CC BY
108
CV CV
и ш U
X ш
и
Изучение новых систем доставки противоопухолевых препаратов на основе наночастиц нитрида бора
£§ И.Ю. Житняк1, И.В. Сухорукова2, А.М. Ковальский2, А. Т. Матвеев2, И.Н. Бычков3,
о Д. В. Штанский2, Н.А. Глушанкова1 о
Z 'НИИканцерогенеза ФГБУ «РОНЦим. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24;
а_ 2Национальный исследовательский технологический университет «Московский институт стали и сплавов»;
2 Россия, 119991, Москва, Ленинский проспект, 4;
g 3ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский университет им. Н.Н. Пирогова»;
Россия, 117997, Москва, ул. Островитянова, 1
be Контакты: Наталия Александровна Глушанкова natglu@hotmail.com
Одной из главных проблем лечения онкологических заболеваний является множественная лекарственная устойчивость неопластических клеток, возникающая в результате опухолевой прогрессии. Перспективным подходом для решения этой проблемы может стать использование наноносителей, так как в этом случае химиопрепараты способны проникать в опухолевые клетки посредством эндоцитоза и концентрироваться в околоядерной области вне зоны действия мембранных транспортеров. Одно из направлений для создания наноносителей противоопухолевых препаратов — получение структур на основе нитрида бора, обладающего химической инертностью и высокой стойкостью к окислению. Наночастицы гексагонального нитрида бора размером 100—150нм с гладкой и развитой поверхностью были получены методом химического осаждения из газовой фазы. Были отработаны условия нагрузки наночастиц нитрида бора доксорубицином, которые позволили получить наноконъюгаты с содержанием доксорубицина до 95 мкг/мг частиц. Показано, что наночастицы нитрида бора, нагруженные доксорубицином, стабильны при нейтральномрН, но эффективно высвобождают химиопрепарат в среде с рН 4,5—5,5. Для изучения взаимодействия наноконъюгатов с неопластическими клетками были использованы культуры чувствительных к доксорубицину линий IAR-6-1, KB-3-1, К562 и линий с множественной лекарственной устойчивостью КВ-8-5 и IS-9. Конфокально-микроскопические исследования показали, что наноконъюгаты успешно проникают как в чувствительные, так и в резистентные к доксорубицину клетки и накапливаются в околоядерной области. Выявлена колокализация наночастиц, нагруженных доксорубицином, с эндосомальным/лизосомальным компартментом клеток.
Ключевые слова: наночастицы нитрида бора, наноконъюгаты частиц нитрида бора с доксорубицином, конфокальная микроскопия, эндосома/лизосома
DOI: 10.17650/2313-805X-2016-3-2-34—41
The study of new anticancer drug delivery system based on the boron nitride nanoparticles
I.Yu. Zhitnyak1, I. V. Sukhorukova2, A.M. Koval'skiy2, A.T. Matveev2, I.N. Bychkov3, D. V. Shtanskiy2, N.A. Glushankova1
Research Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia;
24 Kashirskoe Shosse, Moscow, 115478, Russia; 2National University of Science and Technology, Moscow Institute of Steel and Alloys; 4 Leninskiy prospekt, Moscow, 119049, Russia; 3N.I. Pirogov Russion National Research Medical University; 1 Ostrovityanova St., Moscow, 117997, Russia
The main problem in the treatment of many cancers is multidrug resistance due to tumor progression. Using nanosized drug delivery systems allows to overcome the mechanisms of multidrug resistance of cancer, in this case, chemotherapeutic agents can effectively introduce into cancer cells by endocytosis and accumulate near the nucleus and far from ATP-binding cassette transporters. Creation of boron nitride-based drug delivery nanocarriers with high chemical and oxidative stability is one of the perspective ways. Using chemical vapor deposition spherical boron nitride particles,100—150 nm in diameter (BNNPs), with peculiar petal-like surfaces or smooth surfaces were fabricated. BNNPs were loaded with doxorubicin.
Drug loading efficacy of BNNPs-DOXwas about 0.095 mg/mg of particles. BNNPs-DOXwere relatively stable at neutralpH, whereas DOX is effectively released from the BNNPs at acidic pH (pH 4.5—5.5). Using confocal microscopy, the uptake of BNNPs-DOX by IAR-6-1, KB-3-1, К562 cells and multidrug resistant КВ-8-5 и IS-9 cells was studied. Most of BNNPs-DOX had been co-localized with LysoTracker, indicating that BNNPs-DOX are located in the endosomes/lysosomes after intracellular delivery.
Key words: boron nitride nanoparticles, boron nitride nanocarriers loaded with doxorubicin, confocal microscopy, endosome/lysosome
Введение
Современные исследования в области разработки высокоэффективных способов лечения онкологических заболеваний включают такое важное направление, как разработка систем доставки противоопухолевых препаратов. Одна из главных проблем лечения онко-
логических заболеваний — множественная лекарственная устойчивость неопластических клеток, возникающая в результате опухолевой прогрессии. Основным механизмом, обеспечивающим невосприимчивость к химиотерапевтическим препаратам клеток с множественной лекарственной устойчивостью, является
гиперэкспрессия в них белков ABC (ATP-binding cassette) семейства мембранных транспортеров, которые обеспечивают выведение препаратов из опухолевых клеток [1, 2].
Применение наноносителей может быть перспективным для преодоления множественной лекарственной устойчивости, так как в этом случае химиопрепа-раты проникают в опухолевые клетки не диффузией через клеточную мембрану, а посредством эндоцитоза, концентрируясь в околоядерной области вне зоны действия мембранных транспортеров и обеспечивая гибель опухолевой клетки [3, 4]. Известны примеры преодоления множественной лекарственной устойчивости с использованием полимерных и металлических наночастиц, насыщенных доксорубицином [4]. Другим преимуществом использования наноносителей является уменьшение или полное отсутствие токсических эффектов, вызванных воздействием лекарственных препаратов.
Современные знания о характеристиках различных типов наноматериалов и цитотоксичности наноструктур, конъюгированных с химиопрепаратами, остаются неполными и зачастую противоречивыми. К настоящему времени для транспорта лекарственных препаратов были опробованы различные типы носителей: белки [5], мицеллы [6], липосомы [7] дендримеры [8], неорганические наночастицы [9—14] и др. Одни носители прошли этапы доклинических исследований, другие проходят различные фазы клинических испытаний. На данный момент 5 препаратов на основе ли-посом утверждены для терапии опухолевых заболеваний [15]. Продолжаются активные попытки получить биосовместимые наноносители на основе новых материалов с высокой способностью к нагрузке лекарственными препаратами и последующим контролируемым освобождением препарата в опухолевой клетке, индуцированным изменением pH. Для успешного применения в биомедицине нанотранспортеров необходимо изучить их фармакологическую эффективность, а также проконтролировать их возможную ци-тотоксичность in vitro на культурах клеток.
Одним из перспективных материалов для создания наноносителей противоопухолевых препаратов является нитрид бора. Этот материал обладает химической инертностью и высокой стойкостью к окислению [16]. Показана возможность получения наноструктур нитрида бора с различной морфологией: нанотрубки [16—18], нановолокна [19, 20], нанопластины (графеноподоб-ные структуры) [21], наносферы [22]. Кроме того, недавние исследования показали, что наноструктуры нитрида бора не токсичны [23, 24], что позволяет их использовать в медицине.
Цель работы — отработка условий получения нано-конъюгатов на основе нитрида бора, нагруженных химиотерапевтическим препаратом доксорубицином, и изучение их взаимодействия с трансформированными клетками.
Материалы и методы
Объект исследования. Наночастицы гексагонального нитрида бора размером 100—150 нм были получены методом химического осаждения из газовой фазы (I.V. БикИогикоуа и соавт. [25]). Для получения газообразного оксида бора использовали смесь FeO: MgO:B = 150:28:75 при температуре + 1310 °С. Процесс высокотемпературного химического синтеза наноструктур нитрида бора из газовой фазы описан C. Tang и соавт. [26] и предполагает следующую последовательность химических реакций:
2B + 2MgO ^ B2O2 + 2Mg; 2B + 2FeO ^ B2O2 + 2Fe; B2O2 + 2NH3 ^ 2BN + 2H2O + H2.
Морфология поверхности наночастиц нитрида бора зависела от скоростей подачи транспортного (Аг) и реакционного (КЫ3) газов. Для синтеза наночастиц с гладкой наружной поверхностью скорости потока для Аг и КЫ3 составляли 500 и 100 см3/мин соответственно, а для синтеза наночастиц с развитой наружной поверхностью — 250 и 50 см3/мин.
Для получения устойчивых лизолей индивидуальных наночастиц нитрида бора использовали метод ультразвукового диспергирования на установке Бопо-рик ЫБ 2200 (ВапёеИп, Германия). Для изучения структуры наночастиц применяли просвечивающий электронный микроскоп 1ЕМ-2100 .ЕОЬ, Япония).
Клеточные линии. Для исследований использовали трансформированные диметилнитрозамином эпите-лиоциты печени крысы линии 1АК-6—1 [27], клетки линии хронического миелоидного лейкоза человека К562 и ее производной — линии 1Б-9 с множественной лекарственной устойчивостью, индуцированной в результате стабильной трансфекции белка Р-гликопроте-ина [28], клетки линии карциномы человека КВ-3—1 и ее производной — линии КВ-8—5 с устойчивостью к доксорубицину, полученной в результате селекции [29].
Получение наноконъюгатов частиц нитрида бора с доксорубицином. Доксорубицин разводили до концентрации 0,5 мг/мл или 2,5 мг/мл в КаАс-буферах с разным уровнем рЫ (5,4; 7,4; 8,4; 9,4) или в дистиллированной воде (Н2О). Наночастицы центрифугировали и к осадкам добавляли раствор доксорубицина (1 мл раствора на 2 мг частиц), затем инкубировали 24 ч при температуре +37 °С на качалке. Нагруженные доксорубицином наночастицы центрифугировали 15 мин при скорости 13 400 об/мин. Осадки нагруженных доксорубицином наночастиц ресуспендировали в Н2О и центрифугировали в течение 15 мин при скорости 13 400 об/мин, такую отмывку повторяли 3—5 раз.
Экстракция доксорубицина из наноконъюгатов. Доксорубицин экстрагировали из отмытых наноконъюгатов с помощью БМБО или 0,1 моль КаАс-буфера (рЫ 4,0) 24 ч при температуре +37 °С. После этого наночастицы центрифугировали 15 мин при скорости
CV CV
CS
и ш U
ж ш
и
CV CV
CS
и ш U
X ш
и
13 400 об/мин. Надосадочную жидкость отбирали в эп-пендорфы и измеряли оптическую плотность (optical density, OD) при длине волны 488 нм.
MIT-тест. Клетки рассевали в концентрации 20 000 клеток/мл в 24-луночные плашки по 1,9 мл в лунку или в 96-луночные плашки по 200 мкл в лунку в культуральной среде с 10 % телячьей эмбриональной сывороткой. На следующий день добавляли раствор доксорубицина для получения конечных концентраций 25, 50, 100, 250 и 500 нг/мл, а также 1, 5 и 10 мкг/мл. Через 72 ч среду заменяли на 200 мкл среды без сыворотки, добавляли 20 мкл готового раствора МТТ (5 мг/мл в фосфатном буфере) и инкубировали 4 ч при температуре +37 °С. Затем среду удаляли, образовавшийся нерастворимый формазан экстрагировали добавлением 150 мкл демитилсульфоксида и ресуспен-дировали. Измерения OD проводили при длине волны 570 нм. Результаты теста МТТ оценивали путем сопоставления OD в опытных и контрольных образцах и рассчитывали долю выживших клеток. На основании полученных данных рассчитывали концентрацию препарата, вызывающую гибель 50 % клеток IC50.
Микроскопия. Этапы взаимодействия наночас-тиц с живыми и фиксированными клетками анализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Германия) и инвертированного микроскопа Nikon Eclipse Ti-E (Nikon, Япония), оборудованного дифференциальной интерференционно-контрастной оптикой и камерой высокого разрешения ORCA-ER (Hamamatsu, Япония).
Флуоресцентно-микроскопический анализ накопления доксорубицина в клетках. Клетки рассевали в концентрации 100 тыс. клеток на чашку со стеклянным дном, через 24 ч меняли среду на бесцветную DMEM/F-12 с HEPES и 10 % телячьей эмбриональной сывороткой. В чашки добавляли доксорубицин до конечной концентрации 5 мкг/мл. С помощью инвертированного микроскопа Nikon Eclipse Ti-E (Nikon, Япония) выполняли съемку 10 полей зрения для каждой линии в флуоресцентном канале с одинаковой выдержкой (временные точки 0, 15, 75, 120, 180, 240, 300, 360 мин и 24 ч). Обработку изображений проводили в программе ImageJA 1.45b с измерением параметра MGV (Mean Gray Value) для фона, свободного от клеток, цитоплазмы (ЦП) и ядра на флуоресцентном изображении по 2 точки на каждый кадр. Показатель интенсивности флуоресценции (ИФ) вычисляли по формуле:
ИФядро/ЦП ("M"GVяцро/ЦП "M"GVфон)/"M"GVфон.
Трансфекция. Временную трансфекцию клеток KB-8—5 конструкцией EGFP (Evrogen, Россия) выполняли с помощью Lipofectamine LTX and Plus Reagent (Invitrogen, Life Technologies, США).
Визуализация эндосом/лизосом в клетках. Прижизненное окрашивание эндосом/лизосом проводили не-
посредственно перед началом наблюдения с использованием LysoTracker Green (Molecular Probes, Life Technologies, США).
Обработка данных. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программы MS Excel, графики и диаграммы были построены с использованием программы GraphPad Prism 6 Version 6.07 (Graph-Pad Software).
Результаты и обсуждение
Наночастицы гексагонального нитрида бора. При
разработке систем для доставки лекарств на основе наноносителей критическими параметрами являются их форма и размер. Полученный нами размер наноно-сителей лекарственных препаратов составлял 100—150 нм и был оптимальным (рис. 1).
При отработке методов получения наночастиц необходимо принимать в расчет несколько факторов:
1) размер наночастиц должен быть меньше диаметра тончайших капилляров, в которых будет осуществляться их циркуляция;
Рис. 1. Типы наночастиц (шкала 100 нм): а — наночастицы нитрида бора с гладкой поверхностью; б — наночастицы нитрида бора с развитой поверхностью
Концентрация доксорубицина в растворах после нагрузки наночастиц
Концентрация нагрузочного раствора доксорубицина, мг/мл
pH нагрузочного буфера 0,1 М NaAc
Концентрация доксорубицина в растворе после нагрузки, мг/мл
cv cv
CS
7,4 0,056 ± 0,004
0,5 8,4 0,028 ± 0,001
9,4 0,0005 ± 0,0004
7,4 0,642 ± 0,006
2,5 8,4 0,609 ± 0,022
9,4 0,458 ± 0,113
2) наночастицы должны иметь форму и размер, способствующие их проникновению в опухолевые клетки;
3) размер наночастиц должен препятствовать их быстрому выведению ретикулоэндотелиальной системой;
4) частицы размером < 50 нм лучше поглощаются клетками, однако они и быстрее выводятся из клетки;
5) частицы размером < 100 нм могут покидать кровеносные сосуды через «окна» в эндотелиальной выстилке;
6) частицы размером около 100 нм дольше удерживаются внутри опухолевых клеток.
7) наночастицы размером > 200 нм накапливаются в печени, почках, селезенке;
8) для частиц размером > 500 нм выше вероятность поглощения макрофагами, что препятствует доставке лекарств в опухолевые клетки.
Таким образом, оптимальный размер наноносите -лей лекарственных препаратов составляет 100—150 нм [30—31]. Форма наночастиц должна быть сферической для лучшего поглощения опухолевыми клетками.
Условия для получения наноконъюгатов частиц нитрида бора с доксорубицином. Для сравнения эффек-
тивности нагрузки наночастиц доксорубицином в различных концентрациях и при различном уровне рН использовали растворы с концентрацией доксорубицина 0,5 и 2,5 мг/мл. Наночастицы перед отмывкой от нагрузочных растворов центрифугировали 15 мин при скорости 13 400 об/мин. Надосадочную жидкость отбирали в эппендорфы и проводили спектрофотомет-рические измерения OD доксорубицина, оставшегося в растворе, при длине волны 488 нм (см. таблицу). Результаты исследования показали, что 0,5 мг/мл — оптимальная концентрация раствора доксорубицина для нагрузки наночастиц, так как после нагрузки в растворе практически не остается свободного доксорубицина. Использование раствора доксорубицина в концентрации 2,5 мг/мл не увеличивало аккумуляцию доксорубицина на частицах (данные не представлены), поэтому для дальнейших экспериментов была выбрана концентрация 0,5 мг/мл.
Анализ растворов доксорубицина после нагрузки наночастиц химиопрепаратом показал, что в растворах с высоким уровнем pH остается меньше свободного доксорубицина, что свидетельствует о более эффективной нагрузке наночастиц препаратом при повышении уровня pH (см. таблицу, рис. 2а). Измерения концент-
и ш u
X ш
и
ОД 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0
□ Наночастицы с развитой поверхностью
□ Наночастицы с гладкой поверхностью
7,4 8,4 9,4
рН нагрузочного буфера
ОД 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5
I I Наночастицы с развитой поверхностью □ Наночастицы с гладкой поверхностью
пШ
л
5,4
7,4 8,4 9,4
рН нагрузочного буфера
Рис. 2. Эффективность нагрузки наночастиц нитрида бора при различных уровнях pH раствора доксорубицина: а — оставшийся в растворе доксорубицин (чем выше уровень pH раствора, тем меньше свободного доксорубицина остается в растворе после 24 ч инкубации с наночас-тицами); б — экстрагированный доксорубицин (из частиц, нагруженных в кислой среде, экстрагируется значительно меньше доксорубицина, чем из частиц, нагруженных в нейтральной и щелочной среде)
а
0
см см
ев
и ш и
X ш
и
рации доксорубицина после экстракции наноконъю-гатов в демитилсульфоксиде показали, что большее количество доксорубицина выходит из наноконъюга-тов, полученных в слабощелочных растворах доксору-бицина (рис. 2б). В дальнейших экспериментах были использованы наноконъюгаты нитрида бора с доксо-рубицином, полученные нагрузкой химиопрепарата в 0,1 М КаЛе (рН 8,4).
Спектрофотометрические измерения количества нагруженного на частицы доксорубицина после экстракции демитилсульфоксида в раствор показали, что с гладких частиц экстрагировалось около 95 мкг/мг частиц, а с частиц с развитой поверхностью — около 85 мкг/мг частиц, что свидетельствует о высоком уровне нагрузки наноконъюгатов химиопрепаратом.
Условия выхода доксорубицина из наноконъюгатов. В серии экспериментов был проведен анализ выхода доксорубицина из наноконъюгатов в КаЛе-буферах с различным уровнем рН. Как видно из рис. 3, доксору-бицин наиболее эффективно выходит из наноконъю-гатов в кислой среде (рН 4,5—5,5). Уже за 2 ч в среде с уровнем рН 4,4 доксорубицина из наноконъюгатов выходит в 3,5 раза больше, чем при рН 7,4. Известно, что клетки эндосомы и лизосомы имеют кислый рН, поэтому описанные особенности высвобождения док-сорубицина из наноконъюгатов могут повысить эффективность действия препарата, доставляемого с помощью наночастиц нитрида бора.
Тестирование клеточных систем. Сравнительные исследования цитотоксического эффекта свободного доксорубицина проводили с помощью теста на выживаемость клеток (МТТ-тест) (рис. 4). При анализе результатов были выявлены выраженные различия исследуемых линий в чувствительности к доксорубицину. Для линии К562 1С50 составляла 0,10 ± 0,04 мкг/мл, для линии 1Б-9 — 2,5 ± 1,19 мкг/мл (разница в 24 раза). Для линии КВ-3 -1 1С50 была равна 0,1 ± 0,002 мкг/мл, для линии КВ-8-5 — 1,8 ± 1,2 мкг/мл (разница в 18 раз).
рН 4,4 рН 5,4 рН 7,4
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Время, ч
Рис. 3. рИ-зависимое высвобождение доксорубицина из наноконъюгатов. Измерение ОО доксорубицина в растворах на протяжении 24 ч исследования
120
; 100
£ 80
60
40
20
П~
0,01 0,1 1
Концентрация доксорубицина, мкг/мл
б
120
= 100
КВ-3-1 КВ-8-5
80
60
40
20
0 1-1—I—.......
0,01 0,1 1 10 Концентрация доксорубицина, мкг/мл
Рис. 4. Выживаемость клеток после воздействия различных концент -раций доксорубицина (МТТ-тест): а — клетки линий К562 и 13-9; б — клетки линий КВ-3-1 и КВ-8-5
Флуоресцентно-микроскопический анализ накопления доксорубицина в клетках. С помощью флуоресцентной микроскопии были проанализированы закономерности накопления свободного доксорубицина в чувствительных КВ-3-1 и резистентных КВ-8-5 клетках (рис. 5). Проведенный анализ показал существенную разницу в накоплении доксорубцина в клеточных компартмен-тах. В чувствительных клетках КВ-3-1 доксорубицин прогредиентно аккумулируется в основном в клеточном ядре, через 24 ч его концентрация в ядре в 2,5 раза больше, чем в ЦП. В резистентных клетках КВ-8—5 доксорубицин накапливается гораздо слабее, при этом уже через 5 ч его накопление в ядре выходит на плато, а через 24 ч флуоресценция доксорубицина в ЦП в 1,5 раза выше, чем в ядре (см. рис. 5б).
Визуализация наноконъюгатов в неопластических клетках. С использованием конфокальной микроскопии было исследовано взаимодействие нагруженных доксорубицином наночастиц нитрида бора с трансформированными клетками. Как видно на рис. 6, нано-
а
б
Накопление доксорубицина в клетках
КВ-3-1 (цитоплазма) КВ-3-1 (ядро)
КВ-3-1 (ядро)
CV CV
CS
и ш U
Рис. 5. Различия в накоплении доксорубицина в клетках KB-3—1 и KB-8-5: а — клетки KB-3—1 и KB-8—5 после 24 ч инкубации в среде, содержащей 5 мкг/мл доксорубицина (DIC (слева) и флуоресцентная микроскопия (справа); шкала 10 мкм); б — динамика накопления доксорубицина в цитоплазме и в ядре клеток KB-3—1 и KB-8—5 при инкубации в среде, содержащей 5мкг/мл доксорубицина
X ш
и
а
а
б
-
•х:
I
Рис. 6. Наночастицы нитрида бора, нагруженные доксорубицином, в неопластических клетках (конфокальная микроскопия; шкала 10 мкм): а — трансформированные эпителиальные клетки IAR-6-1 после 7ч инкубации с наноконъюгатами (актиновый цитоскелет, окрашивание Alexa488-phalloidin (зеленый), флуоресценция доксорубицина (красный);левая часть — проекция xyz, правая часть — проекция xzy; стрелки — нагруженные доксорубицином частицы нитрида бора; флажок — заметна флуоресценция доксорубицина в ядре); б — клетки KB-8—5 после 24 ч инкубации с нагруженными доксорубицином наночастицами нитрида бора (для визуализации клетки были трансфицированы GFP; зеленый — GFP, красный — флуоресценция доксорубицина; левая часть — проекции xyz с указанием расстояния до подложки, правая часть — проекции xzy; стрелки — нагруженные доксорубицином частицы нитрида бора
s9.
? ■' f v- ■ ' -
f f
Л '*1 * .' t
CV CV
CS
и ш U
Рис. 7. Выявление наноконъюгатов в эндосомальном/лизосомальном компартменте неопластических клеток (флажки — колокализация доксо-рубицина с лизосомами; во врезках увеличенные фрагменты изображения; конфокальная микроскопия; шкала 10мкм): а — трансформированные эпителиальные клетки IAR-6—1 после 4 ч инкубации с наноконъюгатами; б — клетки KB-8—5 после 2,5 ч инкубации с наноконъюгатами (слева направо: DIC-микроскопия;лизосомы, окрашенные LysoTracker Green (зеленый); флуоресценция доксорубицина (красный); наложение каналов)
конъюгаты успешно проникают внутрь клеток и концентрируются около ядра. В чувствительных клетках (см. рис. 6а) также видно, что доксорубицин с частиц аккумулируется в ядре.
Для прояснения механизмов проникновения нагруженных доксорубицином частиц нитрида бора в клетки был проведен сравнительный анализ распределения наноконъюгатов и эндосом/лизосом, окрашенных с помощью специфического красителя LysoTracker Green. По данным конфокальной микроскопии как в чувствительных, так и в резистентных клетках наблюдается колокализация наноконъюгатов и эндосом/лизосом (рис. 7). Ранее мы также показали, что ингибитор динаминопосредованного эндоцитоза динасор угнетает накопление доксорубицина в клетках, инкубированных с частицами нитрида бора, нагруженными доксорубицином [25]. Полученные данные указывают на то, что наноконъюгаты нитрида бора с доксорубицином высвобождают химиопрепарат вне зоны мембранных транспортеров и поэтому могут рассматриваться в плане их возможного применения для преодоления механизмов множественной лекарственной устойчивости.
Заключение
Наночастицы гексагонального нитрида бора размером 100—150 нм, полученные методом химического осаждения из газовой фазы, были использованы для получения наноконъюгатов с высоким уровнем нагрузки доксорубицина. Наночастицы нитрида бора, нагруженные доксорубицином, стабильны при нейтральном уровне рН, но эффективно высвобождают химиопре-парат в среде с уровнем рН 4,5—5,5. Проведенные исследования показали, что трансформированные клетки, как чувствительные, так и резистентные к доксоруби-цину, способны активно эндоцитировать наноконъю-гаты, высвобождая доксорубицин в ЦП. Эксперименты по исследованию действия наноконъюгатов частиц нитрида бора с доксорубицином на чувствительные и резистентные к химиопрепаратам клетки будут продолжены.
Благодарим К. Л. Фаерштейна (НИТУ «МИСиС») за помощь в проведении просвечивающей электронной микроскопии и Е.Ю. Рыбалкину (ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина») за предоставленные культуры клеток.
а
б
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Kirtane A.R., Kalscheuer S.M., Panyama J. Exploiting nanotechnology to overcome tumor drug resistance: Challenges and opportunities. Adv Drug Deliv Rev 2013;65(13-14): 1731-47.
2. Amin M.L. P-glycoprotein inhibition for optimal drug delivery. Drug Target Insights 2013;7:27-34.
3. Hillaireau H., Couvreur P. Nanocarriers' entry into the cell: relevance to drug delivery. Cell Mol Life Sci 2009;66(17):2873-96.
4. Couvreur P. Nanoparticles in drug delivery: past, present and future. Adv Drug Deliv Rev 2013;65(1):21-3.
5. Torchilin V.P., Lukyanov A.N. Peptide and protein drug delivery to and into tumors: challenges
and solutions. Drug Discov Today 2003;8(6):259-66.
6. Oerlemans C., Bult W., Bos M. et al. Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release. Pharm Res 2010;27(12):2569-89.
7. Kaasgaard T., Andresen T.L. Liposomal cancer therapy: exploiting tumor characteristics. expert opin drug deliv 2010;7(2):225-43.
8. Mintzer M.A., Grinstaff M.W. Biomedical applications of dendrimers: a tutorial. Chem Soc Rev 2011;40(1):173-90.
9. Dreaden E.C., Mackey M.A., Huang X. et al. Beating cancer in multiple ways using nanogold. Chem Soc Rev 2011;40(7): 3391-404.
10. Lal S., Clare S.E., Halas N.J. Nanoshell-enabled photothermal cancer therapy: impending clinical impact. Acc Chem Res 2008;41(12):1842-51.
11. Jokerst J.V., Gambhir S.S. Molecular imaging with theranostic nanoparticles. Acc Chem Res 2011;44(10):1050-60.
12. Trewyn B.G., Slowing I.I., Giri S. et al. Synthesis and functionalization
of a mesoporous silica nanoparticle based on the sol-gel process and applications in controlled release. Acc Chem Res 2007;40(9):846-53.
13. Bonacchi S., Genovese D., Juris R. et al. Luminescent silica nanoparticles. extending the frontiers of brightness. Angew Chem Int Ed Engl 2011;50(18):4056-66.
14. Xie J., Huang J., Li X. et al. Iron oxide nanoparticle platform for biomedical applications. Curr Med Chem 2009;16(10):1278-94.
15. Torchilin V.P. Multifunctional, stimulisensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov 2014;13(11):813-27.
16. Hurst J. Chapter 9 — Boron nitride nano-tubes, silicon carbide nanotubes, and carbon nanotubes — a comparison of properties and applications. In: Nanotube Superfiber Materials. Elsevier, 2014. Pp. 267-287.
17. Ciofani G., Del Turco S., Genchi G.G. et al. Transferrin-conjugated boron nitride nanotubes: Protein grafting, characterization, and interaction with human endothelial cells. Int J Pharm 2012;436(1-2):444-53.
18. Ferreira T.H., Marino A., Rocca A. et al. Folate-grafted boron nitride nanotubes: possible exploitation in cancer therapy. Int J Pharm 2015;481(1-2): 56-63.
19. Li X., Wen G., Zhang T. et al. Synthesis of continuous boron nitride nanofibers
by electrospinning. Physics Procedia 2012;25:185-8.
20. Lin L.X., Zheng Y., Li Z.-H. et al. A simple method to synthesize polyhedral hexagonal boron nitride nanofibers. Solid State Sci 2007;9:1099-104.
21. Lacerda L., Raffa V., Prato M. et al. Cell-penetrating CNTs for delivery of therapeutics. Nano Today 2007;2:38-43.
22. Yamakov V., Park C., Kang J.H. et al. Piezoelectric molecular dynamics model for boron nitride nanotubes. Computat Mater Sci 2014;95:362-70.
23. Ciofani G., Danti S., Genchi G.G. et al. Boron nitride nanotubes: biocompatibility and potential spill-over in nanomedicine. Small 2013;9(9-10):1672-85.
24. Salvetti A., Rossi L., Iacopetti P. et al. In vivo biocompatibility of boron
nitride nanotubes: effects on stem cell biology and tissue regeneration in planarians. Nanomedicine 2015;10(12):1911-22.
25. Sukhorukova I.V., Zhitnyak I.Y., Kovalskii A.M. et al. Boron nitride nanoparticles with petal-like surface as anticancer drug delivery system. ACS Appl Mater Interfaces 2015;7(31):17217-25.
26. Tang C., Bando Y., Sato T., Kurashima K. A novel precursor for synthesis of pure boron nitride nanotubes. Chem Commun 2002;12:1290-1.
27. Bannikov G.A., Guelstein V.I., Montesano R. et al. Cell shape and organization of cytoskeleton and surface fibronectin in non-tumorigenic rat liver cultures. J Cell Sci 1982;54:47-67.
28. Park S.W., Lomri N., Simeoni L.A. et al. Analysis of P-glycoprotein-mediated membrane transport in human peripheral blood lymphocytes using the uic2 shift assay. Cytometry A 2003;53(2):67-78.
29. Richert N., Akiyama S., Shen D. et al. Multiply drug-resistant human KB carcinoma cells have decreased amounts of a 75-kDa and a 72-kDa glycoprotein. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82(8): 2330-3.
30. Dreher M.R., Liu W., Michelich C.R. et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration
of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst 2006;98:335-44.
31. Champion J.A., Katare Y.K., Mitragotri S. Particle shape: A new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. J Control Release 2007;121(1-2):3-9.
cv cv
CS
и ш u
X ш
и
