Изучение плазмидного профиля бифидобактерий Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Б.А. Кунгурцева, Ю.П. Джиоев, С.М. Попкова

изучение плазмидного профиля бифидобактерий

ГУ НЦ медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН (Иркутск)

Одной из актуальных проблем современности является рост числа и интенсивности влияния на организм человека глобальных и локальных воздействий, приводящих к перенапряжению и истощению компенсаторных резервов физиологических систем человека. Научные данные указывают, что одной из реакций организма на любой стресс является бактериемия, основным источником которой выступает кишечник. В результате различных неблагоприятных воздействий и патологических состояний могут происходить качественные и количественные изменения в составе нормальной микрофлоры кишечника (Хавкин А.И., 2007). Ведущая роль в нормализации микробиоценоза кишечника принадлежит доминанте кишечного биоценоза — бифидобактериям, дефицит которых является одним из основных патогенетических факторов длительных кишечных дисфункций у детей и взрослых (Куваева И.Б., 1976). Бифидобактерии составляют существенную часть облигатной микрофлоры кишечника здорового человека. В норме количество бифидобактерий у детей — 109 КОЕ/г, а у взрослых — 1010 КОЕ/г испражнений (Постникова Е.А., 2004). За счет продуцируемых при сбраживании углеводов, молочной и уксусной кислот, вырабатываемых бактериоциноподобных белковых субстанций, способности конкурировать с другими микроорганизмами за питательные субстраты и сайты прикрепления на кишечном эпителии, бифидобактерии обладают высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, препятствуют их проникновению в верхние отделы желудочно-кишечного тракта, а также запрещают их транслокацию из просвета кишечника во внутренние органы.

Имеются сведения о том, что бифидобактерии являются «поставщиком» ряда незаменимых аминокислот (Куваева И.Б., 1976), установлена их антиканцерогенная активность в кишечнике, печени и молочных железах, антимутагенная активность (Reddi B.S., 1993), способность снижать уровень холестерина в крови (Амерханова А.М., 2006). С тех пор, как было установлено, что бифидобактерии способны проявлять пробиотические свойства и благотворно влиять на здоровье человека, возник значительный прогресс в прикладной генетике бифидобактерий. Однако для получения бифидобактерий с заданными уникальными свойствами, необходим поиск и изучение автономно действующих генетических элементов, а именно, плазмидных ДНК. Плазмиды — это внехромосомные генетические детерминанты, способные существовать либо в автономном, либо в интегрированном состоянии. Одно из интересных свойств плазмид - их способность к переходу от одних бактериальных клеток к другим (их называют конъюгативными или трансмиссивными). Т.о., плазмиды могут передавать клеткам-реципиентам не только собственно плазмидный мактериал, но и хромосомный, благодаря чему стал возможен геноанализ бактерий. Так, плазмида F, открытая первой, детерминирует только одно свойство бактерий — действует в качестве генетического донора; R — плазмида, открытая позже, несет гены, которые контролирует лекарственную резистентность к ряду лекарственных препаратов. Различают плазмиды, содержащие гены устойчивости к антибиотикам; плазмиды, контролирующие факторы патогенности бактерий, а также обладающие способностью к синтезу отдельных биологически активных веществ или к дезинтеграции таких химических соединений, как салициловая кислота, нафталин, камфора, бензол и другие. Есть плазмиды вирулентности, которые могут кодировать экзотоксины, адгезины, или факторы инвазии. В то же время есть плазмиды, названные криптическими, фенотипически не проявляющиеся у бактерий.

По химической природе плазмиды могут быть в нескольких структурных формах: линейные, открытые и закрытые, с размером молекулы ДНК длиной от 2 до 600 тпн.

Плазмиды были описаны у 8-и различных видов бактерий рода Bifidobacterium, изолированных от медоносных пчел, различных видов животных и человека (Sqorbati B. et al., 1982). Эти виды бифидобактерий относительно часто несут разнообразные плазмидные ДНК, размер которых от 1,25 до 9,5 kb. Большинство из обнаруженных плазмид являются криптическими. Полная нуклеотидная последовательность была определена для 14-ти плазмид, выделеных из B. longum, B. asteroids, B. breve, B. catenulatum (Rossi M. et al., 1996). Анализ их нуклеотидной последовательности показал, что они несут от 2 до 10 открытых рамок считывания. Вероятно, именно эти гены детерминируют ряд свойств, являющихся полезными для бактерийных клеток, определяют широкое распространение несущих их плазмид. Большая часть охарактеризованных плазмид бифидобактерий предположительно реплицируется по механизму «катящегося кольца» (Gibbs M.J. et al., 2006).

Цель исследования: изучить плазмидный профиль бифидобактерий, выделенных из кишечного биоценоза лиц, проживающих в Иркутской области; определить тропность плазмид к отдельным видам бифидобактерий.

методы и объекты исследования

Бифидобактерии выделялись из копрологических проб детей и взрослых (матерей) при обследовании на кишечный дисбактериоз. Для выделения ДНК бактерий использовалась 2 — 3-х суточная биомасса

культуры бифидобактерий, выращенных на тиогликолевой среде. Исследовано всего 40 образцов культур, выделенных от детей г. Иркутска и семейных пар «мать — дитя» г. Ангарска. Эти города Иркутской области относятся к экологически неблагополучным территориям с высокой степенью техногенного загрязнения (Гос. доклад, 1998 — 2000).

В основу определения геновида бифидобактерий был положен метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с набором синтетических олигонуклеотидных зондов, специфически комлемен-тарных видам B. longum, B. adolescentis, B. bifidum и B. catenulatum. Выделение плазмидной ДНК из микробиоты, лактобацилл и бифидобактерий осуществляли по Кайзеру (Kiser T., 1984) с некоторыми модификациями, что позволяло нам получать плазмидную ДНК большей массы в образцах и наиболее очищенную от белков. Для определения плазмид с учетом их размера и количества в выборках из обоих городов использовали электрофорез в 0,7 % агарозном геле.

В гибридизационной картине с ДНК мы получили все 4 вида бифидобактерий, но с различной степенью представительства. В общей выборке доминирующим видом оказался B. longum, другие виды бифидобактерий представлены у жителей изучаемых городов следующим образом: в Ангарске вторым по частоте встречаемости видом был B. bifidum, а в Иркутске — B. catenulatum. Минорным видом для Иркутска стал B. bifidum, а для Ангарска — B. adolescentis (Ракова Е.Б. и др., 2007).

Электрофореграмма плазмидных профилей свидетельствовала о присутствии в обеих выборках населения плазмид одного размера (около 20 тысяч пар нуклеотидов). Плазмида выявлялась только у B. longum, который был доминирующим видом. В ангарской выборке данная плазмида выявлялась почти в два раза чаще, чем в иркутской. В выборке из г. Ангарска практически в равной степени эта плазмида представлена в группах как взрослых, так и детей.

Таким образом, установлено следующее.

1. Существует особенность видового состава и разная степень представительства 4-х видов бифидобактерий в Иркутске и Ангарске.

2. Плазмидный профиль бифидобактерий представлен наличием плазмиды одной формы и одного размера (около 20 т.п.н.), которая имеет разную частоту выявления в выборках из разных городов Иркутской области.

3. Изученная плазмида выделялась только от B. longum, являющимся доминирующим видом в обеих выборках.

В.Г. Ливенцева, И.А. Кайгородова

байкальский букет видов: экология и молекулярная филогения

Лимнологический институт СО РАН (Иркутск)

Последнее десятилетие широкое распространение получили методы молекулярной систематики, зачастую являющиеся единственно возможным способом, позволяющим разобраться в родственных связях таксонов и дать объективную оценку видового разнообразия в экологических исследованиях. В этом смысле интересными объектами являются «букеты видов», представляющие собой монофиле-тические группы близкородственных видов, дивергировавших в рамках одной замкнутой экосистемы. В Байкале обнаружены два букета видов олигохет (Kaygorodova et al., 2007). Байкальский букет видов рода Pseudorhynchelmis (8 видов) подробно изучен в предыдущих исследованиях (Ливенцева и др., 2003; Кайгородова и др., 2007). В данной работе мы представляем результаты исследования представителей богатого букета видов Lamprodrilus (20 видов), населяющих ограниченное экологическое пространство — пролив Ольхонские ворота.

методы исследования

Молекулярный анализ. Препараты тотальной ДНК отдельных особей получены по методу Дойла-Диксона. Фрагмент гена mtCOI длиной 710 п.н. амплифицирован с использованием олигонуклеотидных праймеров, универсальных для большинства беспозвоночных. Расшифровка первичной структуры ДНК проведена с помощью реакции секвенирования двухцепочечных продуктов амплификации.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проведен с использованием программ SplitsTree v.4 (Huson & Bryant, 2006) и Phyml v.2.4.4 (Guindon & Gascuel, 2003).

результаты

Анализ собранного на Байкале биологического материала выявил неравномерность распределения видов по озеру. Как оказалось, на Байкале имеются места с поразительно богатым видовым составом. Одно из таких мест — Ольхонские ворота, где обнаружено 26 видов олигохет (рис. 1).