CC BY
28
культуры бифидобактерий, выращенных на тиогликолевой среде. Исследовано всего 40 образцов культур, выделенных от детей г. Иркутска и семейных пар «мать — дитя» г. Ангарска. Эти города Иркутской области относятся к экологически неблагополучным территориям с высокой степенью техногенного загрязнения (Гос. доклад, 1998 — 2000).
В основу определения геновида бифидобактерий был положен метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с набором синтетических олигонуклеотидных зондов, специфически комлемен-тарных видам B. longum, B. adolescentis, B. bifidum и B. catenulatum. Выделение плазмидной ДНК из микробиоты, лактобацилл и бифидобактерий осуществляли по Кайзеру (Kiser T., 1984) с некоторыми модификациями, что позволяло нам получать плазмидную ДНК большей массы в образцах и наиболее очищенную от белков. Для определения плазмид с учетом их размера и количества в выборках из обоих городов использовали электрофорез в 0,7 % агарозном геле.
В гибридизационной картине с ДНК мы получили все 4 вида бифидобактерий, но с различной степенью представительства. В общей выборке доминирующим видом оказался B. longum, другие виды бифидобактерий представлены у жителей изучаемых городов следующим образом: в Ангарске вторым по частоте встречаемости видом был B. bifidum, а в Иркутске — B. catenulatum. Минорным видом для Иркутска стал B. bifidum, а для Ангарска — B. adolescentis (Ракова Е.Б. и др., 2007).
Электрофореграмма плазмидных профилей свидетельствовала о присутствии в обеих выборках населения плазмид одного размера (около 20 тысяч пар нуклеотидов). Плазмида выявлялась только у B. longum, который был доминирующим видом. В ангарской выборке данная плазмида выявлялась почти в два раза чаще, чем в иркутской. В выборке из г. Ангарска практически в равной степени эта плазмида представлена в группах как взрослых, так и детей.
Таким образом, установлено следующее.
1. Существует особенность видового состава и разная степень представительства 4-х видов бифидобактерий в Иркутске и Ангарске.
2. Плазмидный профиль бифидобактерий представлен наличием плазмиды одной формы и одного размера (около 20 т.п.н.), которая имеет разную частоту выявления в выборках из разных городов Иркутской области.
3. Изученная плазмида выделялась только от B. longum, являющимся доминирующим видом в обеих выборках.
В.Г. Ливенцева, Н.А. Кайгородова
байкальский букет видов: Экология и молекулярная филогения
Лимнологический институт СО РАН (Иркутск)
Последнее десятилетие широкое распространение получили методы молекулярной систематики, зачастую являющиеся единственно возможным способом, позволяющим разобраться в родственных связях таксонов и дать объективную оценку видового разнообразия в экологических исследованиях. В этом смысле интересными объектами являются «букеты видов», представляющие собой монофиле-тические группы близкородственных видов, дивергировавших в рамках одной замкнутой экосистемы. В Байкале обнаружены два букета видов олигохет (Kaygorodova et al., 2007). Байкальский букет видов рода Pseudorhynchelmis (8 видов) подробно изучен в предыдущих исследованиях (Ливенцева и др., 2003; Кайгородова и др., 2007). В данной работе мы представляем результаты исследования представителей богатого букета видов Lamprodrilus (20 видов), населяющих ограниченное экологическое пространство — пролив Ольхонские ворота.
методы исследования
Молекулярный анализ. Препараты тотальной ДНК отдельных особей получены по методу Дойла-Диксона. Фрагмент гена mtCOI длиной 710 п.н. амплифицирован с использованием олигонуклеотидных праймеров, универсальных для большинства беспозвоночных. Расшифровка первичной структуры ДНК проведена с помощью реакции секвенирования двухцепочечных продуктов амплификации.
Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проведен с использованием программ SplitsTree v.4 (Huson & Bryant, 2006) и Phyml v.2.4.4 (Guindon & Gascuel, 2003).
результаты
Анализ собранного на Байкале биологического материала выявил неравномерность распределения видов по озеру. Как оказалось, на Байкале имеются места с поразительно богатым видовым составом. Одно из таких мест — Ольхонские ворота, где обнаружено 26 видов олигохет (рис. 1).
Рис. 1. Распределение видов олигохет по оз. Байкал, высота столбцов и число над ними означают количество обитающих в данном месте видов.
Молекулярно-филогенетический анализ проведен для 41 вида олигохет, 25 из них обитают в Ольхон-ских воротах. Все 25 «ольхонских» видов кластеризуются вместе независимо от заданного алгоритма поиска и применяемого метода анализа (рис. 2А, 2Б). Порядок ветвления внутри этой группы достоверно не разрешается, что свидетельствует об очень быстром (взрывообразном) происхождении этих видов от общего предка.
Рис. 2. Филогенетические отношения внутри группы олигохет, обитающей в проливе Ольхонские ворота, полученные на основе сравнения 41 нуклеотидной последовательности гена mtCOI с применением разных алгоритмов филогенетического анализа (А - ML-древо; Б - простирающееся NJ-древо).
Согласно полученным филогенетическим деревьям (рис. 2), виды трех родов Agriodrilus, Teleuscolex и Lamprodrilus независимо от систематической принадлежности группируются вместе, как представители одного таксономического ранга. Идея объединения этих трех таксонов в единый род Lamprodrilus оправдана как с точки зрения классической морфологии, так и молекулярной филогении, что доказано в представленной нами работе.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 08-04-98063).
литература
1. Кайгородова И.А. Исследование монофилии рода Rhynchelmis Hoffmeister, 1843 (Oligochaeta, Lumbriculidae): филогения, основанная на морфологии / И.А. Кайгородова, В.Г. Ливенцева // Электронный журнал «Исследовано в России». — 2007. — № 139. — С. 1506—1516. — http://zhurnal.ape.relarn.ru/ articles/2007/139.pdf.
2. Ливенцева В.Г. Филогенетический анализ родства видов рода Rhynchelmis (Oligochaeta, Annelida) / В.Г. Ливенцева, И.А. Кайгородова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, - 2003. - № 7. - С. 131-132, 171.
3. Guindon S. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood / S. Guindon, O. Gascuel // Systematic Biology. - 2003. - Vol. 52 (5). - P. 696-704.
3. Huson D. Application of Phylogenetic Networks in Evolutionary Studies / D. Huson, D. Bryant // Mol. Biol. Evol. - 2006. - Vol. 23 (2). - P. 254-267.
4. Kaygorodova I. Molecular phylogeny of Baikalian Lumbriculidae (Oligochaeta): Evidence for recent explosive speciation / I. Kaygorodova, D. Sherbakov, P. Martin // Comparative Cytogenetics. - 2007. -Vol. 1. - P. 71-84.
5. Rapidly evolving lineages impede the resolution of phylogenetic relationships among Clitellata (Annelida) / P. Martin, I. Kaygorodova, D. Sherbakov, E. Verheyen // Mol. Phyl. Evol. - 2000. - Vol. 5 (3). -P. 355-368.
О.В. Макарова, О.А. Секерина, В.Н. Немерилова
частота и особенности диссоциации у штаммов трех подвидов bacillus thuringiensis
ГОУ ВПО Иркутский государственный университет (Иркутск)
Одной из форм внутривидовой изменчивости, известной для многих бактерий, является диссоциация, которая заключается в появлении различающихся по ряду наследуемых свойств вариантов при размножении исходно однородной популяции клеток. От спонтанных мутаций диссоциативные изменения отличаются высокой частотой, обратимостью и комплексностью. В связи с тем, что у многих возбудителей инфекционных заболеваний при диссоциации появляются варианты с существенным различием в патогенности, крайне необходимо прогнозирование изменения состава бактериальной популяции. Никакие прогнозы невозможны без знания механизмов, частот диссоциативных переходов, коррелятивных зависимостей между генетическими, морфологическими и физиолого-биохимическими различиями у диссоциантов.
Исследование закономерностей диссоциации у энтомопатогенного вида бактерий Bacillus thuringiensis (ВТ) представляет не только коммерческий интерес из-за появления в исходных спорокристаллообразующих штаммах, имеющих, как правило, S-морфологию и формирующих на плотной среде колонии белого цвета, особей с нарушениями споруляции и способности формировать кристаллический токсин (R-варианты). Согласно результатам молекулярно-генетических исследований последних лет ВТ проявляет очень тесное родство с таким патогенном как Bacillus antracis - возбудителем сибирской язвы. И хотя представители этих видов занимают разные экологические ниши, среди ВТ были обнаружены штаммы, патогенные для мышей и вызывающие серьезные оппортунистические инфекции у человека. О закономерностях и механизмах диссоциации у представителей группы Bacillus cereus, к которой относят оба упомянутых вида, известно крайне недостаточно.
Целью настоящего исследования явилось определение частоты SoR диссоциации и особенностей появления диссоциантов в периодических культурах штаммов, принадлежащих к разным подвидам Bacillus thuringiensis.
В исследовании использовали штаммы 49 subsp.dendrolimus (серотип Н4з4ь), 1003 subsp. entomocidus (серотип Н6), 2002 subsp. thuringiensis (серотип Н1), полученные из коллекции Музея микробиологии Иркутского государственного университета.
Клетки или споры из отдельных колоний с четкой морфологией, характерной для исследуемого варианта, переносили в 15 мл жидкой среды Луриа-Бертани (LB) и культивировали двенадцать часов при 28 °С с естественной аэрацией. Ночные культуры разбавляли свежей прогретой до 28 °С средой LB в соотношении 1 : 750 и продолжали культивирование в течение 72 часов. Исходное число жизнеспособных клеток, динамику размножения культур и появление диссоциативных вариантов контролировали путем периодического высева проб на агаризованную среду LB. Число формируемых на плотной среде колоний учитывали через сутки, а их морфологию описывали на 5-7 сутки. Параметры роста вычисляли по формулам, предложенным для периодических культур.
Исследовали характер размножения и динамику появления R-вариантов у восьми S-клонов штамма 49, семи S-клонов штамма 2002 и трех S-клонов штамма 1003, а также характер размножения и динамику появления S-вариантов у независимо полученных трех R-клонов штамма 49, трех R-клонов штамма 2002 и трех R-клонов штамма 1003.
Результаты исследования показали, что в оптимальных условиях культивирования исследуемые S-клоны одного и того же штамма, а также S-клоны штаммов разных подвидов достоверно не отличались по характеру размножения. Время генерации клеток в логарифмическую фазу роста S-клонов штамма 49 составило 0,8 ± 0,11 ч, штамма 2002 - 0,8 ± 0,07 ч и штамма 1003 - 0,8 ч. По-видимому, скорость размножения этих бацилл находится под строгим генетическим контролем. В период 6-9 часов культуры замедляли рост и переходили в стационарную фазу, которая продолжалась до конца периода наблюдения. Процесс отмирания, т.е. внутриклоновый отбор, становился заметным только лишь после 24-48 часов
