CC BY
30
УДК 636.087.61
Ю.П. Джиоев С.М. Попкова У.М. Немченко Е.Б. Ракова Н.М. Шабанова
Е.Н. Иванова ‘, Г.В. Юринова 2
геновидовая структура популяций бифидобактерий, выделенных из кишЕчного биотопа жителей промышленных городов иркутской области
1 Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр проблем здоровья семьи
репродукции человека Сибирского отделения РАМН (Иркутск) 2 Иркутский государственный университет (Иркутск)
Представлены результаты геновидового типирования бифидобактерий в кишечном биотопе жителей г. Иркутск и. Ангарск с использованием, метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Видовое типирование проводилось по четырем, видам, бифидобактерий. Сравнительный анализ видовых сочетаний и. степени доминирования отдельных видов в исследуемых выборках показал различную вариативность ассоциаций исследуемых видов бифидобактерий и. превалирование B. longum.
Ключевые слова: бифидобактерии, ассоциация видов, полимеразная цепная реакция, кишечный микробиоценоз
GENETICSPECIES STRUCTURE OF BIFIDOBACTERIUM POPULATIONS ISOLATED FROM INTESTINAL BIOTOPES RESIDENTS OF INDUSTRIAL SITES OF IRKUTSK REGION
Yu.P. Dzhioev S.M. Popkova U.M. Nemchenko E.B. Rakova N.M. Shabanova
E.I. Ivanova ‘, G.V. Yurinova 2
1 Scientific Center of Family Health Problems and Human Reproduction SB RAMS, Irkutsk
2 Irkutsk State University, Irkutsk
Results of genetic typing of bifidobacteria in intestinal biotope of Irkutsk and Angarsk citizens with use of polymerase chain reaction (PCR) are presented, in the article. Species typing was performed on four species of bifidobacteria. Comparative analysis of species combinations and degrees of dominance of individual species in studied, samples showed, different variation of association study of bifidobacteria and. prevalence of B. longum.. Key words: bifidobacteria, species association, polymerase chain reaction, intestinal microbiocenose
ВВЕДЕНИЕ
Микроорганизмы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) выполняют важнейшую работу в организме человека и животных, обеспечивая процессы переваривания и всасывания, трофику кишечника, антиинфекционную защиту, синтез витаминов и т.д. Наиболее хорошо изученными из них являются микроорганизмы рода Bifidobacterium — грамположительные, анаэробные, неспорообразующие бактерии. Нарушения видового и количественного баланса бифидобактерий в ЖКТ приводят к дисбиотическим состояниям, которые при отсутствии лечения и коррекции могут стать источником и причиной заболеваний инфекционной и неинфекционной природы [8, 9]. В связи с этим важной представляется проблема изучения особенностей видовой архитектоники бифидобактерий в ЖКТ человека в норме и при дисбиозах [3, 10]. Для всестороннего анализа и видового типирования бактерий кишечной биоты существует ряд методов, с помощью которых можно в комплексе охарактеризовать все основные свойства бактерий. Однако многие из классических микробиологических методов крайне затратны [14]. В настоящее время наибольшей популярностью пользуется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который стал стандартизированным и в медицинской диагностике [4, 6, 10, 14, 17]. Молекулярно-генетические технологии (молекулярная гибридизация,
биочипы, ПЦР, секвенирование — расшифровка генетических последовательностей) являются высоко специфичными и чувствительными для диагностики возбудителей практически любой инфекции или объекта биологической природы [1,
5, 11- 14, 16, 17, 18].
Исходя из этого, основная цель работы — с помощью видового генотипирования изучить структуру и сочетаемость видов бифидобактерий в кишечном биоценозе у детей и взрослых лиц, проживающих в двух промышленных городах Иркутской области.
материалы и методы исследования
Суммарную ДНК выделяли из копрологи-ческих проб лиц, проживающих в г. Иркутск (9 проб) и Ангарск (12) и проходивших обследование на дисбиоз в Иркутском центре диагностики и профилактики дисбактериозов НЦ ПЗСРЧ СО РАМН [2]. Культуральная биомасса бифидобактерий была выращена на стандартной тиоглико-левой среде согласно Е.Б. Раковой [2]. В выборке представлены образцы от взрослых (мужчины, женщины) и детей. Материал собран в течение 2009 — 2010 гг.
На этапе подготовки образцов для выделения бактериальной ДНК, согласно лабораторному протоколу, была модифицирована методика подготовки и хранения образцов бифидобактерий, ко-
торая включала в себя: осаждение бактериальной биомассы из культуральной среды путем центрифугирования (13000 об./мин, 3 мин), последующее суспендирование осадка клеток бифидобактерий в буфере Трис-ЭДТА (ТЭ), Рн = 7,4 и хранение при —20 °С. В таких условиях бактериальная ДНК сохраняла свои качества в течение года и более. Молекулярно-генетический анализ проводили методом ПЦР с использованием видоспецифичных праймеров на основе гена 16S рРНК, отобранных согласно литературным источникам [12, 18]. В таблице 1 приведены структуры используемых праймеров и размеры фрагментов ДНК видов бифидобактерий.
Суммарную бактериальную ДНК выделяли с использованием комплекта реагентов «РИБО-преп» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). ПЦР-амплификацию проводили с помощью коммерческого набора AmpliSens-200-1 (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Для одновременного проведения ПЦР амплификации с наборами праймеров к 4 видам бифидобактерий температурные условия отжига праймеров были оптимизированы по одному стандартному режиму амплификации. ПЦР амплификацию проводили по схеме: первичная денатурация ДНК при 95 °С в течение 3 мин, далее 30 циклов амплификации при 94 °С в течение 30 сек, при 56 °С — 30 сек, при 72 °С — 2 мин, а после окончания циклов — при 72 °С в течение 7 мин. Электрофорез ПЦР фрагментов ДНК бифидобактерий проводили с использованием 1% агарозного геля в трис-ацетатном буфере. Положительным контролем для типирования трех видов бифидобактерий (B. bifidum, B. longum, В. infantum) служил стандартный маркер длин
фрагментов ДНК (ZipRuler Express DNA Ladder Set, длина фрагментов от 200 до 20000 н.о.; Fermentas, Литва), а для идентификации вида B. catenulatum использовали маркер O'RangeRuler 100 bp DNA Ladder от 100 до 1500 н.о. (Fermentas, Литва), размерность фрагментов которого начинается с 100, 200, 300, 400, 500 нуклеотидных оснований (рис. 1). Отрицательным контролем служила проба, в реакционной смеси которой отсутствовала искомая ДНК бифидобактерий.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты эксперимента, полученные с помощью ПЦР-типирования и визуализированные электрофорезом в агарозном геле, представлены на рисунке 1.
Как видим, используемые видоспецифичные праймеры четко дифференцируют по размерным характеристикам фрагментов амплифицируемых ДНК виды бифидобактерий в соответствии с протоколами работ авторов, разработавших их структурные конструкции [12, 18].
Результаты геновидового типирования бифидобактерий свидетельствуют о том, что в обеих выборках определялись все 4 исследуемых вида бифидобактерий в разных ассоциативных вариантах (табл. 2).
Рейтинговая позиция идентифицируемых видов бифидобактерий в общей выборке образцов из двух городов свидетельствовала о превалировании B. longum, а B. catenulatum и B. bifidum определялись как субдоминантные виды (рис. 2). Наименее выраженным определялся вид B. infantum, что, скорее всего, является отражением его адаптивных особенностей, которые, возможно, выражаются в его слабой способности конкурировать с доминирующими видами.
Таблица 1
Структура и видовое соответствие олигонуклеотидных праймеров, используемых в работах [12, 18]
№ Наименование праймеров Последовательности праймеров Ген ПЦР фрагменты (но) Виды бифидобактерий, к которым специфичны праймеры
1 BiLON-F BiLON-R 5-TTC CAG TTG ATC GCA TGG TC-3 5-GGG AAG CCG TAT CTC TAC GA-3 16S рРНК 831 B. longum
2 BiBIF-F BiBIF-R 5-CCA CAT GAT CGC ATG TGA TTG-3 5-CCG AAG GCT TGCT CCC AAA-3 16S рРНК 278 B. bifidum
3 BiINF-F BiINF-R 5-TTC CAG TTG ATC GCA TGG TC-3 5-GGA AAC CCC ATC TCT GGG AT-3 16S рРНК 828 В. infantum
4 BiCATg-F BiCATg-R 5-CGG ATG CTC CGA CTC CT-3 5-CGA AGG CTT GCT CCC GAT-3 16S рРНК 285 B. catenulatum
20000
7000
4000
>w 2500
1500
11 rr 1000
. r 700
400 200
500 Н.О. 300 Н.О.
б
д
Рис. 1. Электрофореграммы сравнительной интерпретации размерностей ДНК-фрагментов видов бифидобактерий со специфическими праймерами, полученными в результате ПЦР-амплификации. Виды исследуемых бифидобактерий: а - B. Bifidum; б - B. Longum; в - B. infantum; г - размерность маркера молекулярной массы; д - B. catenulatum и размерность его ДНК-фрагментов.
а
в
г
Таблица 2
Результаты видовой идентификации бифидобактерий
Город № Номер образца Пол Возраст, год, мес. B. bifidum B. catenulatum B. longum B. infantum
Ангарск 1 14 Ж 29 + - + -
2 17 Ж 7 + + + -
3 18 Ж 23 - - + -
4 20 Ж 31 + + + -
5 21 Ж 0,8 м - - - +
6 22 Ж 35 - + - -
7 23 М 32 + + + -
8 24 Ж 32 - + + -
9 25 М 1 г. 8 м + - - -
10 26 Ж 26 - - + -
11 27 М 1 г. 6 м. - + + -
Иркутск 1 894 М 5 л - - + -
2 815 Ж 5 л - - + -
3 827 Ж 6 л - - + -
4 891 М 6 л - + + -
5 894 М 5 л - + + +
6 892 Ж 5 л - + + -
7 807 М 5 л - - + -
8 831 Ж 4 г - - + -
9 875 Ж 6 л + + + -
60,00
50,00
40.00
30.00
20,00
10,00
0,00
B. longum B. catenulatum B. bifidum B. infanrum
Рис. 2. Общая структура степени выявляемое™ видов бифидобактерий (%) в суммарной выборке образцов от жителей г. Иркутск и Ангарск.
По отдельным городам рейтиноговые позиции бифидобактерий, хотя и повторяли предыдущую картину, но по соотношению видов несколько различались (рис. 3).
Так, в иркутской выборке, по сравнению с ангарской, доминировал B. longum (60 % и 40 % соответственно). Вид B. catenulatum незначительно превалировал в Ангарске (30 % против 27 %), а B. Bifidum более чем в 3 раза чаще определялся в Ангарске. По виду B. infantum отмечено его незначительное превалирование в Иркутске (8 % против 5 %).
Рис. 3. Степень распространенности (%) видов бифидобактерий в выборках из Иркутска и Ангарска.
Видовые ассоциации из ангарской выборки культур бифидобактерий характеризовались тремя вариантами сочетаний: 1) B. bifidum + B. catenulatum + B. longum (3 образца); 2) B. Bifidum + B. longum (1 образец); 3) B. longum + B. catenulatum (2 образца). В пяти образцах выявлено только по 1 виду бифидобактерий из определяемых четырех. В пробах, где отсутствовал доминирующий B. longum, регистрировался только один вид из остальных определяемых трех. Ценотипическая структура кишечного микробиоценоза (рис. 4.) представлена также тремя возможными количественными вариантами видовых ассоциаций бифидобактерий. Сочетаемость трех
и двух видов в одном образце определялась фактически одинаково — в 27 % случаев, а количество образцов с одним видом бифидобактерий достигало 45 %, причем образцы с одним видом превалировали в Иркутске, а с двумя — тремя видами — в Ангарске.
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20 0,10 0,00
Рис. 4. Частота выявлений (%) разных вариантов количественных ассоциаций видов бифидобактерий в выборках из Иркутска и Ангарска.
В выборке культур из Иркутска доминирующим видом определялся B. longum, который присутствовал в каждой исследуемой пробе (рис. 3), а субдоминантным — B. catenulatum. Ассоциации видов бифидобактерий были представлены также тремя вариантами: 1) B. Catenulatu + B. longum (2 образца); 2) B. catenulatum + B. longum + B. infantum (1 образец); 3) B. bifidum + B. Catenulatum + B. longum (1 образец). В 5 образцах было выявлено только по 1 виду (B. longum) из четырех определяемых. Ценотипическая структура микробиоценоза (рис. 4) представлена также тремя возможными вариантами количественного видового состава бифидобактерий, как и в г. Ангарске, но состав сочетаний отличался. В ангарской выборке не зарегистрирована ассоциация из 3 видов (B. catenulatum + B. longum + B. infantum), а в г. Иркутске — сочетание 2 видов: B. bifidum + B. longum. Встречаемость ассоциаций как с 3, так и с 2 видами в одном образце составила 21 %, а наличие одного вида в пробе — 55 % (рис. 4).
В иркутской выборке так же, как и в ангарской, отмечено явное доминирование одного вида — B. longum, но, в отличие от Ангарска, в Иркутске присутствие B. longum отмечалось в каждом образце. При этом превалирование B. longum над B. catenulatum в иркутской выборке значительно превосходило таковое в ангарской (рис. 3). Следует отметить, что в ангарской выборке виды B. longum, B. catenulatum и
B. bifidum распространены по убывающей более равномерно по сравнению с иркутской, где отмечается «дефицит» B. bifidum (1 случай из всей выборки).
Полученные данные по видовой структуре и сочетаемости видов бифидобактерий согласуются с результатами более ранних исследований, полученных методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с набором олигонуклеотидных зондов, специфичных к тем же видам бифидобактерий, которые исследуются в данной работе [5, 6, 7].
□ Ангарск
□ Иркутск
1 вид 2 вида 3 вида
Таким образом, несмотря на малочисленность исследуемых выборок образцов ДНК, выделенных из копрологических проб жителей двух промышленных городов (Иркутск и Ангарск), с одной стороны прослеживается однонаправленная тенденция доминирования одного и того же вида в обеих выборках, с другой — отмечается достаточная вариабельность ассоциаций бифидобактерий (4 варианта видовых ассоциаций). Последнее обстоятельство, скорее всего, свидетельствует об определенной неустойчивости видовых ассоциаций вследствие возможного межвидового антагонизма. С другой стороны, выявленное разнообразие ассоциаций видов бифидобактерий может быть следствием экологических условий среды обитания. Возможна другая версия трактовки представленного ассоциативного разнообразия, основанная на применении понятия «вариативности ассоциаций видов». Под этим термином подразумеваем степень возможных вариантов сочетания видов, основанного на комплементарности (сродстве) видов в микробиоценозе определенного биотопа. Выявленные варианты ассоциаций видов бифидобактерий как в количественном, так и в качественном сочетании, отражают степень вариативности при данном наборе исследуемых видов. Такая структурная архитектоника видовых ассоциаций, сформировавшаяся в рамках либо нормы вариативности (ассоциации 2 и более видов), либо вне нормы вариативности видовых сочетаний в определенном микробиоценозе является отражением экологической среды и/или возможных патологических состояний организма.
Дальнейшие более масштабные исследования могут изменить картину ассоциативных взаимоотношений между родственными видами бифидобактерий, но общая тенденция как ассоциативного видового разнообразия, так и ценотипической структуры видовых сочетаний, возможно, будет подтверждаться. Полученные результаты могут стать предпосылкой формирования персонифицированного подхода при коррекции и лечении многих патологий, являющихся следствием развития дисбиотических процессов в организме человека.
выводы
1. В. longum определен как доминирующий вид бифидобактерий в выборке копрологических проб, полученных от жителей двух промышленных городов Иркутской области.
2. В исследуемой выборке выявлено 4 варианта видовых ассоциаций бифидобактерий, сформировавшихся на основе сочетаний 4 определяемых видов бифидобактерий.
3. Установлены варианты количественной видовой структуры микробиоценоза кишечного биотопа: с одним, с двумя и тремя определяемыми видами бифидобактерий.
4. Предпочтительная ассоциативность изученных видов бифидобактерий с В. longum свидетельствует как о толерантности макроорганизма к данному виду, так и о взаимной межвидовой толерантности.
5. Сделано предположение о том, что превалирование 1—2 видовых сочетаний бифидобактерий в микробиоценозах лиц с дисбиотическими отклонениями может свидетельствовать о неустойчивости микроэкологического баланса данного биоценоза.
6. Выявленные варианты ассоциации видов бифидобактерий отражают структурную архитектонику ассоциаций видов как в пределах нормы вариативности (наличие 2 и более сочетаний видов), так и вне нормы вариативности (наличие в выборке людей с одним видом бифидобактерий), что, вероятнее всего, является следствием влияния экологической среды обитания человека и/или его патофизиологического сотояния.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бондаренко В.М. Молекулярно-генетические и молекулярно-биологические исследования представителей родов Bifidobacterium и Lactobacillus // Вестн. РАМН. - 2006. - № 1. - C. 21-27.
2. Видовая архитектоника и плазмидный профиль бифидобактерий кишечной микробиоты у населения Иркутской области / Е.Б. Ракова, С.М. Попкова, Ю.П. Джиоев [и др.] // Вестн. Рос. воен.-мед. акад. - 2008. - № 2. - Ч. II. - С. 660-661.
3. Методические рекомендации по микробиологической диагностике дисбактериоз кишечника в лечебно-диагностических учреждениях армии и флота. - СПб.: СПНИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, 1999. - 36 с.
4. Новик Г.И., Астапович Н.И., Самарцев А.А. Исследование биохимических особенностей бифидобактерий на поздних стадиях развития популяций // Микробиология, 2001. - Т. 70, № 4. - С. 495-502.
5. Особенности микроэкологических цено-типов у детей, проживающих в условиях техногенного прессинга / Е.Б. Ракова, С.М. Попкова, У.М. Немченко [и др.] // Гигиена и санитария. -2011. - № 4. - С. 22-26.
6. ПЦР в реальном времени. - 2007. - Режим доступа: http://www.ld.ru/catalog/rts/pcr/realtime-pcr.html.
7. Ракова Е.Б. Современная структура кишечного микробиоценоза у детского населения Иркутской области: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - 2010. - 22 с.
8. Семинский И.Ж. Молекулярные основы, принципы, алгоритм и возможности ПЦР - диа-
гностики // Методическое пособие. — Иркутск, 1999. - 54 с.
9. Сидоренко А.В. Использование методов ге-носистематики в классификации и идентификации бактерий рода Bifidobacterium // Микробиология. - 2008. - Т. 77, № 3. - С. 293-302.
10. Хавкин А.И. Эволюция представлений о роли кишечной микрофлоры. - 2005. - Режим доступа: http://www.disbak.ru.
11. Шульпекова Ю.О. О роли бифидобактерий. -2003. - Режим доступа: http://www.kcn.ru/tat_ru/tet.
12. Arunachalam K.D. Role of bifidobacteria in nutrition, medicine and technology // Nutrit. Res. -1999. - Vol. 19, N 10. - P. 1559-1597.
13. Characterization of the genus Bifidobacterium by automated ribotyping 16S rRNA gene sequences /
S. Sakata, C.S. Ryu, M. Kitahara [et al.] // Microbiol. Immunol. - 2006. - Vol. 50. - P. 1-10.
14. Daniel O'Sullivan J. Methods for analysis of the Intestinal microflora // Curr. Issues Intest. Microbiol. - 2000. - № 1. - Р. 39-50.
15. Identification and quantification of Bifidobacterium species isolated from food with genus-specific 16S rRNA-targeted probes by colony hybridization and PCR / P. Kaufmann, A. Pfefferkorn, A. Teuber [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - Vol. 63. -P. 1268-1273.
16. Matsuki Т., Watanabe K., Tanaka R. Genusand species-specific PCR primers for the detection and identification of bifidobacteria // Curr. Issues Intest. Microbiol. - 2003. - Vol. 4. - P. 61-69.
17. Molecular approaches for identification and characterization of lactic acid bacteria / D. Mohania, R. Nagpal, M. Kumar [et al.] // J. Dig. Dis. - 2008. -Vol. 9, N 4. - P. 190-198.
18. New real-time quantitative PCR procedure for quantification of bifidobacteria in human fecal samples / M. Gueimonde, S. Tolkko, T. Korpima [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. -Vol. 70, N 7. - P. 4165-4169.
19. Species-specific identification of commercial probiotic strains / P.S.M. Yeung, M.E. Sanders,
C.L. Kitts [et al.] // J. Dairy Sci. - 2002. - Vol. 85. -P. 1039-1051.
20. Ventura M., Meylan V., Zink R. Identification and traicing of Bifidobacterium srecies by use of enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - P. 4296-4301.
Сведения об авторах
Джиоев Юрий Павлович - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и генетической диагностики Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН Попкова Софья Марковна - доктор биологических наук, заведующий лабораторией микроэкологии Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН
Немченко Ульяна Михайловна - младший научный сотрудник лаборатории микроэкологии Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН
Ракова Елена Борисовна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории микроэкологии Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека Со РАМН
Шабанова Наталья Михайловна - младший научный сотрудник лаборатории микроэкологии Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН
Иванова Елена Ивановна - младший научный сотрудник лаборатории микроэкологии Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН
Юринова Галина Валерьевна - кандидат биологических наук, доцент кафедры физико-химической биологии Иркутского государственного университета
