CC BY
47
Молекулярно-генетические методы в мониторинге микробных сообществ кишечника
Костюк С.А.
Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск
Kostiuk S.A.
Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk
Molecular genetic methods in monitoring of intestinal microbial communities
Резюме. Изучены особенности видового состава бифидобактерий в зависимости от возраста, вида вскармливания, характера питания, сезона года. Чистые культуры штаммов бифидобактерий были выделены из фекалий детей и взрослых и идентифицированы до вида методами полимеразной цепной реакции и секвенирования. Было показано, что у детей старше 4 лет, подростков и взрослых доминирующими видами бифидобактерий являются B. longum и B. adolescentis. Только у детей младше 4 лет выявлены штаммы видов B. infantis, B. angulatum, B. dentum. B. bifidum встречались у людей всех возрастных групп, но с наибольшей частотой у грудных детей (65,4%). Видовой состав бифидобактерий был более разнообразным у детей, находящихся на грудном вскармливании, взрослых вегетарианцев, в зимний период. Участие материнских штаммов бифидобактерий в ранней колонизации кишечника детей было подтверждено обнаружением генетически идентичных штаммов бифидобактерий у матерей и их детей методом амплификации консервативных повторяющихся последовательностей (REP-ПЦР). Ключевые слова: бифидобактерии, видовое, субвидовое генотипирование, REP-ПЦр'кишечная микрофлора матери, возраст, питание, время года.
Медицинские новости. — 2017. — №1. — С. 62—65. Summary. The particularities of the species composition of bifidobacteria, depending on age, type of feeding, food preferences, season, have been investigated. Bifidobacterium strains were isolated from the feces of children and adults, and identified to the species level by PCR and sequencing. It has been shown that B.longum and B.adolescentis are the dominant species of bifidobacteria in children older than 4 years, teens and adults. B.infantis, B.angulatum, B.dentum are identified only in children under 4 years. B.bifidum has been found in all age groups, but with the greatest frequency in infants (65.4%). The species composition of bifidobacteria has been more diverse in children who are breastfed, in adult vegetarians, in the winter. The early colonization of the intestine of children by mother strains of bifidobacteria has been confirmed by the detection of genetically identical strains of bifidobacteria in mothers and their children by repetitive element palindromic PCR (REP-PCR).
Keywords: bifidobacteria, species, strain genotyping, REP-PCR, mother's intestinal microflora, age, food, season. Meditsinskie novosti. - 2017. - N1. - P. 62-65.
Важное значение симбионтной микрофлоры для организма человека к настоящему времени является общепризнанным и базируется на результатах исследований с использованием живых моделей, диагностики на молекулярно-генетическом уровне [18, 22].
Все сообщающиеся с внешней средой полости тела человека, а также кожные покровы густо заселены микроорганизмами, общее число клеток которых находится на уровне 1014—1016, что значительно (в пределах двух порядков) превосходит число человеческих соматических клеток, а совокупный микробный геном намного превышает геном человека [15, 24].
Симбиотическая микрофлора составляет основу микроэкологии человека. Наиболее представительным как в количественном отношении, так и по видовому составу является микробное население пищеварительного тракта. Его распределение по отделам пищеварительного тракта имеет существенные различия, что соответствует анатомическим и химико-физиологическим особенностям биотопа, и вместе с тем, определяется биологией
микроорганизмов, обитающей в каждой конкретной экологической зоне. В норме в различных отделах пищеварительного тракта микробы симбионтной микрофлоры формируют специфический биоценоз, позволяющий поддерживать условия, наиболее благоприятные для осуществления функций пищеварительной системы. Поверхность слизистых оболочек является местом наиболее тесного взаимодействия организма хозяина с колонизирующими его микроорганизмами, причем слизистая оболочка кишечника представляет собой наиболее значительную область такого контакта [15, 24].
Ведущая роль в нормализации микробиоценоза кишечника и поддержании гомеостаза человеческого организма принадлежит бифидобактериям, которые оказывают разностороннее положительное влияние на физиологические функции организма человека. Создавая в кишечнике кислую среду за счет продуцирования уксусной и молочной кислот (в соотношении 3:2), а также в небольших количествах муравьиной и янтарной, они препятствуют развитию патогенной и гнилостной микрофлоры
путем антагонистической активности. Кроме того, в процессе жизнедеятельности бактерии рода Bifidobacterium образуются антибиотикоподобные вещества, которые подавляют рост патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, клостридий, стафилококков. Благодаря действию летучих жирных кислот бифи-добактерии активизируют абсорбцию ионов натрия, калия, хлора, кальция, магния, железа, цинка и витамина D, регулируют содержание бикарбоната натрия и уровень рН, поддерживая тем самым водный, электролитный и кислотно-щелочной балансы макроорганизма. Известно участие этих микроорганизмов в синтезе аминокислот, белков, пантотеновой кислоты, витаминов К и группы В. Бактерии рода Bifidobacterium нормализуют перистальтику кишечника, предотвращают метеоризм, участвуют в утилизации пищевых субстратов, стимулируют пристеночное пищеварение. Тесная взаимосвязь со слизистой оболочкой кишечника определяет участие бифидобактерий в формировании колонизационной резистентности [3, 11, 17].
Иммуномодулирующая активность бактерий рода Bifidobacterium проявляется в регуляции различных сторон гуморального и клеточного иммунитета - активации выработки IgA и торможении деградации секреторного IgA в кишечнике, стимуляции фагоцитоза, интерферонообразования и продукции интерлейкинов, усилении пролиферации клеток селезенки под влиянием липополисахаридов [9].
Формирование нормальной микрофлоры кишечника человека начинается еще на самых ранних этапах жизни. Считается, что первичным источником бактерий, колонизирующих пищеварительный тракт ребенка, являются родовые пути матери, во время прохождения которых новорожденный заглатывает их содержимое вместе с бактериями вагинальной микрофлоры [19].
После рождения колонизация кишечника ребенка продолжается не только штаммами бактерий, поступающих от матери, но и микроорганизмами от других источников, находящихся во внешней среде. Однако указанные предположения, касающиеся участия материнских штаммов бактерий в первичной колонизации гастроинтестинального тракта ребенка, до последнего времени остаются недостаточно подтвержденными научными данными [19]. Это в свою очередь связано с малой информативностью используемых для решения данной задачи микробиологических методов, которые основаны прежде всего на изучении морфологических, физиолого-биохимических и культураль-ных свойствах бактериальных штаммов, изолируемых из материнских и детских источников [11].
Активное внедрение молекулярно-генетических технологий в практику микробиологических исследований способствует получению новой информации о составе и свойствах интестинальной микрофлоры у людей разного возраста [2, 20].
В последние годы был разработан целый арсенал методов с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющих быстро и достоверно определить видовую принадлежность выделяемых микроорганизмов [7, 8, 21].
Цель исследования - провести молекулярный мониторинг микрофлоры кишечника и установить особенности видового состава бактерий рода Bifidobacterium в зависимости от возраста детей, вида вскармливания, характера питания, сезона года.
Материалы и методы
Объектом исследования были клинически здоровые 100 детей и 40 взрослых, в том числе 26 пар мать-ребенок. Обследованные дети были разделены по критическим периодам развития [12] на четыре возрастные группы: 1-я - 26 детей от 0 до 6 месяцев; 2-я - 25 детей от 1 года до 3 лет; 3-я - 26 детей от 4 до 6 лет, 4-я группа - 23 подростка от 12 до 15 лет. Материалом для исследования служили фекалии. Выделение бифидобактерий проводили на питательной среде для бифидобактерий (среде Блаурокка). Все последующие манипуляции осуществлялись с чистыми культурами бифидобак-терий. Идентификацию бифидобактерий проводили с использованием ПЦР с видоспецифичными бифидобактери-альными праймерами. (Bifidobacterium longum, B. bifidum, B. infantis, B. ado-lescentis, B. catenulatum, B. angulatum и B. dentum). Поскольку межвидовой уровень сходства бифидобактерий по гену 16S рРНК варьирует в пределах 93-99% и многие виды бифидобактерий филогенетически близки между собой, то не идентифицированные методом ПЦР штаммы определяли путем секве-нирования фрагмента гена 16S рРНК [25]. С использованием метода амплификации консервативных повторяющихся последовательностей (REP-ПЦР) был проведен сравнительный анализ штаммов бифидобактерий в 26 парах мать-ребенок для установления их генетической идентичности, исследовано субвидовое штаммовое разнообразие кишечных бифидобактерий у детей раннего возраста и получены данные о транслокации материнских штаммов от матери к ребенку.
Результаты и обсуждение
Видовая идентификация штаммов. Результаты исследования видового состава
кишечной бифидофлоры у здоровых детей различных возрастных групп и взрослых представлены в таблице.
В толстой кишке у детей раннего возраста бифидобактерии являются основной группой и составляют до 95% от общей популяции микроорганизмов. Установлено, что видовой состав бифидофлоры человека неодинаков и претерпевает изменения в зависимости от возраста, характера питания и ряда других физиологических факторов [3, 10].
У детей старше 4 лет и подростков доминирующими видами бифидобактерий являются B. longum и B. adolescentis. Только у детей возраста младше 4 лет были выявлены штаммы видов B. infan-tis, B. angulatum, B. dentum. B. bifidum с высокой частотой встречались у людей всех возрастных групп, но наибольшая частота их встречаемости была у грудных детей (65,4%). Частота встречаемости бифидобактерий вида B. catenulatum имела тенденцию к росту с увеличением возраста у детей до 12-15 лет. У взрослых частота обнаружений B. catenulatum составила 30%. B. dentium с низкой частотой была выявлена только у детей раннего возраста (см. таблицу). Следует отметить, что бифидобактерии в большинстве случаев обнаруживались в виде ассоциаций (94,7%). Известно, что чем более выраженнее разнообразие видов, тем стабильнее микроэкосистема, ее способность к поддержанию гомеостаза и более эффективному противостоянию болезни. Низкое видовое разнообразие связано с нестабильностью в экосистеме и подразумевает большую предрасположенность к изменению состава микробиоты под влиянием внешних воздействий [23].
ЯД Качественный состав бифидобактерий у детей и взрослых
Качественный состав бифидофлоры 0-6 месяцев (n=26) Кол-во/% 1-3 года (n=25) Кол-во/% 4-6 лет (n=26) Кол-во/% 12-15 лет (n=23) Кол-во/% 20-40 лет (n=40) Кол-во/%
B. longum 8/30,8 10/40 26/100 19/82,6 37/92,5
B. breve 4/15,4 4/16 - - 3/7,5
B. bifidum 17/65,4 10/40 11/42,3 12/52,2 20/50
B. infantis 1/3,8 2/8 - - -
B. adolescentis 4/15,4 3/12 18/69,2 17/74 31/77,5
B. catenulatum 4/15,4 10/40 15/57,7 8/34,8 12/30
B. angulatum 3/11,5 - 4/15,4 - -
B. dentum 3/11,5 2/8 - - -
Рисунок
Электрофореграммы продуктов REP-ПЦР геномной ДНК штаммов В. ЫМит, выделенных в паре мать-ребенок
Ml 123 4 567 89 1«
lkb-
<15 kb ' O.Î5kb_
У новорожденных в стерильный до того пищеварительный тракт через ротовую полость поступают микроорганизмы из окружающей среды, в том числе от матери и медицинского персонала. На протяжении первых 1-3 суток микрофлору кишечника новорожденного составляют почти исключительно аэробы, представители анаэробной флоры толстой кишки, в том числе бифидобактерии начинают высеваться на 3-4-е сутки. Такую последовательность заселения кишечника связывают с необходимостью создания аэробами-«предшественниками» экологических условий для функционирования анаэробов путем поглощения кислорода [4, 5].
К 6-8-му дню жизни у здоровых доношенных детей при грудном вскармливании устанавливается преобладание в кишечной микрофлоре облигатно анаэробных бесспоровых палочек - бифидобактерий, на фоне сокращения количества и видового состава аэробов [5].
Скорость становления у новорожденного нормальной микрофлоры (с преобладанием грамположительных анаэробов) во многом определяется тактикой ведения раннего неонатального периода. При раннем прикладывании к груди (в первые часы жизни ребенка) формирование грамположительного анаэробного звена микрофлоры проходит в более ранние сроки. На процесс колонизации бифидобактериями кишечника новорожденного оказывает решающее влияние поступление нативного материнского грудного молока. Это связано как с прямым действием бифидум-фактора, так и опосредованно через поступление мму-ноглобулинов, лактоферрина, компле-
мента, интерферона-а и других содержащихся в молоке составляющих иммунитета [4, 9].
Нами проведено сравнение видового репертуара бифидо-бактерий у 26 детей, находящихся на грудном вскармливании (n=16) и на искусственном (n=10), в возрастной группе от 0 до 6 месяцев. У детей, находящихся на искусственном вскармливании, не обнаружены такие виды бифидобактерий, как B. infantis, B. angulatum, частота обнаружения B. bifidum составила 30%, что статистически значимо отличалось от частоты обнаружения данного вида бифидобактерий в возрастной группе детей до 6 месяцев (65,4%). Если для детей, находящихся на грудном вскармливании, характерны бифидобактерии видов B. infantis, B. breve, B. bifidum, то у детей того же возраста, но находящихся на искусственном вскармливании, выделяется вид B. adolescentis, который превалирует в микробиоценозе взрослого человека. Дисбиотические нарушения в составе микрофлоры детей, находящихся на искусственном вскармливании, могут определять необходимость проведения коррекции препаратами-пробиотиками. У детей, получающих грудное вскармливание, бактериоценоз кишечника сохраняет достаточную стабильность. Полное же завершение процесса его становления с учетом всех физиолого-биохимических функций наступает к возрасту 2-3 года [6, 9].
Характер питания и условия окружающей среды также оказывают существенное влияние на состав микрофлоры толстой кишки [16].
Нами проведено сравнение видового состава бифидобактерий у взрослых людей, регулярно употребляющих мясо (n=23), и вегетарианцев (n=17). У лиц с мясной диетой не обнаруживался вид бифидобактерий B. breve, в целом спектр бифидобактерий был представлен 2-3 видами, тогда как у вегетарианцев обнаруживались 4-5 видов бифидобактерий. Показано, что у людей, предпочитающих мясо, больше условно патогенных/патогенных микроорганизмов, которые вытесняют представителей полезной микрофлоры.
При вегетарианской диете, при которой мясо не употребляется, но не исключается потребление молочных продуктов, микрофлора здоровее, крепче не только за счет гибели патогенных кишечных палочек, но и потому, что такая диета дает возможность для размножения полезных ацидофильных бактерий и нарастания энзимов [1].
Результаты сравнительного анализа бифидобактерий у 28 взрослых здоровых людей в разное время года выявил особенности сочетаний видов бифидобакте-рий. Наиболее разнообразный видовой репертуар (4-5 видов) бифидобактерий был характерен для зимнего периода, в весенне-летний период у тех же людей спектр бифидобактерий был представлен 3-4 видами.
Сравнительный анализ штаммов бифидобактерий в парах мать-ребенок.
В отличие от ранее принятого представления о вагинальной микрофлоре матери как первоисточнике микробной колонизации новорожденного в последние годы получены убедительные доказательства на генетическом уровне ведущей роли в этом процессе микрофлоры ее кишечника [14, 20].
Изучение качественного состава кишечной бифидофлоры проводилось в группе, включавшей 26 пар мать-ребенок. Все дети и матери на момент обследования были клинически здоровы и не имели в анамнезе инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта. Дети с момента рождения находились на грудном вскармливании.
Определение видовой принадлежности выделенных бифидобактерий выявило, что некоторые из обследуемых были источниками двух или большего количества изолятов одного вида. Данный факт подтверждает субвидовое штаммовое разнообразие бифидобактерий, обусловленное генетическими факторами. Бактериальный геном содержит большое количество повторяющейся ДНК, локализованной как в его кодирующей, так и некодирующей части. Нуклеотидные повторы отличаются размером повторяющейся единицы, протяженностью или количеством повторов, ориентацией, расположением и др. Такие повторы наиболее подвержены вариабельности количества повторяющихся единиц, то есть представляют высокополиморфные участки генома. Таким образом, отличия в спектрах продуктов амплификации будут обусловлены протяженностью повтора.
П р и м е ч а н и е. Дорожки 1-5 соответствуют профилям элек-трофоретических полос продуктов REP-ПЦР материнских штаммов В. ЫМит пары №12. Дорожки 6-12 - детских в той же паре. Выявлены два варианта профилей REP-ПЦР. Первый вариант был у материнских штаммов В. ЫМит 1, 4, и у детско-го штамма 7; второй - у материнских штаммов В. ЫМит 2, 3, 5 и у детских штаммов 6, 8-12. Дорожка 13 - отрицательный контроль. Дорожки М1, М2 - маркеры молекулярного веса ДНК
Анализ электрофореграмм фрагментов REP-ПЦР с праймерами к ну-клеотидным повторам позволил охарактеризовать спектры ампликонов у каждого из исследованных штаммов бифидобактерий в парах мать-ребенок, при этом учитывали общее количество фрагментов, их размер.
У 18 (из 26) пар мать-ребенок были выявлены совпадающие по видовой принадлежности штаммы бифидобактерий. Видами, которые встречались и в группе матерей, и в группе детей, были B. longum -в 11 парах, B. bifidum - в 8, B. adolescentis и B. breve - в одной паре. Для того чтобы установить, являются ли данные штаммы матерей и детей генетически идентичными, был использован метод REP-ПЦР. В тех случаях, когда REP-ПЦР профили изучаемых бифидобактерий, выделенных от матери и ребенка, имели 100% идентичность по числу, а также массе электрофоретических полос, они рассматривались как принадлежащие одному штамму соответствующего вида бактерий, и, наоборот, когда продукты ПЦР при их электрофоретическом разделении давали различные профили полос, изоляты рассматривали как различные штаммы одного вида бифидобактерий (рисунок).
Возраст детей, колонизированных би-фидобактериями, генетически идентичными материнским штаммам, в 15 случаях варьировал от 1 до 5 месяцев, а в трех случаях был от 6 до 10 месяцев. Таким образом, более половины детей (69%) были колонизированы кишечными штаммами бифидобактерий, генетически идентичными штаммам, которые были выделены от их матерей.
Заключение
Широкое внедрение в практику микробиологических исследований генетических методов, основанных на амплификационной технологии (ПЦР), дает возможность осуществлять детекцию видов бифидобактерий, что в свою очередь позволяет более эффективно решать задачи изучения особенностей комбинационного разнообразия видов би-фидобактерий в возрастной перспективе, в зависимости от действия различных факторов внешней среды, типа питания. Молекулярно-генетические методы, основанные на амплификационной технологии, позволяют эффективно решать задачи по молекулярно-генетическому
типированию бифидобактерий с целью установления уровня их внутривидовых вариаций в микрофлоре кишечника у детей и взрослых людей.
Установлено, что на протяжении первых лет жизни в популяции бифи-добактерий микрофлоры кишечника у здоровых детей наблюдаются выраженные качественные и количественные изменения. В ранние периоды физиологической адаптации для микрофлоры кишечника у детей характерны высокие популяционные уровни и частота выделения бифидобактерий видов B. bifidum, B. longum и B. breve. Кроме того, у детей в первые 6 месяцев после рождения к этой группе относятся и бифидобактерии B. longum, В. infantis. У детей в возрасте 6 лет и у взрослых бифидофлора в основном представлена видами B. ongum, B. adolescentis, B. catenulatum и B. bifidum.
Подтверждено, что характер питания и условия окружающей среды оказывают существенное влияние на состав микрофлоры толстой кишки. В видовом составе бифидобактерий у взрослых людей, регулярно употребляющих мясо, не обнаруживался вид бифидобактерий B. breve, а спектр бифидобактерий был представлен
2-3 видами, тогда как у вегетарианцев обнаруживались 4-5 видов би-фидобактерий. В разное время года определены особенности сочетаний видов бифидобактерий: наиболее разнообразный видовой репертуар (4-5 видов) бифидобактерий был характерен для зимнего периода, в весенне-летний период у тех же людей спектр бифидобактерий представлен
3-4 видами.
Участие материнских штаммов би-фидобактерий в ранней колонизации кишечника детей было подтверждено с использованием REP-ПЦР. Полученные нами результаты свидетельствуют в пользу существующей гипотезы об участии материнских штаммов би-фидобактерий в ранней колонизации кишечника детей. Индигенная микрофлора матери родственна в антигенном отношении организму ребенка, что способствует более активной ее имплантации.
Л И Т Е P А Т У P А
1. Бeлмeр C.B., Ггсилинг T.B. // Вопросы детской диетологии. - 2003. - Т.1, №5. - C.17-20.
2. Бoтинa С.Г., ^имингK.M., KoрoбaнH.B. AMepxa-tioBa A.M. // Генетика. - 2010. - Т.46, №11. - C.1485-1493.
3. ВнчapoBa Г.И., Чиcтякoвa В.И., Ляннзя A.M. и др. // Сб. научных трудов МНИИЭМ. - 1990. -C.48-53.
4. Зaвгopoдняя Е.Ф. // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. - 2009. - №15. - C.148-155.
5. KeшишянЕ.С., Бepдникoвa Е.К. // Практика педиатра. - 2013. - С.51-54.
6. Keшишян Е.С., Рюминa И.И. // Вестник педиатрической фармакологии и нутрициологии. - 2005. -Т.4, №2. - C.79-84.
7. KocmK C.A., Koлoмиeц Н.Д., Рyдeнкoвa T.B., noлуян О.С. Теоретические и прикладные вопросы применения методов анализа нуклеиновых кислот: Монография. - Минск, 2014. - 272 с.
В. KocmK С.А. Молекулярно-биологические методы в медицине: Монография. - Минск, 2013. - 327 с.
9. Онищeнкo Г.Г., Aлeшкин B.A., Aфaнacьeв С.С., Пocпeлoвa B.B. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии. - М., 2002. - 607 c.
10. PaKoBa Е.Б., nonKoBa С.М., Нeмчeнкo У.М. и др. // Гиг. и санит. - 2011. - №4. - С.22-26.
11. Cидopeнкo A.B., Hoвик Г.И., ArnMoB B.H. // Микробиология. - 2008. - Т.77, №3. - С.293-302.
12. Cтeфaни Д£., Beльтищeв Ю.Е. Иммунология и иммунопатология детского возраста: Рук-во для врачей. - М., 1996. - 384 с.
13. Yp^a Н.И. // Вопросы соврем. педиатрии. -
2011. - Т.10, №4. - C.62-69.
14. Фpoлoвa H.A. Особенности формирования микробиоценоза детей раннего возраста в зависимости от микробного пейзажа кишечника матери: Автореф дис. ... канд. мед. наук. - Смоленск, 2002. - 23 с.
15. Шeндepoв БЛ. Медицинская микробная экология и функциональное питание. - М., 1998, 2001.
16. ЩepбaкoвП.Л., Hижeвич A.A., Лoгинoвcкaя B.B. и др. // Фарматека. - 2007. - №14. - C.28-34.
17. Arunachalam K.D. // Nutrit. Res. - 1999. - Vol.19, N10. - P.1559-1597.
18. Damman C.J., Miller S.I., Surawlcz C.M., Zisman TL // Am. J. Gastroenterol. - 2012. - Vol.107, N10. - P.1452-1459.
19. Fanaro S., Chierici R., Gueriini P., Vigi V. // Acta Paediatr Suppl. - 2003. - Vol.92, Suppl.441. - P.1559-1597.
20. Favier C.F, Vaughan E.E., De Vos W.M., Akkermans A.D.L. // Applied Environmental Microbiol. -2002. - Vol.68, N1. - P.219-226.
21. HiettK.L., SealB.S. // Methods Mol. Biol. - 2009. -Vol.551. - P.49-58.
22. Kallus S.J., Brandt L.J. // J. Clin. Gastroenterol. -
2012. - Vol.46, N1. - P.16-24.
23. Lee Y.K // Biosci. Microbiota Food Health. - 2013. -Vol.32, N1. - P.1-12.
24. Shanahan F // Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. -2002. - Vol.16, N6. - P.915-931.
25. Ventura M., Canchaya C., Del Casale A., et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2006. - Vol.56. - P.2783-2792.
Пocтynилa 25.10.2016 г.
