al. Coronary calcium in adults with type 1 diabetes: a stronger correlate of clinical coronary artery disease in men than in women. Diabetes 2000; 49: 1571-1578

107. Hirota S, Imakita M, Kohri K et al. Expression of osteopontin messenger RNA by macrophages in atherosclerotic plaques. A possible association with calcification. Am J Pathol 1993; 143: 1003-1008

108. Ikeda T, Shirasawa T, Esaki Y et al. Osteopontin mRNA is expressed by smooth muscle-derived foam cells in human atherosclerotic lesions of the aorta. J Clin Invest 1993; 92: 28142820

109. Shanahan CM, Cary NR, Metcalfe JC, Weissberg PL. High expression of genes for calcification-regulating proteins in human atherosclerotic plaques. J Clin Invest 1994; 93: 23932402

110. O’Brien KD, Kuusisto J, Reichenbach DD et al. Osteopontin is expressed in human aortic valvular lesions. Circulation 1995; 92: 2163-2168

111. Srivatsa SS, Harrity PJ, Maercklein PB et al. Increased cellular expression of matrix proteins that regulate mineralization is associated with calcification of native human and porcine xenograft bioprosthetic heart valves. J Clin Invest 1997;99: 996-1009

112. Wada T, McKee MD, Steitz S, Giachelli CM. Calcification of vascular smooth muscle cell cultures: inhibition by osteopontin. Circ Res 1999; 84: 166-178

113. Chen J, Singh K, Mukherjee BB, Sodek J. Developmental expression of osteopontin (OPN) mRNA in rat tissues: Evidence for a role for OPN in bone formation and resorption. Matrix 1993; 13: 113-123

114. Madsen KM, Zhang L., Abu Shamat AR et al. Ultrastructural localization of osteopontin in the kidney: Induction by lipopolysaccharide. J Am Soc Nephrol 1997; 8: 1043-1053

115. Rogers SA, Padanilam BJ, Hruska KA et al. Metanephric osteopontin regulates nephrogenesis in vitro. Am J Physiol 1997; 272: F469-F476

116. Giachelli CM, Pichler R, Lombardi D et al. Osteopontin expression in angiotensin II-induced tubulointerstitial nephritis. Kidney Int 1994; 45: 515-524

117. Pichler RH, Giachelli CM, Lombardi D et al. Tubulointerstitial disease in glomerulonephritis: Potential role of osteopontin (uropontin). Am J Pathol 1994; 144: 915-926

118. Pichler RH, Franceschini N, Young BA et al. Pathogenesis of cyclosporine nephropathy: Roles of angiotensin

II and osteopontin. J Am Soc Nephrol 1995; 6: 1186-1196

119. Magil AB, Pichler RH, Johnson RJ. Osteopontin in chronic puromycin aminonucleoside nephrosis. J Am Soc Nephrol 1997; 18: 1383-1390

120. Lopez CA, Hoyer JR, Wilson PD et al. Heterogeneity of osteopontin expression among nephrons in mouse kidneys and enhanced expression in sclerotic glomeruli. Lab Invest 1993; 69:355-363

121. Kleinman JG, Beshensky A, Worcester EM, Brown D. Expression of osteopontin, a urinary inhibitor of stone mineral crystal growth, in rat kidney. Kidney Int 1995; 47: 1585-1596

122. Hudkins KL, Giachelli CM, Cui Y et al. Osteopontin expression in fetal and mature human kidney. J Am Soc Nephrol 1999; 10: 444-457

123. Worcester EM, Blumenthal SS, Beshensky AM, Lewand DL. The calcium oxalate crystal growth inhibitor protein produced by mouse kidney cortical cells in culture is osteopontin. J Bone Miner Res 1992; 7: 1029-1036

124. Hoyer JP, Otvos LJr, Urge L. Osteopontin in urinary stone formation. Ann N Y Acad Sci 1995; 760: 257-265

125. Worcester EM, Beshensky AM. Osteopontin inhibits nucleation of calcium oxalate crystals. Ann N Y Acad Sci 1995; 760:375-377

126. Wesson JA, Worcester EM, Weissner JH et al. Control of calcium oxalate crystal structure and cell adherence by urinary macromolecules. Kidney Int 1998; 53: 952-957

127. Umekawa T. Structural characteristics of osteopontin for calcium oxalate crystal. Nippon Hinyokika Gakkai Zasshi 1999; 90 (3): 436-444

128. Asplin JR, Arsenault D, Parks JH et al. Contribution of human uropontin to inhibition of calcium oxalate crystallization. Kidney Int 1998; 53: 194-199

129. Lieske JC, Leonard R, Toback FG. Adhesion of calcium oxalate monohydrate crystals to renal epithelial cells is inhibited by specific anions. Am J Physiol 1995; 268: F604-F612

130. Lieske JC, Hammes MS, Hoyer JR, Toback FG. Renal cell osteopontin production is stimulated by calcium oxalate monohydrate crystals. Kidney Int 1997; 51: 679-686

131. Gokhale JA, Glenton PA, Khan SR. Localization of Tamm-Horsfall peotein and osteopontin in a rat nephrolithiasis model. Nephron 1996; 73: 456-461

132. Jiang XJ, Feng T, Chang LS et al. Expression of osteopontin mRNA in normal and stone-forming rat kidney. Urol Res 1998; 26: 389-394

133. Yagisawa T, Chandhoke S, Fan J, Lucia S. Renal osteopontin expression in experimental urolithiasis. J Endourol 1998; 12: 171-176

134. Yasui T, Fujita K, Sasaki S et al. Expression of bone matrix proteins in urolithiasis model rats. Urol Res 1999; 27: 255-261

135. Beshensky AM, Wesson JA, Kleinman JG et al. Renoprotective modulation of calcium oxalate crystal structure by osteopontin in vivo. J Am Soc Nephrol 2000; 11: 558A

136. Mazzali M, Kipari T, Ophascharoensuk V et al. Osteopontin - A molecule for all seasons. QJM 2002; 95 (1): 3-13

137. Wesson JA, Johnson RJ, Mazzali M et al. Osteopontin is a critical inhibitor of calcium oxalate crystal formation and retention in renal tubules. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 139-147

138. Mo L, Liaw L, Evan AP et al. Renal calcinosis and stone formation in mice lacking osteopontin, Tamm-Horsfall protein, or both. Am J Physiol Renal Physiol 2007; 293: F1935-F1943

139. Yasui T, Fujita K, Hayashi Y et al. Quantification of osteopontin in the urine of healthy and stone-forming men. Urol Res 1999; 27: 225-230

140. Nishio S, Hatanaka M, Takeda H et al. Calcium

phosphate crystal-associated proteins: alpha2-HS-

glycoprotein, prothrombin F1, and osteopontin. Mol Urol 2000; 4: 383-390

141. Huang HS, Ma MC, Chen CF, Chen J. Lipid peroxidation and its correlations with urinary levels of oxalate, citric acid, and osteopontin in patients with renal calcium oxalate stones. Urology 2003; 62 (6): 1123-1128

142. Tsuji H, Tohru U, Hirotsugu U et al. Urinary concentration of osteopontin and association with urinary supersaturation and crystal formation. Int J Urol 2007; 14 (7): 630-634

143. Bautista DS, Denstedt J, Chambers AF, Harris JF. Low-molecular-weight variants of osteopontin generated by serine proteinases in urine of patients with kidney stones. J Cell Biochem 1996; 61: 402-409

144. Hedgepeth RC, Yang L, Resnick MI, Marengo SR. Expression of proteins that inhibit calcium oxalate crystallization in vitro in the urine of normal and stone-forming individuals. Am J Kidney Dis 2001; 37: 104-112

145. Kleinman LG, Wesson JA, Hughes J. Osteopontin and calcium stone formation. Nephron Physiol 2004; 98: 43-47

146. Yamate T, Tsuji H, Amasaki N et al. Analysis of osteopontin DNA in patients with urolithiasis. Urol Res 2000; 28: 159-166

147. Gao B, Yasui T, Okada A et al. A polymorphism of the osteopontin gene is related to urinary calcium stones. J Urol 2005; 174: 1472-1476

148. Christensen B, Kazanecki CC, Petersen TE et al. Cell type-specific post-translational modifications of mouse osteopontin are associated with different adhesive properties. J Biol Chem 2007; 282 (27): 19463-19472

149. Addadi L., Weiner S. Interactions between acidic proteins and crystals: Stereochemical requirements in biomineralization. Proc Natl Acad Sci USA 1985; 82: 4110-4114

150. Wesson JA, Worcester E. Formation of hydrated calcium oxalate in the presence of poly-L-aspartic acid. Scanning Microsc 1996; 10: 415-424

151. Beshensky AM, Wesson JA, Worcester EM et al. Effects of urinary macromolecules on hydroxyapatite crystal formation. J Am Soc Nephrol 2001; 12: 2108-2116

152. Jung T, Sheng X, Choi CK et al. Probing crystallization of calcium oxalate monohydrate and the role of macromolecule additives with in situ atomic force microscopy. Langmuir 2004; 20:8587-8596

153. Taller A, Grohe B, Rogers KA et al. Specific adsorption of osteopontin and synthetic polypeptides to calcium oxalate monohydrate crystals. Biophys J 2007; 93 (5): 1768-1777

154. Kohri K, Suzuki Y Yoshida K et al. Molecular cloning and sequencing of cDNA encoding urinary stone protein, which is identical to osteopontin. Biochem Biophys Res Commun 1992; 184: 859-864

155. Yamate T, Kohri K, Umekawa T et al. The effect of osteopontin on the adhesion of calcium oxalate crystals to Madin-Darby canine kidney cells. Eur Urol 1996; 30: 388-393

156. Yamate T, Kohri K, Umekawa T et al. Interaction between osteopontin on Madin-Darby canine kidney cell membrane and calcium oxalate crystal. Urol Res 1999; 62: 8186

157. Konya E, Umekawa T, Iguchi M, Kurita T. The role of osteopontin on calcium oxalate crystal formation. Eur Urol 2003; 43 (5): 564-571

158. Yasui T, Fujita K, Asai K, Kohri K. Osteopontin regulates adhesion of calcium oxalate crystals to renal epithelial cells. Int J Urol 2002; 9 (2): 100-108

159. Okada A, Nomura S, Saeki Y et al. Morphological conversion of calcium oxalate crystals into stones is regulated by osteopontin in mouse kidney. J Bone Miner Res 2008; 23 (10): 1629-1637

160. Swrensen ES, Hwjrup P, Petersen TE. Posttranslational modifications of bovine osteopontin: identification of twenty-eight phosphorylation and three O-glycosylation sites. Protein Sci 1995; 4: 2040-2049

161. Christensen B, Nielsen MS, Haselmann KF et al. Post-translationally modified residues of native human osteopontin are located in clusters: identification of 36 phosphorylated and five O-glycosylation sites and their biological implications. Biochem J 2005; 390: 285-292

162. Keykhosravani M, Doherty-Kirby A, Zhang C et al. Comprehensive identification of post-translational modifications of rat bone osteopontin by mass spectrometry. Biochemistry 2005; 44: 6990-7003

163. Boskey AL, Maresca M, Ullrich W et al. Osteopontin-hydroxyapatite interactions in vitro: Inhibition of hydroxyapatite formation and growth in gelatin-gel. Bone Miner 1993; 22: 147159

164. Boskey AL. Osteopontin and related phosphorylated sialoproteins: effects on mineralization. Ann N Y Acad Sci 1995; 760:249-256

165. Goldberg HA, Warner KJ, Li MC, Hunter GK. Binding of bone sialoprotein, osteopontin and synthetic polypeptides to hydroxyapatite. Connect Tissue Res 2001; 42: 25-37

166. Hoyer JR, Asplin JR, Otvos L. Phosphorylated osteopontin peptides suppress crystallization by inhibiting the growth of calcium oxalate crystals. Kidney Int 2001; 60: 77-82

167. Steitz SA, Speer MY, McKee MD et al. Osteopontin inhibits mineral deposition and promotes regression of ectopic calcification. Am J Pathol 2002; 161 (6): 2035-2046

168. Chen X Bal BS, Gorski JP Calcium and collagen binding properties of osteopontin, and bone acidic glycoprotein-75 from bone. J Biol Chem 1992; 276: 24871-24878

169. Coe FL, Boyce WH, Friedman GD et al. Prevention and treatment of kidney stones. J Urol 1989; 141: 804-808

170. Sheng X, Ward MD, Wesson JA. Crystal surface adhesion explains the pathological activity of calcium oxalate hydrates in kidney stone formation. J Am Soc Nephrol 2005; 16 (7): 1904-1908

171. Ryall RL, Chauvet MC, Grover PK. Intracrystalline proteins and urolithiasis: a comparison of the protein content and ultrastructure of urinary calcium oxalate monohydrate and dihydrate crystals. BJU International 2005; 96 (4): 654-663

172. Falini G, Albeck S, Weiner S, Addadi L. Control of aragonite or calcite polymorphism by mollusk shell macromolecules. Science 1996; 271: 67-69

173. Жариков АЮ, Зверев ЯФ, Брюханов ВМ, Лампатов ВВ. Современные представления о модуляторах оксалатного нефролитиаза. I. Стимуляторы камнеобразования. Нефрология 2009; 13 (1): 56-72

174. Tomazie BB, Nancollas GH. The kinetics of dissolution of calcium oxalate hydrates II. The dihydrate. Invest Urol 1980; 18: 97-101

175. Lepage L, Tawashi R. Growth and characterization of calcium oxalate dihydrate crystals (weddellite). J Pharm Sci 1982; 71: 1059-1062

176. Wiessner JH, Mandel GS, Mandel NS. Membrane interactions with calcium oxalate crystals: variation in haemolytic potentials with crystal morphology. J Urol 1986; 135:835-839

177. Wiessner JH, Hung LY, Mandel NS. Crystal attachment to injured renal collecting duct cells. Influence of urine proteins and pH. Kidney Int 2003; 63: 1313-1320

178. Ryall RL, Fleming DE, Grover PK et al. The hole truth. Intracrystalline proteins and calcium oxalate kidney stones. Mol Urol 2000; 4: 391-402

179. Ryall RL, Fleming DE, Doyle IR et al. Intracrystalline proteins and the hidden ultrastructure of calcium oxalate urinary crystals: Implications for kidney stone formation. J Struct Biol 2001; 134: 5-14

180. Fleming DE, van Riessen A, Chauvet MC et al. Intracrystalline proteins and urolithiasis: a synchrotron X-ray diffraction study of calcium oxalate monohydrate. J Bone Min Res 2003; 18: 1282-1291

181. Canales BK, Anderson L, Higgins L et al. Second prize: Comprehensive proteomic analysis of human calcium oxalate monohydrate kidney stone matrix. J Endourol 2008; 22 (6): 11611167

182. Merchant ML, Cummins TD, Wilkey DW et al. Proteomic analysis of renal calculi indicates an important role for inflammatory processes in calcium stone formation. Am J Physiol Renal Physiol 2008; 295: F1254-F1258

183. Hoyer JR. Uropontin in urinary calcium stone formation. Miner Electrolyte Metab 1995; 20: 385-392

184. Atmani F, Opalko FJ, Khan SR. Association of urinary macromolecules with calcium oxalate crystals induced in vitro in normal human and rat urine. Urol Res 1996; 24: 45-50

185. Webber D, Rodgers AL, Sturrock ED. Selective inclusion of proteins into urinary calcium oxalate crystals: comparison between stone-prone and stone-free population groups. J Cryst Growth 2003; 259: 179-189

186. Chauvet MC, Ryall RL. Intracrystalline proteins and calcium oxalate crystal degradation in MDCK II cells. J Struct Biol 2005; 151: 12-17

187. Grover PK, Thurgood LA, Fleming DE et al. Intracrystalline urinary proteins facilitate degradation and dissolution of calcium oxalate crystals in cultured renal cells. Am J Physiol Renal Physiol 2008; 294: F355-F361

188. Le Hir M, Dubach UC, Schmidt U. Quantitative distribution of lysosomal hydrolases in the rat nephron. Histochemistry 1979; 63: 245-251

189. Khan SR, Shevock PN, Hackett RL. Urinary enzymes and calcium oxalate urolithiasis. J Urol 1989; 142: 846-849

190. Singh AK. Presence of lysosomal enzymes in the normal glomerular basement membrane matrix. Histochem J 1993; 25: 562-568

191. Kudo S, Miyamoto G, Kawano K. Proteases involved in the metabolic degradation of human interleukin-11 by rat kidney lysosomes. J Interferon Cytokine Res 1999; 19: 361-367

192. de Bruijn WC, Boeve ER, van Run PR et al. Etiology of experimental calcium oxalate monohydrate nephrolithiasis in rats. Scanning Micr Int 1994; 8: 541-550

193. de Water R, Nordermeer C, van der Kwast TH et al. Calcium oxalate nephrolithiasis: effect of renal crystal deposition on the cellular composition of the renal interstitium. Am J Kidney Dis 1999; 33: 761-771

194. de Water R, Nordemeer C, Houtsmuller AS et al. Role of macrophages in nephrolithiasis in rats: an analysis of the renal interstitium. Am J Kidney Dis 2000; 36: 615-625

195. Khan SR, Byer KJ, Thamilselvan S et al. Crystal-cell interaction and apoptosis in oxalate-associated injury of renal epithelial cells. J Am Soc Nephrol 1999; 10: S457-S463

196. Umekawa T, Chegini N, Khan SR. Increased expression of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) by renal epithelial cell in culture on exposure to calcium oxalate, phosphate and uric acid crystals. Nephrol Dial Transplant 2003; 18: 664-669

197. Khan SR, Shevock PN, Hackett RL. Acute hyperoxaluria, renal injury and calcium oxalate urolithiasis. J Urol 1992; 147: 226-230

198. Lieske JC, Deganello S, Toback GF. Cell-crystal interactions and kidney stone formation. Nephron 1999; 81 (Suppl 1): 8-17

199. Тиктинский ОЛ, Александров ВП. Мочекаменная болезнь. СПб: Питер, 2000; 29-30

200. Steinbuch M, Loeb J. Isolation of an a2-globulin from human plasma. Nature 1961; 192: 1196

201. Heide K, Heimburger N, Haupt H. An inter-a-trypsin inhibitor of human serum. Clin Chim Acta 1965; II: 82-85

202. Fries E, Kaczmarczyk A. Inter-a-inhibitor, hyaluronan and inflammation. Acta Biochim Pol 2003; 50 (3): 735-742

203. Chen L, Mao SJT, Larsen WJ. Identification of a factor in fetal bovine serum that stabilizes the cumules extracellular matrix, a role for member of the inter-alpha-inhibitor family. J Biol Chem 1992; 267: 12380-12386

204. Balduyck M, Laroui S, Mizon C, Mizon J. A proteoglycan related to the urinary trypsin inhibitor. Biol Chem Hoppe-Seyler 1989; 370: 331-336

205. Enghild JJ, Thogersen IB, Pizzo SV, Salvesen G. Analysis of inter-alpha-trypsin inhibitor and a novel trypsin inhibitor, pre-alpha-trypsin inhibitor, from human plasma: Polypeptide chain stoichiometry and assembly by glycan. J Biol Chem 1989; 264: 15975-15981

206. Malki N, Balduyck M, Maes P et al. The heavy chains of human plasma inter-alpha-trypsin inhibitor: Their isolation, their identification by electrophoresis and partial sequencing. Biol Chem Hoppe-Seyler 1992; 373: 1009-1018

207. Rouet P, Raguenez G, Tronche F et al. A potent enhancer

made of clustered liver specific elements in the transcription control sequences of human alpha1-microglobulin/bikunin gene. J Biol Chem 1992; 267: 20765-20773

208. Hochstrasser K, Bretzel G, Feuth H et al. The inter-±-trypsin inhibitor as precursor of the acid-stable protease inhibitors in human serum and urine. Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 1976; 357: 153-162

209. Dietl T, Dobrinski W, Hochstrasser K. Human inter-±-trypsin inhibitor: Limited proteolysis by trypsin, plasmin, kallikrein, and granulocytic elastase and inhibitory properties of the cleavage products. Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 1979; 360: 1313-1318

210. Potempa J, Kwon K, Chawla R, Travis J. Inter-a-trypsin inhibitor: Inhibition spectrum of native and derived forms. J Biol Chem 1989; 264: 15109-15114

211. Salier JP. a-trypsin inhibitor: Emergence of a family within the Kunitz-type protease inhibitor superfamily. Trends Biochem Sci 1990; 15: 435-439

212. Xu Y, Carr PD, Guss JM, Ollis DL. The crystal structure of bikunin from inter-alpha-inhibitor complex: a serine protease inhibitor with two Kunitz domains. J Mol Biol 1998; 276 (5): 955-966

213. Freis E, Blom AM. Bikunin - not just a plasma proteinase inhibitors. Int J Biochem Cell Biol 2000; 32 (2): 125137

214. Pugia MJ, Valdes RJr, Jortani SA. Bikunin (urinary trypsin inhibitor): structure, biological relevance, and measurement. Adv Clin Chem 2007; 44: 223-245

215. Wachter E, Hochstrasser K. Kunitz-type proteinase inhibitors derived by limited proteolysis of the inter-a-trypsin inhibitor, IY: the amino acid sequence of the human urinary trypsin inhibitor isolated by affinity chromatography. Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 1981; 362: 1351-1355

216. Kanayama N, El Maradney E, Halim A et al. Urinary trypsin inhibitor prevents uterine muscle contraction by inhibition of Ca++ influx. Am J Obstet Gynecol 1995; 173: 192199

217. Kanayama N, Halim A, Maehara K et al. Kunitz-type trypsin inhibitor prevents LPS-induced increase of cytosolic free Ca2+ in human neutrophils and HUVEC cells. Biochem Biophys Res Commun 1995; 207: 324-330

218. Maehara K, Kanayama N, Halim A et al. Down-regulation of interleukin-8 gene expression in HL60 cell line by human Kunitz-type trypsin inhibitor. Biochem Biophys Res Commun 1995; 206: 927-934

219. Zhuo L, Salustri A, Kimata K. A physiological function of serum proteoglycan bikunin: the chondroitin sulfate moiety plays a central role. Glycoconj J 2002; 19 (4-5): 241-247

220. Atmani F, Lacour B, Drueke T, Daudon M. Isolation and purification of a new glycoprotein from human urine inhibiting calcium oxalate crystallization. Urol Res 1993; 21: 61-66

221. Bratt T, Olsson H, Sjoberg EM et al. Cleavage of the a1-microglobulin-bikunin precursor is localized to the Golgi apparatus of rat liver cells. Biochem Biophys Acta 1993; 1157: 147-154

222. Atmani F, Khan SR. Characterization of uronic-acid-rich inhibitor of calcium oxalate crystallization isolated from rat urine. Urol Res 1995; 23: 95-101

223. Tang Y, Grover PK, Moritz RL et al. Is nephrocalcin related to the urinary derivative (bikunin) of inter-alpha-trypsin inhibitor? Br J Urol 1995; 75: 425-430

224. Atmani F, Lacour B, Jungers P et al. Molecular characteristics of uronic-acid-rich protein, a strong inhibitor of calcium oxalate crystallization in vitro. Biochem Biophys Res Commun 1993; 191: 1158-1165

225. Atmani F, Lacour B, Jungers P et al. Reduced inhibitory activity of uronic-acid-rich protein in urine of stone formers. 1994; 22: 257-260

226. Swrensen S, Hansen K, Bak S, Justesen SJ. An unidentified macromolecular inhibitory constituent of calcium oxalate crystal growth in human urine. Urol Res 1990; 18: 373-379

227. Atmani F, Mizon J, Khan SR. Identification of uronic-acid-rich protein as urinary bikunin the light chain of inter-a-inhibitor. Eur J Biochem 1996; 236: 984-990

228. Iida S, Peck AB, Johnson-Tardieu J et al. Temporal changes in mRNA expression for bikunin in the kidneys of rats during calcium oxalate nephrolithiasis. J Am Soc Nephrol 1999; 10: 986-996

229. Khan SR. Crystal-induced inflammation of the kidneys: results from human studies, animal models, and tissue-culture studies. Clin Exp Nephrol 2004; 8 (2): 75-88

230. Khan SR. Renal tubular damage/dysfunction: key to the formation of kidney stones. Urol Res 2006; 34 (2): 86-91

231. Grewal JC, Tsai JY, Khan SR. Oxalate-inducible AMBP gene and its regulatory mechanism in renal tubular epithelial cells. Biochem J 2005; 387 (Pt 3): 609-616

232. Iida S, Johnson-Tardieu J, Glenton P et al. Molecular detection of bikunin in normal and oxalate-exposed kidneys and renal epithelial cells. J Am Soc Nephrol 1997; 8: 563A

233. Atmani F, Glenton PA, Khan SR. Role of inter-alphainhibitor and its related proteins in experimentally induced calcium oxalate urolithiasis. Localization of proteins and expression of bikunin gene in the rat kidney. Urol Res 1999; 27 (1): 63-67

234. Moriyama MT, Glenton PA, Khan SR. Expression of inter-alpha-inhibitor related proteins in kidneys and urine of hyperoxaluric rats. J Urol 2001; 165 (5): 1687-1692

235. Okuyama M, Yamaguchi S, Yachiku S. Identification of bikunin isolated from human urine inhibits calcium oxalate crystal growth and its localization in the kidneys. Int J Urol 2003; 10 (10): 530-535

236. Atmani F, Mizon J, Khan SR. Inter-a-inhibitor: a protein family involved in the inhibition of calcium oxalate crystallization. Scanning Microsc 1996; 10: 425-433

237. Atmani F, Khan SR. Inter-a-inhibitor, another serum protein with potential involvement in calcium oxalate nephrolithiasis. J Am Soc Nephrol 1996; 7: 1798A

238. Ebisuno S, Nishihata M, Inagaki T et al. Bikunin prevents adhesion of calcium oxalate crystal to renal tubular cells in human urine. J Am Soc Nephrol 1999; 10 (Suppl 14): S436-S440

239. MwdMtognon-Benissan J, Tardivel S, Hennequin C et al. Inhibitory effect of bikunin on calcium oxalate crystallization in vitro and urinary bikunin decrease in renal stone formers. Urol Res 1999; 27 (1): 69-75

240. Atmani F, Khan SR. Role of urinary bikunin in the inhibition of calcium oxalate crystallization. J Am Soc Nephrol 1999; 10: S385-S388

241. Kobayashi H, Shibata K, Fujie M et al. Identification of structural domains in inter-a-trypsin inhibitor involved in calcium oxalate crystallization. Kidney Int 1998; 53: 1727-1735

242. Marengo SR, Resnick MI, Yang L, Chung JY. Differential expression of urinary inter-alpha-trypsin inhibitor trimers and dimers in normal compare to active calcium oxalate stone forming men. J Urol 1998; 159 (5): 1444-1450

243. Evan AP, Bledsoe S, Worcester EM et al. Renal interalpha-trypsin inhibitor heavy chain 3 increases in calcium oxalate stone-forming patients. Kidney Int 2007; 72 (12): 1503-1511

244. Suzuki M, Kobayashi H, Kageyama S et al. Excretion of bikunin and its fragments in the urine of patients with renal stones. J Urol 2001; 166 (1): 268-274

245. Moczydlowski E, Moss GW, Lucchesi KJ. Bovine pancreatic trypsin inhibitor as a probe of large conductance Ca(2+)-activated K+ channels at an internal site of interaction. Biochem Pharmacol 1992; 43: 21-28

246. Stapleton AM, Ryall RL. Crystal matrix protein-getting blood out of a stone. Miner Electrolyte Metab 1994; 20 (6): 399-409

247. Stapleton AM, Simpson RJ, Ryall RL. Crystal matrix protein is related to human prothrombin. Biochem Biophys Res Commun 1993; 195 (3): 1199-1203

248. Suzuki K, Moriyama M, Nakajima C et al. Isolation and partial characterization of crystal matrix protein as a potent inhibitor of calcium oxalate crystal aggregation: evidence of activation peptide of human prothrombin. Urol Res 1994; 22 (1): 45-50

249. Stapleton AM, Ryall RL. Blood coagulation proteins and urolithiasis are linked: crystal matrix protein is the F1

activation peptide of human prothrombin. Br J Urol 1995; 75 (6): 712-719

250. Stapleton AM, Dawson CJ, Grover PK et al. Further evidence linking urolithiasis and blood coagulation: urinary prothrombin fragment 1 is present in stone matrix. Kidney Int 1996; 49 (3): 880-888

251. Grover PK, Thurgood LA, Ryall RL. Effect of urine fractionation on attachment of calcium oxalate crystals to renal epithelial cells: implications for studying renal calculogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 2007; 292 (5): F1396-F1403

252. Atmani F, Glenton PA, Khan SR. Identification of proteins extracted from calcium oxalate and calcium phosphate crystals induced in the urine of healthy and stone forming subjects. Urol Res 1998; 26 (3): 201-207

253. Ryall RL. Glycosaminoglycans, proteins, and stone formation: adult themes and child’s play. Pediatr Nephrol 1996; 10 (5): 656-666

254. Ryall RL, Grover PK, Stapleton AM et al. The urinary F1 activation peptide of human prothrombin is a potent inhibitor of calcium oxalate crystallization in undiluted human urine in vitro. Clin Sci (Lond) 1995; 89 (5): 533-541

255. Grover PK, Ryall RL. Inhibition of calcium oxalate crystal growth and aggregation by prothrombin and its fragments in vitro: relationship between protein structure and inhibitory activity. Eur J Biochem 1999; 263 (1): 50-56

256. Grover PK, Ryall RL. Effect of prothrombin and its activation fragments on calcium oxalate crystal growth and aggregation in undiluted human urine in vitro: relationship between protein structure and inhibitory activity. Clin Sci (Lond) 2002; 102 (4): 425-434

257. Walton RC, Kavanagh JP, Heywood BR, Rao PN. The association of different urinary proteins with calcium oxalate hydromorphs. Evidence for non-specific interactions. Biochim Biophys Acta 2005; 1723 (1-3): 175-183

258. Gul A, Rez P. Models for protein binding to calcium oxalate surfaces. Urol Res 2007; 35 (2): 63-71

259. Webber D, Rodgers AL, Sturrock ED. Synergism

between urinary prothrombin fragment 1 and urine: a comparison of inhibitory activities in stone-prone and stone-free population groups. Clin Chem Lab Med 2002; 40 (9): 930936

260. Webber D, Radcliffe CM, Royle L et al. Sialylation of urinary prothrombin fragment 1 is implicated as a contributory factor in the risk of calcium oxalate kidney stone formation. FEBS J 2006; 273 (13): 3024-3037

261. Webber D, Rodgers AL, Sturrock ED. Glycosylation of prothrombin fragment 1 governs calcium oxalate crystal nucleation and aggregation, but not crystal growth. Urol Res 2007; 35 (6): 277-285

262. Buchholz NP, Kim DS, Grover PK at el. The effect of warfarin therapy on the charge properties of urinary prothrombin fragment 1 and crystallization of calcium oxalate in undiluted human urine. J Bone Miner Res 1999; 14 (6): 1003-1012

263. Wadelius M, Pirmohamed M. Pharmacogenetics of

warfarin: current status and future challenges.

Pharmacogenomics J 2007; 7 (2): 99-111

264. Stapleton AM, Timme TL, Ryall RL. Gene expression of pr othrombin in the human kidney and its potential relevance to kidney stone disease. Br J Urol 1998; 81 (5): 666671

265. Grover PK, Miyazawa K, Coleman M et al. Renal prothrombin mRNA is significantly decreased in a hyperoxaluric rat model of nephrolithiasis. J Pathol 2006; 210 (3): 273-281

266. Hof M, Fleming GR, Fidler V. Time-resolved fluorescence study of a calcium-induced conformational change in prothrombin fragment 1. Proteins 1996; 24 (4): 485494

267. Li L, Darden T, Hiskey R, Pedersen LG. Computational studies of human prothrombin fragment 1, the Gla domain of factor IX and several biological interesting mutants. Haemostasis 1996; 26 (1): 54-59

Поступила в редакцию 03.08.2009 г.

Принята в печать 02.03.2010 г.