CC BY
93
Since 1999 ISSN 2226-7425
The journal of scientific articles "Health & education millennium", 2015, volume 17, no. 1
----—
ИЗУЧЕНИЕ ОНКОСТАТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА МЕЛАТОНИНА В УСЛОВИЯХ БЕНЗ(А)ПИРЕНОВОЙ МОДЕЛИ КАНЦЕРОГЕНЕЗА У МЫШЕЙ
П.М. Канаев, Н.А. Плотникова, С.П. Кемайкин, О.Н. Дерябина
ФГБОУВПО «Мордовский госуниверситет им. Н.П. Огарева» Медицинский институт
Кафедра патологии с курсом патологической физиологии г. Саранск
В работе проведено исследование влияния разных доз мелатонина на некоторые морфологические параметры экспериментального канцерогенеза мягких тканей у мышей.
Ключевые слова: естественные антиоксиданты, индуцируемый канцерогенез, патоморфологическая характеристика.
В последние годы большое внимание уделяется изучению биологических эффектов мелатонина — гормона, синтезируемого в эпифизе (шишковидной железе), преимущественно в ночные часы. Мелатонин обладает широким спектром физиологических влияний, среди которых большой интерес вызывает подавление клеточной пролиферации и противоопухолевое действие в условиях экспериментального опухолевого роста. Кроме того, мелатонин является одним из сильнейших эндогенных антиоксидантов [1].
Несмотря на то, что противоопухолевая активность мелатонина известна довольно давно и в течение длительного периода времени действие мелатонина изучалось, главным образом in vitro на культурах опухолевых клеток различного гистогенеза. В опытах, выполненных in vitro, показано, что эффект мелатонина зависит от его дозы [2].
В связи с этим, проблема коррекции опухолевого роста эндогенным гормоном мелатонином, а также изучение действия исследуемого препарата на бенз(а)пиреновой модели канцерогенеза приобретает особую актуальность.
Целью работы является изучение влияния разных доз мелатонина на некоторые морфологические параметры экспериментальных опухолей мягких тканей у мышей.
Задачи работы:
1) изучить влияние мелатонина на частоту, множественность и размеры опухолей подкожной клетчатки, индуцированных бензо(а)пиреном у мышей;
2) исследовать влияние мелатонина на динамику патоморфологических изменений в опухолевой ткани;
3) изучить латентный период опухолей, продолжительность жизни животных и выживаемость опухоленосителей при коррекции мелатонином;
4) выявить дозовую зависимость действия ме-латонина на морфологические и показатели опухолевого роста мягких тканей у мышей.
Материал и методы: опыт поставлен на 140 самках аутбредных белых мышей SHR/u массой 20—22 грамма в возрасте 3 месяцев. Животные содержались в стандартных условиях содержания вивария: в металлических клетках (60 X 40 X 30 см), по 20 мышей в каждой клетке, при температуре 22 ± 2 °C при стандартном режиме освещения (12 часов свет, 12 часов темнота). Животные получали гранулированный корм и водопроводную воду без ограничений. В возрасте 3 месяца мыши были рандомизированно поделены на 3 группы по 40 мышей. Оставшиеся 20 мышей служили интактным контролем. Животным 1-й, 2-й и 3-й групп однократно подкожно был введен канцероген — бензо(а)пирен в дозе 2 мг/мышь. Со следующего после введения канцерогена дня животные 2-й и 3-й групп получали с питьевой водой в ночные часы (с 19.00 ч. до 07.00 ч.) мелатонин (Sigma, St. Louis; MS, США) в дозах 20 мг/л и 2 мг/л соответственно. Животные 1-й группы составили контрольную группу (канцерогенез без коррекции). Экспозиция составила 7 месяцев. После окончания эксперимента животные забивались декапитацией. Для каждой группы определяли частоту и множественность опухолей, латент-
—-г^е^б^-—
~ 12 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Fundamental studies --
ный период развития опухолей, продолжительность жизни животных и выживаемость опухоле-носителей. Кусочки опухолевой ткани после обычной гистологической обработки заливали в парафин. Тонкие гистологические срезы 5—7 мкм были окрашены гематоксилином и эозином и затем тщательно изучены микроскопически. Опухоли классифицировали согласно рекомендациям МАИР. Микропрепараты легких фотографировали цифровой камерой Nikon Coolpix 4500 с помощью микроскопа Микмед-2 при увеличении х80 и х400. Полученные микрофотографии обрабатывали с помощью пакета программ Adobe Photoshop 7.0. Для биохимических исследований собиралась кровь, свободно вытекающая после декапитации и ткань опухолей подкожной клетчатки. В сыворотке крови и гомогенатах ткани опухолей определяли уровень малонового диальдегида (МДА) и активность каталазы. Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием критериев t Стьюдента, точного метода Фишера и х2 с помощью пакета прикладных программ «МедСтатистика» и «Биостат».
Результаты: по истечении 7 месяцев у мышей контрольной группы опухоли возникали с частотой 73% (24 из 33 животных). Начиная с 126 суток, у животных данной группы на спинке в области введения канцерогена возникало опухолевидное образование округлой формы, плотной консистенции с неровной поверхностью. По мере увеличения размеров опухолевые узлы теряли подвижность, врастая в подлежащие ткани. Кожа над опухолью во всех случаях была изъязвлена, волосяной покров отсутствовал. Среди опухолей, возникающих после короткого латентного периода (126—140 суток), преобладали опухоли большого размера.
При исследовании post mortem опухоли не имели четких границ, тугоподвижны, плотно спаяны с окружающими тканями. На разрезе опухолевая ткань беловато-серого цвета, имеет вид «рыбьего мяса», режется с хрустом, с очагами некрозов и кровоизлияний. При вскрытии в большинстве случаев выявлено распространение опухоли per continuitatem на подлежащие ткани и органы: мышцы спины, паранефральную клетчатку, правую или левую почку.
При введении мелатонина в дозе 20 мг/л число животных с опухолями составило 35% (14 живот-
ных из 40), что на 38% меньше по сравнению с контролем (р < 0,05). При введении мелатонина в дозе 2 мг/л частота развития опухолей уменьшилась на 46,7% по сравнению с контролем и составила 26,3% (12 животных из 38) (р < 0,001).
Макроскопически в группе животных, получавших мелатонин в дозе 20 мг/л, лишь в одном случае отмечалось изъязвление над поверхностью опухоли. В остальных случаях, а также в группе, получавшей мелатонин в дозе 2 мг/л, нарушения целостности кожных покровов не развивались, волосяной покров оставался сохранным. В опытных группах в половине случаев опухолевые узлы имели были окружены капсулой и имели эндофит-ную форму роста.
В контрольной группе у 6,1% животных (2 мыши из 24) выявлены метастазы опухоли в печень (в правую долю печени). Метастатические опухолевые узлы размером 5—6 мм, округлой формы, плотной консистенции, четко отграничены от паренхимы печени. В обеих опытных группах, получающих мелатонин, признаков метастатического поражения внутренних органов не было обнаружено.
Размеры опухолевых узлов под влиянием мелатонина существенно не изменялись. Так, в группе контроля средний размер опухолей составил 29,1 ± ± 1,28 мм (минимальный размер — 15 мм, максимальный — 37 мм). Аналогичные показатели в группах, получавших мелатонин в дозах 20 и 2 мг/л соответственно составили 28,8 ± 1,27 мм (минимальный размер — 15 мм, максимальный — 33 мм) и 29,2 ± 0,75 (минимальный размер — 25 мм, максимальный — 33 мм) (р > 0,05).
Средняя длительность латентного периода опухолей в группе контроля составила 152 ± 13 суток. Первые опухоли появились через 126 суток после введения канцерогена. Максимальный латентный период составил 168 суток.
При введении мелатонина отмечено увеличение латентного периода развития опухолей. Так, у мышей, получавших мелатонин в дозе 20 мг/л, средний латентный период развития опухолей составил 160 ± 6,3 суток, что на 5,3% (8 суток) больше, чем в контроле. Минимальный латентный период составил 147 суток, максимальный — 168 суток. Различие значений среднего латентного периода
—-г^е^б^-—
~ 13 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
The journal of scientific articles "Health & education millennium", 2015, volume 17, no. 1
—--—
Рис. 1. Влияние мелатонина на развитие опухолей и латентный период
в данной группе и в группе контроля недостоверно (р = 0,3271, тест Колмогорова-Смирнова).
В группе мышей, получавших мелатонин в дозе 2 мг/л, средняя длительность латентного периода составила 165 ± 3,6 суток, что на 8,6% (13,3 суток) больше, чем в контроле. Минимальный латентный период составил 161 сутки, максимальный — 168 суток. Различие значений среднего латентного периода в данной группе и в группе контроля статистически достоверно (р = 0,0046, тест Колмогорова-Смирнова). Различие данного показателя между группами, получавшими мелатонин в дозах 20 мг/л и 2 мг/л, недостоверно (р = 0,2718, тест Колмогорова-Смирнова). Влияние мелатонина на значение латентного периода развития опухолей представлено на рис. 1, 2.
сутки 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
БП+МЛТ 20 мг/л БП+МЛТ 2 мг/л
минимальный максимальный
БП-контроль □средний
Рис. 2. Значение среднего, минимального и максимального латентного периода в группе контроля и в группах, получавших мелатонин.
♦ — достоверность отличий по отношению к контрольной группе
Средняя продолжительность жизни мышей в группе контроля составила 165 ± 14,4 суток (минимальная — 133 суток, максимальная — 182 суток). После введения бензо[а]пирена под влиянием мелатонина значительно увеличивалась средняя, минимальная и максимальная продолжительность жизни мышей. При введении мелатонина в дозе 20 мг/л средняя продолжительность жизни у мышей составила 175 ± 8,7 суток, что на 6,5% (10,5 суток) больше, чем в группе контроля. Минимальная продолжительность жизни составила
161 сутки, максимальная — 189 суток. Различие средней продолжительности жизни в контроле и в группе, получавшей мелатонин в дозе 20 мг/л статистически несущественно (р = 0,2262, тест Колмогорова-Смирнова).
В группе мышей, получавших мелатонин в дозе 2 мг/л, средняя продолжительность жизни увеличилась на 12,6% (21 сутки) и составила 185 ± ± 6,4 суток (минимальная — 175 суток, максимальная — 192,5 суток). Различие средней продолжительности жизни в контроле и в группе, получав-
—-г^е^б^-—
~ 14 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999 ISSN 2226-7425
Fundamental studies —--—
шеи мелатонин в дозе 2 мг/л, статистически значимо (р = 0,0007, тест Колмогорова-Смирнова). Различие данного показателя между группами, получающими разные дозы мелатонина существенно (р = 0,0248, тест Колмогорова-Смирнова).
Изменение значений средней, минимальной и максимальной продолжительности жизни мышей под влиянием мелатонина отражены на рис. 3. В группе контроля темп роста кривых Гомперца меньше, чем в опытных группах. Наибольший темп увеличения кривых Гомперца отмечался в группе, получавшей меньшую дозу мелатонина.
Средняя продолжительность жизни мышей после появления опухолей составила 13 ± 2 суток (минимальная — 7 суток, максимальная — 14 суток). Введение мелатонина значительно увеличивало среднюю, минимальную и максимальную продолжительность жизни мышей после развития опухолей. Так в группе, получавшей мелатонин 20 мг/л, средняя продолжительность жизни после развития опухолей составила 16 ± 4,9 суток, что на 23,1% (3 суток) больше, чем в группе контроля (минимальная — 10,5 суток, максимальная — 24,5 суток). Различие средней продолжительности жизни после появления опухолей в контроле и в группе, получавшей мелатонин в дозе 20 мг/л статистически значимо (р = 0,0665, тест Колмогорова-Смирнова).
Доза 2 мг/л оказалась более эффективной, чем доза 20 мг/л. В данной группе аналогичный показатель увеличился на 60,4% (7 суток) и составил 20 ± 4 суток (минимальная продолжительность
сутки
25
20
15
10
5
0
БП-контроль БП+МЛТ 20 мг/л БП+МЛТ 2 мг/л □средняя минимальная максимальная Рис. 4. Средняя, минимальная и максимальная продолжительность жизни мышей в контроле и опытных группах после развития опухолей
♦ Достоверность отличий по отношению к контрольной группе
жизни — 14 суток, максимальная — 24,5 суток). Различие средней продолжительности жизни после появления опухолей в контроле и в группе, получавшей мелатонин в дозе 2 мг/л существенно (р = 0,0231, тест Колмогорова-Смирнова). После появления опухоли распределение продолжительности жизни в группах, получающих мелатонин, идентично с вероятностью 0,9983 (тест Колмогорова-Смирнова).
Изменение значений средней, минимальной и максимальной продолжительности жизни после появления опухолей у мышей в контроле и получающих мелатонин группах представлены на рис. 4.
Рис. 3. Кривые выживаемости Гомперца для мышей контрольной и опытных групп, получающих различные дозы мелатонина
24,5 24,5
14
16
13
ft
ИХ
20
14
—-г^е^б^-—
~ 15 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
The journal of scientific articles "Health & education millennium", 2015, volume 17, no. 1
—--—
Темп нарастания кривых выживаемости Гом-перца после появления опухолей в группе контроля наибольший. Самое медленное увеличение кривых Гомперца отмечено в группе, получавшей большую дозу мелатонина (рис. 5).
Рис. 5. Кривые выживаемости Гомперца животных после развития опухолей в контроле и в группах, получавших разные дозы мелатонина
При микроскопическом исследовании согласно рекомендациям МАИР опухоли классифицированы как злокачественные фиброзные гистиоцитомы.
Микроскопически при малом увеличении опухоль состоит из веретеновидных клеток, заключенных в сеть разнонаправленных пучков коллагено-вых волокон, часто формирующих характерные для данной опухоли муаровые структуры. При большом увеличении определяется выраженный клеточный полиморфизм. Характерно сочетание веретенообразных фибробластоподобных и гис-тиоцитоподобных клеток — одно- и многоядерных, уродливых или причудливой формы клеток.
Все клеточные элементы имеют признаки резко выраженной атипии: ядерный полиморфизм, гиперхромность, неравномерное распределение хроматина, нарушение ядерно-цитоплазматиче-ского соотношения. Характерны множественные митозы в опухолевых клетках. Ткань опухоли хорошо васкуляризирована. В ряде случаев обнаруживается инвазия опухолевых клеток в стенки кровеносных сосудов. В большинстве случаев от-
мечаются некрозы и кровоизлияния в опухолевой ткани.
Таким образом, в одних участках опухолевых узлов микроскопическая картина характерна для круглоклеточной саркомы; в других — для верете-новидноклеточной саркомы. В целом описанная гистологическая структура характерна для плео-морфного варианта злокачественной фиброзной гистиоцитомы с выраженной анаплазией клеточных элементов.
При микроскопическом изучении метастатических узлов в печени отмечается нарушение нормальной балочной структуры, диффузная и очаговая инфильтрация полиморфными гиперхромными опухолевыми клетками. Также имеются признаки инвазивного роста — опухолевые клетки выявлялись в центральной вене долек печени. Отличий по гистологической структуре опухолевой ткани у животных контрольной и опытных групп не отмечено.
Выводы
1. Мелатонин оказывает выраженное онко-статическое действие на развитие индуцированных опухолей мезенхимального гистогенеза у мышей, что проявляется в уменьшении частоты развития опухолей и увеличении их латентного периода;
2. Мелатонин оказывает антиметастатическое действие на опухоли мягких тканей в эксперименте;
3. Мелатонин значительно увеличивает продолжительность жизни животных, подвергнутых воздействию бензо(а)пирена, а также выживаемость опухоленосителей;
4. Влияние мелатонина на изучаемые морфологические параметры имеет характер дозовой зависимости: более выраженное онкостатическое действие оказывает меньшая доза препарата.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кветная Т.В., Князькин И.В. Мелатонин: роль и значение в возрастной патологии / Под ред. В.Х. Ха-винсона. 2003.
2. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. В 2-х т. 2-е изд., доп. Т. 1. СПб.: Наука, 2008.
—-г^е^б^-—
~ 16 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999 ISSN 2226-7425
Fundamental studies ----—
T HE STUDY ONCO-STATIC EFFECT OF MELATONIN IN TERMS OF BENZ(A)PARANAIC MODEL OF CARCINOGENESIS IN MICE
P.M. Kanaev, N.A. Plotnikova, S.P. Kemaikin, O.N. Deryabina
Mordovian state University named N.P. Ogarev Medical institue
Department of pathology and course of pathological physiology Saransk
In the work the influence of different doses of melatonin on some morphological parameters of experimental carcinogenesis of the soft tissues in mice.
Key words: natural antioxidants induced carcinogenesis, pathomorphological characteristics.
REFERENCES
1. Kvetnaja T.V., Knjaz'kin I.V. Melatonin: rol' i zna-chenie v vozrastnoj patologii. Ed. V.H. Havinsona. 2003.
2. Anisimov V.N. Molekuljarnye i fiziologicheskie mehanizmy starenija. V 2-h t. 2-e izd., dop. Vol. 1. St. Petersburg: Nauka, 2008.
