CC BY
65
ОНКОСТАТИЧЕСКОЕ И ГЕРОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЯ МЕЛАТОНИНА И МЕТФОРМИНА В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ НЕОПЛАЗИЙ
О.Н. Дерябина1, Н.А. Плотникова2, В.Н. Анисимов3
ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», г. Саранск
Канцерогенез - многостадийный процесс, в течение которого нормальная стволовая клетка проходит последовательно несколько стадий, прежде чем станет злокачественной. Это сопровождается многообразными нарушениями внутреннего гомеостаза, изменениями нервной, иммунной и эндокринной систем [1]. Временные интервалы канцерогенеза точно не определены. Считается, что с момента молекулярной и генетической нестабильности до появления первой опухолевой клетки проходят многие годы, а появление первых клинических симптомов опухоли отделено от периода инициации канцерогенеза интервалом от 5 до 15 лет.
Мелатонин - основной гормон, синтезируемый в пинеальной железе из аминокислоты триптофана, преимущественно в ночное время. По химической структуре мелатонин представляет собой 5-метокси-Ы-ацетилированный дериват серотонина [2].
Антидиабетические бигуаниды [(буформин, метформин (сиофор), фен-формин)] - гипогликемические препараты из группы бигуанидов. [3]
Метформин гидрохлорид (сиофор) не влияет на количество инсулина в крови, но изменяет его фармакодинамику за счет снижения соотношения связанного инсулина к свободному и увеличения соотношения инсулина к про-инсулину.[4]
Важное звено в механизме действия мелатонина - стимуляция усвоения глюкозы мышцами и жировой тканью. Метформин усиливает кровоток в печени и ускоряет процесс превращения глюкозы в гликоген, снижает уровень триглицеридов, липопротеинов низкой и очень низкой плотности. Кроме того, сиофор улучшает фибринолитические свойства крови за счет подавления ингибитора активатора плазминогена тканевого типа. Метформин гидрохлорид почти не связывается с белками плазмы крови и максимальная его концентрация определяется в кишечнике, слюнных железах, печени и почках.
Основными свойствами антидиабетических бигуанидов являются: ги-погликемическое, метаболическое, антиокислительное и нейропротекторное [3].
Цель работы - изучение влияния мелатонина и метформина на канцерогенез тонкой кожи, индуцируемый бенз(а)пиреном у мышей.
Методика исследования. Эксперимент был поставлен на 120 самках нелинейных белых мышей, в возрасте 2 месяцев, массой 20-22 г. В возрасте 3 месяцев 120 мышей были рандомизированно поделены на 4 группы по 30 мышей. Животным четырех групп наносили на предварительно выбритый участок кожи спинки (межлопаточная область) диаметром 1,5-2 см бенз(а)пирен (Fluka, Busch, Швейцария) в концентрации 0,05%, растворенный в ацетоне в дозе 0,2 мл на мышь два раза в неделю.
Схема эксперимента. Таблица №1
Бенз(а)пиреновая модель Вид животных Доза вводимых препаратов Время экспозиции (месяц) Кол-во животных
1 серия
Интактные Мыши - - 2О
2 серия (канцерогенез кожи)
Контроль (бенз(а)пирен) Мыши О,2 мл/мышь 2 раза в неделю в течение 6-ти месяцев ЗО
Бенз(а)пирен +мелатонин Мыши 2 мг/л 6 ЗО
Бенз(а)пирен +метформин Мыши 2ОО мг/л 6 ЗО
Бенз(а)пирен +мелатонин +метформин Мыши 2 мг/л; 2ОО мг/л 6 ЗО
Дерябина Ольга Николаевна, клинический ординатор кафедры онкологии ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», г. Саранск E-mail: drlordus@rambler.ru Плотникова Надежда Алексеевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологии с курсом патологической физиологии ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», г. Саранск E-mail: plona@mail.ru
Анисимов Владимир Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела канцерогенеза и онкогеронтологии НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, г. С-Петербург
Длительность эксперимента составила 26 недель. Все опухолевые узлы, а также ткани и органы, подозрительные на наличие новообразований, были иссечены и зафиксированы в 10 % нейтральном формалине. После традиционной гистологической обработки кусочки кожи были залиты в парафин. Тонкие, 1-2 мкм гистологические срезы были окрашены гематоксилином и эозином и исследованы светооптически. Статистические методы исследования. Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием критериев t Стьюдента, точного метода Фишера, х2 с помощью пакета прикладных программ «МедСтатистика».
Результаты исследования. По завершению эксперимента рассчитывали среднюю продолжительность жизни животных после обнаружения новых опухолевых новообразований и средний латентный период развития опухолей.
Средняя продолжительность животных в группе контроля составляет 139,13+10,2 суток, под влиянием мелатонина - 164+5,7 суток, что больше на 9,38 % (различия достоверны, p<0,05). Средняя продолжительность жизни увеличилась на 10,55 % в группе животных, получавших метформин и составила 174+5,7 сутки, а при совместном применении мелатонина и метформина - 176+5,7 суток, что больше на 11,51% по сравнению с контролем (p<0,05). Продолжительность жизни животных после обнаружения опухолевых узлов составляет 86+3,1суток, что на 30,30% больше в группе, получавшей мелатонин, чем в группе контроля (66+6,91), но различия статистически недостоверны. При применении как одного метформина, так и совместно с мелатонином данные показатели составили 95+4,2 и 102+3,3 суток соответственно, что на 43,9 и 54,55% больше, чем в контрольной группе соответственно, (р<0,05). Средний латентный период развития опухолей равен 96+8,6 суток в группе контроля (минимальный период развития опухолей - 80 суток, максимальный - 150 суток). В группе животных, получавших мелатонин, показатель составил 123+5,2 суток, что на 28,13% больше, чем в контроле. Минимальный и максимальный период развития опухолей - 82 и 164 суток соответственно. При применении метформина на 29,16% увеличился средний латентный период развития опухолей (по сравнению с контролем) и составил 124+5,3 суток (минимальный период развития опухолей - 86 суток, максимальный - 170 суток). В группе животных, получавших метформин и мелатонин, данный показатель равен 134+5,8 суток, что на 39,38% больше, чем в контроле. Минимальный и максимальный период развития опухолей - 90 и 179 суток соответственно. Различия недостоверны (р<0,05).
Под влиянием бенз(а)пирена в месте аппликации у мышей развивались опухоли кожи с частотой 67 % (20 животных из 30 получавших мелатонин), 60 % (18 животных из 30 получавших метформин), 50 % (15 животных из 30 получавших мелатонин и метформин) и 83 % (25 животных из 30) в контрольной группе. Среднее число опухолей на 1 мышь-опухоленосителя в группе контроля составляет 3,4+0,4, а при применении мелатонина данный показатель уменьшился на 29,5 % по сравнению с контролем и составил 2,4+0,4. В группе животных, получавших метформин, показатель равен 2,1+0,3, что меньше, чем в контроле на 38%, а при совместном применении мелатонина и метформина среднее число опухолей на 1 мышь-опухоленосителя на 32 % меньше (по сравнению с контролем) и составляет 2,3+0,4. Все различия достоверны (p<0,05). Средний диаметр опухолей составляет 3,4+0,2 см в группе контроля, в группе, получавшей мелатонин - 2,1+0,2 см (что меньше на 38 %, чем в группе контроля); при применении метформина данный показатель составил 2,0+0,3см, то есть уменьшился на 41% по сравнению с контролем. При применении мелатонина и метформина одновременно средний диаметр опухолей на 53% меньше, чем у животных контрольной группы и составил - 1,6+0,2 см. Различия достоверны (p<0,001).
При микроскопическом исследовании наблюдалась гистологическая картина, характерная для плоскоклеточного ороговевающего рака и папиллом кожи. Патогистологическая структура плоскоклеточных раков и папиллом кожи в группе контроля и в группах, получавших мелатонин и метформин, была идентичной. При изучении микроскопического строения опухолей можно было выявить различные стадии их морфогенеза. Так, на ранних этапах канцерогенеза отмечается диффузное разрастание покровного эпителия. Впоследствии появляются атипические разрастания, имеющие склонность к ороговению в центре. Из подобных очаговых пролифератов возникают уже сформировавшиеся опухоли. Сформированные папилломы микроскопически представляют собой очаги дифференцированного эпителия, четко отграниченные от окружающей рыхлой волокнистой соединительной ткани с выраженными явлениями гиперкератоза. Клетки, составляющие такие очаги, значительно крупнее по сравнению с окружающими эпителиоцитами. Они имеют светлую цитоплазму, крупное ядро с несколькими ядрышками. При малигнизации папиллом кератиноциты приобретают характерные черты. Атипичные эпителиальные клетки погружаются в рыхлую соединительнотканную основу, глубоко идущие тяжи эпителия проникают через ножку папилломы. При этом, они достигают глубоких слоев дермы и прорастают в нее. Подобное строение отражает начало инфильтративного роста и формирование типичного плоскоклеточного рака. Эпителиоциты в ткани папилломы имеют различную степень дифференцировки. Иногда клетки анаплазированы и прорастают в подлежащие мышцы. Однако, в большинстве случаев, имеются признаки усиленного ороговения. Выявляются различные формы дискератоза и всегда выраженный гиперкератоз. По поверхности папилломы образуется все более утолщающийся пласт рогового вещества. В поверхностных слоях эпителия встречаются некробиотические изменения, изъязвление папиллом.
Плоскоклеточный рак кожи представлен атипичными опухолевыми клетками разной степени дифференцировки. В подавляющем большинстве случаев это плоскоклеточный ороговевающий рак. Процессы ороговения выражены с формированием характерных для этого вида рака «жемчужин» из рогового вещества. В центральной части опухолевых пролифератов имеются очаги некроза, явления стаза и полнокровия кровеносных сосудов. В
ряде наблюдений выявлен плоскоклеточный неороговевающий (низкодифференцированный) рак кожи, в котором отсутствовали «раковые жемчужины».
Число животных с гистологически верифицированными папилломами кожи составило в контроле - 27 %. При коррекции мелатонином число папиллом составило 30 % (p<0,05). В группе животных, получавших метформин, количество папиллом кожи - 40 %. При совместном применении мелатонина и метформина число животных с папилломами составляет 30 %. Различия с группой контроля достоверны (p<0,05). По данным гистологического исследования в контрольной группе число животных со злокачественными опухолями (плоскоклеточный ороговевающий рак и папиллома с очагами малигнизации) составило 57 % от всех животных с опухолями. При введении мелатонина в дозе 2 мг/л число животных со злокачественными опухолями составило 37 %, различия с группой контроля достоверны (p<0,05). При применении мелатонина совместно с метформином данный показатель составил 20 % и 20 % соответственно. Различия достоверны (p<0,001).
Содержание МДА у интактных животных составило 4,98 +0,58 ммоль/л в сыворотке крови и 4,12 + 0,31ммоль/л в гомогенатах ткани опухоли кожи. При введении мелатонина в дозе 2 мг/л содержание МДА в сыворотке крови достоверно уменьшилось на 63,84 % и составило 2,13+0,51 ммоль/л (р <0,01). Уменьшение МДА в опухолевой ткани на 52 % оказалось статистически достоверным (р <0,01). При введении метформина в дозе 200 мг/л содержание МДА в сыворотке крови достоверно уменьшилось на 17,66 % и составило 4,85+0,57 ммоль/л (р <0,1). МДА в опухолевой ткани достоверно уменьшилось на 65,08 % и составило 4,12 +0,99 ммоль/л (р <0,1).При введении мелатонина в дозе 2 мг/л и метформина (сиофор 500) в дозе 200 мг/л содержание МДА в сыворотке крови достоверно увеличилось на 19,19 % и составило 7,02+0,88 моль/л. (р <0,1). Уменьшение МДА в опухолевой ткани на 57,8 % статистически достоверно (р < 0,001) и составило 4,98 +1,42 ммоль/л. Мелатонин угнетал процессы ПОЛ в сыворотке крови, а метформин - в опухолевой ткани. При совместном использовании мелатонина и метформина процессы ПОЛ в сыворотке крови и опухолевой ткани активизировались.
Активность каталазы у интактных животных составила 0,35+0,44 мккат/л в сыворотке крови и 0,11+0,04 мккат/л в опухолевой ткани.
При введении мелатонина в дозе 2 мг/л активность каталазы в сыворотке крови снижалась на 87,82% (р<0,01), составив 0,04 +0,02 мккат/л. Активность каталазы в опухолевой ткани уменьшилась на 48,36 % (р <0,1) и составила 0,05+0,01 мккат/л. При введении метформина в дозе 200 мг/л активность каталазы в сыворотке крови снижалась на 35,98% (р<0,1), составив 0,22+ 0,44 мккат/л. В опухолевой ткани активность каталазы достоверно увеличивалась по сравнению с контрольной группой на 57 % (р<0,001) и составила 0,28+0,02 мккат/л. При введении мелатонина в дозе 2 мг/л и метформина (сиофор 500) в дозе 200 мг/л активность каталазы в сыворотке крови достоверно уменьшилась на 77,5 % (р < 0,001), составив 0,07+0,01 мккат/л. Снижение активности каталазы в опухолевой ткани на 14,91 % и составила 0,09 +0,02 мккат/л (р<0,1). Применение мелатонина снижало активность каталазы в сыворотке крови и опухолевой ткани, а использование метформина повышало активность каталазы в сыворотке крови и опухолевой ткани. Таким образом, в условиях экспериментального опухолевого роста мелатонин эффективно угнетал процессы ПОЛ в сыворотке крови; снижал активность каталазы, как в сыворотке крови, так и в опухолевой ткани.
Заключение.
Мелатонин и метформин обладают онкостатическим действием на опухолевый рост, индуцируемый бенз(а)пиреном у мышей. Частота развития опухолей кожи в эксперименте уменьшилась на 16 % при введении мелатонина, при коррекции метформином - на 23%, а при одновременном применении мелатонина и метформина - на 33 %. При этом, частота злокачественных опухолей уменьшилась в 1,5 раза у мышей, получавших мелатонин, в 2,8 раза - при введении метформина и в 2,8 раза - при коррекции мелатонином и метформином одновременно, тогда как частота развития папиллом не отличалась от группы контроля.
Мелатонин и метформин вызывали достоверное уменьшение среднего и максимального размеров опухолей кожи, а также выраженность вторичных изменений в опухолях.
Введение мелатонина и метформина существенно не влияло на латентный период развития опухолей. Применение данных препаратов вызывало увеличение средней продолжительности жизни животных, а также число дней максимальной продолжительности жизни мышей после появления опухолей.
Введение мелатонина и метформина способствует уменьшению числа животных с опухолями, уменьшению частоты, множественности и размеров опухолей кожи в условиях экспериментального опухолевого роста, а также способствует увеличению средней продолжительности жизни мышей после обнаружения опухолевых узлов. Полученные данные свидетельствуют об онкопротекторном и геропротекторном эффекте антидиабетического бигуанида - метформина (сиофора) и эндогенного гормона - мелатонина.
Наши результаты дополняют представления о способности мелатонина ингибировать развитие новообразований in vivo. Дальнейшее изучение мелатонина на моделях химического канцерогенеза in vivo и in vitro позволит глубже понять механизмы его онкопротекторного и геропротекторного действия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Анисимов В.Н. Сопоставление противоопухолевой активности экстрактов эпифиза, гипоталамуса, мелатонина и сигетина у мышей с перевивным раком молочной железы / В.Н. Анисимов, В.Г. Морозов, В.Х. Хавинсон, В.М. Дильман // Вопр. онкол. - 1973. - № 10. - С 99-101.
2. Kumar C.A. Effect of melatonin on two stage skin carcinogenesis in Swiss mice / C.A. Kumar, U. Das // Med.
Sci. Monit. - 2000. - Vol. 6. - P. 461-475.
3. Ганцев U1.X. Онкология / Ш.Х. Ганцев; М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - 516 с: ил. С. 58-72.
4. Зайчик А.Ш., Чурилов Л. П. Механизмы развития болезней и синдромов. Спб., 2002, ЭЛБИ - СПб, 307с.
5. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2011г.
6. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2010г.
7. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2009г.
8. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2008г.
9. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2007г.
10. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2006г.
11. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2005г.
12. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2004г.
13. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2003г.
14. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2002г.
15. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2001г.
16. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2000г.
17. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2011г.
18. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2010г.
19. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2009г.
20. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2008г.
21. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2007г.
22. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2006г.
23. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2005г.
24. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2004г.
25. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2003г.
26. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2002г.
27. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2001г.
