CC BY
217. Megan E.N., Martin M. O., Chan P. H. et al. Atomic force microscopy of bacterial communities. Meth. Enzymol. 2005, 397: 256-258.
8. O'Toole G.A., Kaplan A.N., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. An. Rev. Microbiol. 2000, 4: 49-76.
9. Teran Arce F., Carlson R., Monds J. et al. Nanoscale structural and mechanical properties of non-typeable Haemophilus influenzae biofilms. J. Bacteriology. 2009, 191 (8): 2512-2520.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Перунова Н.Б.,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. 93532)77-86-97
© А.В.ВАЛЫШЕВ, А.С.ВАСИЛЬЧЕНКО, 2013 А.В.Валышев, А.С.Васильченко
ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ДЕЙСТВИЯ КАТИОННОГО АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА НИЗИНА НА БАКТЕРИИ LISTERIA MONOCYTOGENES С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург
Цель. Характеристика морфо-функциональной реакции бактериальных клеток Listeria monocytogenes на воздействие катионного пептида низина. Материалы и методы. Культуру бактериальных клеток L. monocytogenes 88-BK выращивали в присутствии низина (опыт) и в его отсутствие (контроль). Полученные образцы исследовали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) в контактном режиме с использованием сканирующего зондового микроскопа SMM-2000. Исследование упругих свойств бактериальных клеток проводили с использованием АСМ в режиме силовой спектроскопии. Результаты. Выращенные в присутствии субингибиторных концентраций антибиотика микроорганизмы характеризовались изменением морфологии клеток и механических свойств, что посредством АСМ было зафиксировано как изменение размерных параметров бактерий, визуализированные локальные разрушения поверхности с увеличением ее шероховатости, а также снижение механической прочности клеточной стенки. Заключение. Использование атомно-силовой микроскопии позволяет детализировать механизмы биологической активности катион-ного пептида низина на грамположительные бактерии, оценить спектр произошедших изменений морфологических и механических параметров клеток, проанализированных в условиях, близких к нативным.
Журн. микробиол., 2013, № 5, С. 8—13
Ключевые слова: листерии, низин, катионные антимикробные пептиды, атомная силовая микроскопия
A.V.Valyshev, A.S.Vasilchenko
STUDY OF FEATURES OF THE EFFECT OF CATIONIC ANTIMICROBIAL PEPTIDE NISIN ON LISTERIA MONOCYTOGENES BACTERIA BY USING ATOMIC-FORCE MICROSCOPY
Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia
Aim. Characteristic of morpho-functional reaction of Listeria monocytogenes bacterial cells to the effect of cationic peptide nisin. Materials and methods. Culture of L. monocytogenes 88-BK bacterial cells was grown in the presence of nisin (experiment) and without it (control). The samples obtained were studied by atomic-force microscopy method in contact mode by using scanning probe of SMM-2000 microscope. Study of elastic properties of bacterial cells was carried out by using AFM in force spectroscopy mode. Results. Microorganisms grown in the presence of subinhibitory concentrations of antibiotic were characterized by changes in cell morphology and
mechanical properties that were recorded by using AFM as changes in size parameters of bacteria, visualized local lesions of surface with the increase of its roughness as well as decrease of mechanical durability of the cell wall. Conclusion. Use of atomic-force microscopy allows to detail mechanisms of biological activity of cationic peptide nisin on gram-positive bacteria, evaluate specter of changes of cell morphological and mechanical parameters that took place and were analyzed in the conditions close to native.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 5, P. 8-13
Key words: listeria, nisin, cationic antimicrobial peptides, atomic-force microscopy ВВЕДЕНИЕ
Катионные белки являются медиаторами иммунной системы различных живых организмов, осуществляющими неспецифическую защиту хозяина от инфекционных агентов [9]. К данной группе веществ относятся бактериоцины, вырабатываемые микроорганизмами. Так, бактерии Lactococcus lactic являются продуцентами ланти-биотика низина, представляющего собой линейный полипептид с молекулярной массой 3,5 кДа, содержащий 34 аминокислотных остатка [3]. Наиболее широко свое применение низин нашел в области пищевой промышленности в качестве эффективного консерванта [8].
Понимание механизмов биологической активности противомикробного агента является необходимым условием оптимального его использования в терапии различных бактериальных инфекций. Подобные исследования проводятся с использованием разных методов, среди которых микроскопия является одним из широко используемых и информативных. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является очередным этапом развития микроскопической техники, с появлением которой возможность изучения микроорганизмов перестала быть преимуществом исключительно оптической микроскопии, а достигаемое пространственное разрешение позволяет АСМ конкурировать с электронной.
Принцип работы АСМ основан на силовом взаимодействии острой иглы — зонда, закрепленной на гибкой балке (кантилевере), с поверхностью исследуемых объектов, что позволяет получать истинные трехмерные изображения с высоким пространственным разрешением без использования специальных методик пробоподготовки образцов, изменяющих нативные свойства микроорганизмов [4]. Практика исследований, проводимых посредством АСМ, сделала возможным описать спектр морфологических и механических изменений бактериальных клеток под воздействием лизоцима [1], катионных антимикробных пептидов [11]. Так, использование АСМ при изучении действия различных катионных антимикробных пептидов на микробные клетки Escherichia coli позволило оценить особенности биологической активности исследуемых препаратов и установить в каждом случае различный механизм мембрано-повреждающего действия [12].
В этой связи, целью настоящей работы стало изучение особенностей морфо-функциональной реакции грамположительных бактерий Listeria monocytogenes на воздействие катионного антимикробного пептида низина, реализованное посредством атомно-силовой микроскопии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
При проведении исследования использовали культуру бактериальных клеток L. monocytogenes 88-BK. Для определения субингибиторной концентрации низина («Sigma-Aldrich», USA) готовили серию его последовательных разведений в питательной среде LB-broth с содержанием антибиотика от 2 до 4 мкг/мл. В качестве контроля использовали культуру клеток, выращенных на питательной среде без пептида. Исходную культуру L. monocytogenes 88-BK, выращенную в течение 24 ч при 37°С,
суспендировали в питательном бульоне до оптической плотности 0,1 ед при 640 нм, после чего полученную суспензию в объеме 100 мкл инокулировали в 2,5 мл бульона, содержащего низин в разной концентрации и инкубировали в течение 24 ч, после чего оценивали рост визуально. Определённая подобным образом субингибиторная концентрация низина составила 64 мкг/мл.
Выращенные в присутствии низина (опыт) и без него (контроль) микроорганизмы отмывали центрифугированием при 4000 об/мин в дистиллированной воде, после чего взвесь бактерий в объёме 10 мкл наносили на свежий скол слюды.
Полученные образцы исследовали методом АСМ в контактном режиме с использованием сканирующего зондового микроскопа SMM-2000 (ЗАО «ПРОТОН-МИЭТ», Россия). В процессе сканирования использовали кантилеверы MSCT-AUNM («Park Scientific Instruments», США) с жесткостью балки 0,05 Н/м и радиусом порядка 10 нм. Количественный морфометрический анализ полученных изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа. Исследование упругих свойств бактериальных клеток проводили с использованием АСМ в режиме силовой спектроскопии, при котором происходит снятие зависимости прогиба кантилевера от расстояния между концом иглы и поверхностью образца. Получаемые в процессе измерений так называемые «кривые подвода» представляют собой графическое отображение зависимости отклонения кантиле-вера от его перемещения по вертикальной оси Z. Алгоритм исследования включал предварительное получение кривых подвода с объекта, упругость которого превышает константу упругости кантилевера (kc), в качестве такового выступала поверхность свежесколотой слюды. В этом случае предполагается, что движение сканера по оси Z (Az) сопровождается пропорциональным отклонением кантилевера (Ad). В свою очередь, в случае «мягкого» образца (ko<kc) отклонение кантилевера оказывается несимметричным движению сканера (Az>Ad), поскольку поверхность объекта «продавливается» зондом. Зарегистрированные показатели в дальнейшем используются для вычисления глубины продавливания как 8=Az-Ad с последующим расчетом модуля Юнга по модели Герца [7], описывающей контактную деформацию двух тел.
Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики с использованием модульной программы «Attestat», работающей в среде MS Excel.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
При исследовании на атомно-силовом микроскопе микроорганизмов были получены серии их изображений, а также данные силовой спектроскопии. Одной из важнейших особенностей получаемой посредством АСМ информации является отображение истинной трехмерной геометрии объектов, что позволяет детально проанализировать морфологию бактериальных клеток. Основные морфологические параметры бактерий, оцениваемые количественно, включали в себя: длину, ширину,
Морфологические параметры бактерий L. monocytogenes до и после воздействия низина в субингибиторных концентрациях
Исследуемые группы бактерий Морфологические характеристики
Длина (мкм) Ширина (мкм) Высота (мкм) Объем (мкм3) Rq (нм)
Контроль 1,55+0,24 0,63+0,18 0,37+0,01 2,55+0,56 1,00+0,20
Объекты 1 типа 1,63+0,26 0,62+0,08 0,35+0,03 2,49+0,30 1,10+0,02
Объекты 2 типа 1,07+0,16* 0,87+0,14* 0,47+0,06* 2,48+0,44* 1,85+0,19*
Примечание. * p<0,05 (критерий Уилкоксона ).
АСМ-изображения интактных клеток L. monocytogenes (А) и инкубированных с низином в субингитор-ных концентрациях (Б); увеличенное изображение клеток L. monocytogenes опытной группы (В).
Масштабная линия — 1 мкм.
высоту клеток, а также рассчитанный на этой основе объем бактерий. Проведенная на атомно-силовом микроскопе визуализация контрольных образцов L. monocytogenes (рис. А) показала, что интактные бактериальные клетки, расположенные преимущественно в цепочках, характеризуются палочковидной формой со средними значениями длины 1,55±0,24, ширины 0,63+0,18 и высоты 0,37+0,01 нм (табл.). Атомно-силовая микроскопия ультраструктуры клеточной стенки интактных бактерий позволила охарактеризовать рельеф поверхности как относительно гладкий, среднеквадратичная шероховатость (Rq — отклонение точек профиля от его средней линии) которой составила 1,00+0,20 нм.
Культивирование бактерий в присутствие субингибиторных концентраций низина привело к выраженной гетерогенности популяции бактерий по характеру их реагирования.
Так, по данным АСМ 43% бактериальных клеток листерий (обозначены в табл. и на рис. Б как объекты 1 типа) сохраняли палочковидную форму клеток, характерную для интактных бактерий. Детальное изучение ультраструктуры поверхности не выявило каких-либо изменений ее морфологии, значения шероховатости клеточной стенки не имели достоверных отличий от контрольных величин (табл.). В то же время, упругие свойства подобных объектов были несколько снижены по сравнению с ин-тактными клетками.
В свою очередь, в отношении 57 % клеток бактериальной популяции листерий, обработанных пептидом, атомно-силовая микроскопия позволила зафиксировать значимые изменения общей морфологии микроорганизмов, что позволило отнести их ко второму морфотипу бактериальных клеток (обозначены в табл. и на рис. Б как объекты 2 типа). Было отмечено уменьшение длины бактерий на 31% с одновременным увеличением ширины и высоты клеток на 38 и 27% (табл.).
Исследование ультраструктуры поверхности клеток и их механических свойств также позволило детектировать существенное их отличие от интактных клеток контрольной группы. Так, на поверхности клеток в некоторых случаях визуализировалось частичное разрушение клеточной стенки (провалы на поверхности клеток, обведенные на рис. В); шероховатость подобных объектов значимо увеличивалась с 1,00+0,20 до 1,85+0,19 (р<0,01). Одновременно ригидность клеточной стенки листерий оказывалась сниженной на 59 % по сравнению с интактными бактериальными клетками.
ОБСУЖДЕНИЕ
Группа веществ белковой природы, обладающих антибактериальной активностью, была открыта более 90 лет назад; к настоящему времени описано более 800 различных вариантов катионных антимикробных пептидов [2]. Интерес к данной группе определяется растущими случаями появления мультирезистентных штаммов микроорганиз-
мов, при этом использование препаратов катионных пептидов рассматривается в качестве перспективного подхода в терапии различных инфекций [5].
Механизм биологического действия низина, как установлено в результате различных исследований с использованием модельных систем, основывается на первоначальном электростатическом взаимодействии молекулы катионного пептида с анионными липидами цитоплазматической мембраны бактерий, причем присутствие среди них липида II существенно усиливает мембранолитическое действие низина. Результатом подобного взаимодействия является нарушение целостности цито-плазматической мембраны, а также нарушение синтеза пептидогликана клеточной стенки прокариот. Несмотря на то, что действие низина на бактерии изучалось посредством различных видов электронной микроскопии [13], к настоящему моменту отсутствуют данные АСМ-исследований о взаимодействии низина с бактериальными клетками.
В данном исследовании с использованием атомно-силовой микроскопии было показано, что популяция листерий, культивируемых в присутствии субингибиторных концентраций низина, оказывается гетерогенной по характеру реагирования на воздействие пептида. Подобная гетерогенность может объясняться существованием в одной популяции клеток с различным уровнем восприимчивости к взаимодействию, обусловленной силами электростатической природы, а также варьированием количества липида II в цитоплазматической мембране бактерий [10].
Взаимодействие катионного пептида низина с анионным липидами цитоплазма-тической мембраны бактерий ведет, с одной стороны, к нарушению биосинтеза пеп-тидогликана клеточной стенки, а с другой стороны, к образованию поровых комплексов [6]. Зафиксировать образование поровых комплексов в цитоплазматической мембране грамположительных бактерий, имеющих наружный пептидогликановый слой, посредством АСМ не представляется возможным, однако атомно-силовая микроскопия позволяет детектировать нарушение барьерных функций клеточной стенки как изменение морфологии бактериальных клеток и их механических параметров.
Описанные в данной работе объекты 1 типа, несмотря на отсутствие значимых морфологических изменений, характеризовались, тем не менее, сниженными значениями упругих свойств клеточной стенки, что может свидетельствовать о ее структурных изменениях под воздействием катионного пептида. Существенно более выраженная морфо-функциональная реакция наблюдалась у объектов 2 типа, в отношении которых посредством АСМ зафиксировано изменение формы бактерий с палочковидной на шарообразную с увеличением объема клеток. Подобная асимметрия может быть следствием нарушения процесса синтеза пептидогликана клеточной стенки бактерий под воздействием низина, при этом бактериальные клетки испытывают сочетанное влияние двух сил, оказывающих внутреннее и внешнее воздействие на снизившую свою ригидность клеточную стенку (растягивающее клетку изнутри, с одной стороны, и сдерживающее это растяжение за счет соседних расположенных в цепочке клеток — с другой).
Исследование ультраструктуры поверхности бактерий, отнесенных к объектам 2 типа, выявило значительное увеличение шероховатости и зафиксировало в некоторых случаях провалы клеточной стенки, подобные тем, что были выявлены посредством электронной микроскопии [13], что также свидетельствует о произошедших под воздействием низина нарушений барьерных функций клеточной стенки L. monocyto-genes.
Таким образом, использование атомно-силовой микроскопии позволило детализировать механизмы биологической активности катионного пептида низина на грам-положительные бактерии, оценить спектр произошедших изменений морфологических и механических параметров клеток, проанализированных в условиях, близких к нативным. Показано, что характер биологического действия данного катионного
пептида связан с нарушением структурной организации клеточной стенки бактерий, в результате чего клетки становятся осмотически неустойчивыми. Атомно-силовая микроскопия зарекомендовала себя как адекватный поставленным задачам метод, позволяющий получать уникальную информацию, недоступную другим методам исследования.
Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 12-И-4-2052.
Л ИТЕРАТУРА
1. Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Filonov A.S. et al. Comparative studies of bacteria with an atomic force microscopy operating in different modes. Ultramicroscopy. 2001, 86 (1 — 2): 121-128.
2. Brogden K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat. Rev. Microbiol. 2005, 3 (3): 238-250.
3. Cheigh C.I., Pyun Y.R. Nisin biosynthesis and its properties. Biotechnol. Lett. 2005, 27 (21): 16411648.
4. Dorobantu L.S., Gray M.R. Application of atomic force microscopy in bacterial research. Scanning. 2010, 32 (2): 74-96.
5. Hancock R.E., Lehrer R. Cationic peptides: a new source of antibiotics. Trends Biotechnol. 1998, 16 (2): 82-88.
6. Hasper H.E., Kramer N.E., Smith J.L. et al. An alternative bactericidal mechanism of action for lantibioticpeptides that target lipid II. Science. 2006, 313 (5793): 1636-1637.
7. Hertz H. Über die Berührung fester elastischer Köroper (On the contact of elastic solids). Journal für die reine und angewandte Mathematik. 1881, 92: 156-171.
8. Hurst A. Nisin. Adv. Appl. Microbiol. 1981, 27: 85-123.
9. Jenssen H., Hamill P., Hancock R.E. Peptide antimicrobial agents. Clin. Microbiol. Rev. 2006, 19 (3): 491-511.
10. Kaur G., Malik R.K., Mishra S.K. et al. Nisin and class IIa bacteriocin resistance among Listeria and other foodborne pathogens and spoilage bacteria. Microb. Drug. Resist. 2011, 17 (2): 197205.
11. Mangoni M.L., Papo N., Barra D. et al. Effects of the antimicrobial peptide temporin L on cell morphology, membrane permeability and viability of Escherichia coli. Biochem. J. 2004, 380 (Pt 3): 859-865.
12. Meincken M., Holroyd D.L., Rautenbach M. Atomic force microscopy study of the effect of antimicrobial peptides on the cell envelope of Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 2005, 49 (10): 4085-4092.
13. Tong Z., Zhou L., Li J. et al. In vitro evaluation of the antibacterial activities of MTAD in combination with nisin against Enterococcus faecalis. J. Endod. 2011, 37 (8): 1116-1120.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Валышев Александр Владимирович, к.м.н., 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-86-97
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
Б.Н.Мишанькин, О.В.Дуванова, Е.С.Шипко, Л.В.Романова, А.С.Водопьянов, А.К.Ерибекян, М.В.Шишияну, Л.К.Лысова, С.О.Водопьянов
СИСТЕМА АКТИВАЦИИ ПЛАЗМИНОГЕНА У VIBRIO CHOLERAE
Ростовский-на-Дону противочумный институт
Цель. Изучение системы активации плазминогена у Vibrio cholerae. Материалы и методы. В работе использовано 75 штаммов V. ^о1егае различного происхождения. Плазминоген выделяли из плазмы человека аффинной хроматографией на L-лизин сефа-розе, а-енолазную активность определяли прямым методом, предполагающим превращение 2-фосфоглицерата в фосфоенолпируват. Для выделения мембранного белка OmpT вибрионы разрушали ультразвуковым дезинтегратором, не разрушенные клетки отбрасывали центрифугированием, а клеточный лизат центрифугировали 1 час при 105 000 g.
