CC BY
286
УДК 517.1:544.77
Е. В. Свирщевская, канд. биол. наук, Р. С. Гриневич, аспирант, П. Д. Решетов, канд. хим. наук, В. П. Зубов, д-р хим. наук,
Институт биоорганической химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва А. А. Зубарева, аспирант,
A. В. Ильина, канд. хим. наук,
B. П. Варламов, д-р хим. наук, Центр «Биоинженерия» РАН, Москва
Наноносители лекарств на основе хитозана
Ключевые слова: наночастицы, сукциноил-хитозан, гидрофобно-модифицированный хитозан, доксорубицин, биодеградация.
Key words: nanoparticles, succinoyl-chitosan, hydrophobically modified chitosan, doxorubicin, biodegradation.
Разработка систем доставки лекарств является одним из наиболее быстро развивающихся направлений прикладной биотехнологии. Упаковка лекарств в системы доставки имеет ряд существенных преимуществ: увеличение времени циркуляции в крови, возможность направленной доставки, снижение токсичности для элементов крови и клеток, фильтрующих кровь органов, повышение локальной концентрации в целевых клетках, возможность получения многокомпонентных препаратов, доставляемых в одни и те же клетки. В данной работе проведены исследования по разработке носителя на основе двух производных хитозана для противоопухолевого антибиотика доксорубицина. Приведены данные по структуре частиц, биодеградации хитозана и свойствам связываться с клетками in vitro, а также результаты экспериментов in vivo по биосовместимости и противоопухолевой активности.
Введение
Разработка систем доставки лекарств на основе наночастиц биополимеров является одним из интенсивно развивающихся направлений современной биотехнологии. Свойства многих лекарств можно улучшить за счет систем доставки, повышающих время циркуляции лекарства в крови, увеличивающих специфичность доставки в целевой орган, экранирующих препарат от ферментных систем крови и органов, снижающих общую токсичность препаратов и уменьшающих нежелательные эффекты, связанные с неспецифическим действием
метаболитов препарата. Область применения систем доставки очень широка, начиная от доставки терапевтических лекарств (противоопухолевых, противоинфекционных), вакцинирующих агентов (пептидов, белков), модулирующих функцию клеток (РНК, ДНК), стимуляторов (иммуномодуляторов, гормонов, ферментов) и до косметических применений (гели, пенки и кремы с гиалуроновой кислотой, коллагеном, белками кожи) [1—3]. Для доксорубици-на разработано несколько систем доставки на основе различных биополимеров (табл. 1) [4].
Большинство систем доставки основаны на использовании биополимеров небелковой природы (липиды, полисахариды), поскольку на белки реагирует иммунная система продукцией антител и активацией клеток иммунной системы с высвобождением растворимых факторов (цитокинов и моно-кинов). Липиды и полисахариды не распознаются иммунной системой и могут использоваться для экранирования активно распознаваемых иммунной системой молекул, а также лекарств (противоопухолевых, противотуберкулезных, иммунодепрес-сантов и др.). Системы доставки могут быть также использованы для пролонгирования времени циркуляции жизненно важных белков, например инсулина, гормонов щитовидной железы, гормонов роста и пр., при заболеваниях, требующих замещающей терапии [5—7]. Для введения в клинику таких систем доставки требуется понимание поведения самой системы в организме, а также системы с включенными в нее активными субстанциями. В последние годы достигнут значительный прогресс в этом направлении. Необходимым требованием к таким системам доставки является их размер в диапазоне от 50 до 700 нм, что определяется свободной циркуляцией таких объектов в крови. При
14
Бионанотехнологии и нанобиоматериаловедение
Таблица 1
Наноразмерные препараты доксорубицина клинического применения по материалам Zhang et al. [4]
Лекарственный препарат
Статус
Медицинское применение
Гибридные полимерлипидные наночастицы
Наночастицы на основе альбумина
Аэрозоль-альгинат наночастицы
Наночастицы гликоль-хитозана
Мицеллы из ПЭГ-доксорубицина
Сополимер ГПМА*-доксорубицин
Сополимер ГПМА-доксорубицингалактоза-мин
Декстрандоксорубицин
Плюроник блок сополимер
Поли (изо-гексил-цианоакрилат) доксоруби-цин
Липосомальный доксорубицин
Пэгилированный липосомальный доксоруби-цин
Доклинические испытания
То же »
»
Фаза 1 Фаза 2 Фаза 2
Фаза 1 Фаза 2 Фаза 1/ 2
Одобрен
Одобрен
Солидные опухоли
Различные опухоли
Рак молочной железы
Солидные опухоли
Рак поджелудочной железы
Опухоли легкого и молочной железы
Рак печени
Различные опухоли Рак желудка Рак печени
Метастазирующий рак молочной железы и яичников
Опухоли яичников и молочной железы
Гидроксипропилметакриламид.
увеличении размера до 1—2 мкм частицы могут вызывать эмболию мелких капилляров, что является нежелательным. При размере менее 50 нм частицы быстро выводятся из организма. Стандартизация систем доставки начинается с получения так называемых «функционализируемых» наночастиц. Под функционализацией понимается наличие ре-акционноспособных химических групп на молекуле носителя, которые используются для присоедине-
ния различных молекул, обеспечивающих целевую доставку (пептидов, антител), удлинение времени циркуляции в крови (полиэтиленгликоль) и собственно терапевтического агента (лекарства, белков, пептидов, ДНК, РНК и др.).
Хитозан является природным биодеградиру-емым полимером, получаемым из хитина, источники которого в живой природе очень разнообразны (ракообразные, насекомые, клеточные стенки гри-
Таблица 2
Использование наночастиц хитозана и его производных для создания систем доставки противоопухолевых препаратов
Производное Лекарство Емкость, % Процент сорбции Размер частиц, нм Дзета-потенциал Ссылка
6-О-холестерол-хитозан, линолено-вая кислота-карбоксиметил хитозан Третиноин 8 28 - 100-240 +25 [11-12]
Олигомер гликоль-хитозана; гликоль-хитозан; гликоль-хито-зан-5Р-холановая кислота Паклитаксел Доксорубицин Цисплатин Кампотецин 24 39 11 9 57-96 200-450 - [13-17]
Олеоил-хитозан Доксорубицин - 53 315 - [18]
Циклодекстрин-хитозан; глицидол-хитозан-деоксихолиевая кислота Доксорубицин 4 70 250 -35 [19]
Карбоксиметил-хитозан деоксихо-лиевая кислота Доксорубицин 33 50-78 90-220 -0 to 1 от to 22 ]]
N-сукциноил-хитозан Митомицин С 12 - - - [22]
Хитозан Диосгенин - - - - [23]
Галактозилированный хитозан Доксорубицин 25 - 90-120 +35 [24]
N-сукциноил хитозан Доксорубицин 10 40 200-250 -25 [8]
Хитозан + полиглутаминовая кислота Доксорубицин - 96 80 -30 [25]
бов и др.). В отличие от ряда используемых биополимеров (полимолочной кислоты, полиэтиленгли-коля и др.), имеющих 1—2 реакционноспособные группы на молекулу полимера, хитозан имеет ре-акционноспособную группу (гидроксильную и/или аминогруппу) в каждом звене, что позволяет химическое присоединение нескольких молекул, необходимых для функционализации частиц. В силу структуры хитозана возможно получение его производных с различным зарядом и гидрофобностью. В табл. 2 приведены данные по разработке носителей на основе хитозана и его производных для доставки противоопухолевых средств. В данной работе изложены результаты изучения структуры частиц, полученных из сукциноил-хитозана и гидро-фобно-модифицированного сукциноил-хитозана. Кроме того, приводятся данные по биодеградации хитозана и его свойствам связываться с клетками in vitro, а также результаты экспериментов in vivo по биосовместимости и противоопухолевой активности.
Материалы и методы
Материалы. В работе использовали коммерческий сукциноил-хитозан (СХ) со степенью замещения 80 %, полученный из хитозана с молекулярной массой 340 кДа (ЗАО «Биопрогресс», Щелково, Московская обл.). Образец был предварительно очищен переосаждением из 2%-ного раствора NaOH путем подкисления до pH = 6,6 30%-ным раствором уксусной кислоты. Также в работе использовали низкомолекулярный сукциноил-хитозан, полученный реакцией ацилирования янтарным ангидридом из коммерческого низкомолекулярного хитоза-на (Sigma) с молекулярной массой (ММ) 40 кДа. Степень замещения по сукциноильному остатку в ацилированном образце составила 100 %, что определяли методом 1H ЯМР спектроскопии. Док-сорубицин использовали аптечный (Veropharm), поставляемый в смеси с маннитом (20/80 весовых %).
Получение наночастиц сукциноил-хитозана (СХНЧ) с доксорубицином (ДОКС). Наночастицы из СХ с ММ 340 кДа получали методом солевого осаждения, как описано ранее [8]. Для формирования комплексов с ДОКС к 0,5 мл дисперсии наночастиц в деионизованной воде (400 мкг/мл) постепенно добавляли 80 мкл раствора комплекса, полученного при смешивании 0,1 мг ДОКС в 0,1мл ДМСО с 0,1 мг бычьего сывороточного альбумина в 0,1 мл Nа-фос-фатного буфера (0,1М, рН = 7,2). Суммарный объем смеси был доведен до 1 мл бидистиллированной водой. Результирующая концентрация наночастиц в смеси составила 200 мкг/мл, ДОКС — 40 мкг/мл. Сорбирование ДОКС на наночастицы осуществляли при перемешивании (30 об/мин, 22 °C) в течение часа. Частицы с сорбированным ДОКС центрифу-
гировали 20 мин, 14 000 g, далее ресуспендировали в 1%-ном водном растворе полиэтиленгликоля 2000 (Fluka). Количество сорбированного ДОКС определяли спектрофотометрически при длине волны 484 нм. Эффективная сорбция частиц составила 40 %, что соответствует 16 мкг на 1 мл смеси. Таким образом, емкость наночастиц по доксоруби-цину составляет 80 мкг на 1 мг наночастиц.
Получение наночастиц гидрофобно-модифициро-ванного сукциноил-хитозана (ГСХНЧ), конъюгиро-ванного с ДОКС. Гидрофобно-модифицированный хитозан получали из ранее полученного низкомолекулярного СХ с помощью реакции ацилиро-вания декановой кислотой (в виде N-оксисукцини-мидного эфира). ДОКС конъюгировали с помощью 1-этил-3(3-диметиламино-пропил)карбодиимида. При использовании избытка сшивающего агента получали частицы. Полученный продукт очищали методом диализа. Доля ДОКС составила 40 %.
Определение размера частиц методом динамического светорассеяния (ДС). Для определения размера наночастиц ГХ и СХ использовали метод ДС. Эксперименты проводили на приборе фирмы 90 Plus Partical Size Analyzer Brookhaven instruments corporation (США).
Связывание наночастиц с клетками. Клетки К562, RAW, MDCK, HEK293T культивировали в среде RPMI-1640 с фетальной бычьей сывороткой 8 %, L-глютамином, 300 мкг/мл, ампицилином/стреп-томицином (50 мкг/мл), 2-меркаптоэтанолом (5 х 10Е-5М) в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С. Для оценки связывания наночастиц с клетками в культуры вносили 10 мкл суспензии нано-частиц (400 мкг/мл) и инкубировали в течение 2 ч при температуре 37 °С. Прохождение ДОКС в ядро анализировали с помощью конфокального микроскопа Nikon TE 2000 Eclipse (Япония). Связывание оценивали с помощью анализа флюоресценции надосадочной жидкости на спектрофлюориметре (GloMax, Germany). Экстракцию ДОКС из клеток проводили кислым этанолом, как описано ранее [9].
Эффективность доставки ДОКС частицами in vitro. Оценку цитотоксического эффекта ДОКС проводили с помощью стандартного теста с 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетра-золием бромидом (MTT, Sigma), как описано в статье [10]. Клетки инкубировали в течение 72 ч в полной культуральной среде в плоскодонных 96-лу-ночных планшетах (Costar, США) c различными образцами, используя серии разведений ДОКС и частиц с ДОКС; контрольные клетки инкубировали в среде. За 6 ч до конца инкубации прибавляли в каждую лунку МТТ (250 мкг/мл). Оптическую плотность регистрировали на спектрофотометре Titertek (Великобритания) при 540 нм. Результаты анализировали с помощью пакета программ Excel (Microsoft). Ингибирование пролиферации представлено в виде графика концентрационной зависимости индекса ингибирования.
Эффективность доставки ДОКС частицами in vivo. В эксперименте использовали трехмесячных мышей линии C57BL/6, полученных из Центрального питомника (Московская обл.). Опухоль молочной железы мышей прививали в 100 мкл физиологического раствора по 1 млн клеток Wnt-1 на мышь. ДОКС или частицы с ДОКС вводили внутривенно по 15 мкг/мышь в пересчете на ДОКС с момента, когда опухоли достигали размера 5 х 5 мм. Инъекции проводили два раза в неделю в течение двух недель. Анализ роста опухоли оценивали по размеру опухоли.
Результаты
Характеристика наночастиц с хитозаном. Нами было получено два типа частиц на основе сукцино-ил-хитозана (СХНЧ) и гидрофобно-модифицирован-ного сукциноил-хитозана (ГСХНЧ). В случае СХНЧ использовали пассивную сорбцию положительно заряженного ДОКС на отрицательно заряженные частицы сукциноил-хитозана (рис. 1). Эффективная сорбция ДОКС СХНЧ составила 40 мкг/мг частиц. В случае ГСХНЧ использовали ковалент-ную пришивку ДОКС, что позволило увеличить количество ДОКС до 200 мкг/мл частиц. Блок-схема получения ГСХНЧ приведена на рис. 2. Оба типа частиц представляли собой опалесцирующую суспензию, стабильную при хранении в течение 10 дней. Частицы были гетерогенны по размеру
а)
1%-ный раствор СаСЦ
Наночастицы
сукциноил-хито-
зана
Раствор сукци-ноил-хитозана
б)
a)
Интенсивное перемешивание
Рис. 1
б)
Декановая кислота I CH3OH H2O
Схема получения (а) и гипотетическая структура (б) частиц СХ-ДОКС (ВСА — бычий сывороточный альбумин; ДОКС — доксорубицин): О — ион Са2+; © — СООН-группа; • — ДОКС
Рис. 2 Блок-схема получения (а) и гипотетическая структура (б) частиц ГСХ-ДОКС (КДИ-сшивающий агент карбодиимид):
0 — СООН-группа; Л/WV — CgHlg; • — ДОКС
(рис. 3, а). Размер отдельной частицы, определенный методом светорассеяния, составил около 100 нм (рис. 3, б). Основной мишенью доксорубицина является ядро, где антибиотик связывается с ДНК, нарушая репликацию. Для визуализации прохождения ДОКС в ядра клеток использовали конфокальную микроскопию. Как свободный ДОКС, так и ДОКС в составе частиц СХНЧ-ДОКС через 2 ч инкубации с клетками находился преимущественно в ядре (рис. 3, в, г). Таким образом, сукцино-ил-хитозан не препятствует прохождению ДОКС в ядра клеток.
Биодеградация хитозана. Для анализа биодеградации использовали экстракцию ДОКС из клеток кислым этанолом. Комплекс ДОКС с СХНЧ в этих условиях разрушается и ДОКС высвобождается. Поэтому для данных экспериментов использовали ГСХ-ДОКС, который получен химической пришивкой ДОКС к носителю.
Клетки трех разных линий инкубировали со свободным ДОКС или конъюгатом ГСХ-ДОКС в течение 15 мин, 14 и 20 ч. Уже за 15 мин наблюдалось практически максимально возможное связывание (рис. 4), достигавшее, в зависимости от типа клеток, 60-80 % для ДОКС и 55-70 % для ГСХ-ДОКС.
Для определения биодеградации хитозана в клетках провели экстракцию ДОКС из лизата клеток кислым этанолом. Свободный ДОКС, в зависимости от типа клеток, элюируется на уровне от 20 до 100 % от включенного в клетки (рис. 5, а). В этих условиях исходный конъюгат ДОКС с хитозаном, в отличие от комплекса, не разрушается и после центрифугирования выпадает в осадок (см.
Рис. 3
Структура и функция частиц с ДОКС: а — визуализация частиц ГХ-ДОКС методом конфокальной микроскопии. Белому цвету соответствует флуоресценция ДОКС в красном диапазоне ~кэмиссии = 590 нм (частицы наносили на предметное стекло); увеличение Х5000; б — анализ размера частиц методом светорассеяния; размер ГЧНЧ около 100 нм; в, г — прохождение ДОКС (в) и ГХ-ДОКС (г) в ядра клеток К562 (конфокальное изображение); увеличение Х1000
рис. 3, б, контроль). Хитозан под действием внутриклеточных протеаз высвобождает ДОКС, что позволяет элюировать его из лизата клеток (рис. 5, б). Элюция ДОКС из клеток, инкубированных с ко-нъюгированными частицами ГСХ-ДОКС, также за-
висела от типа клеток и составляла от 20 до 100 % (рис. 5, б). Зависимость от типа клеток для культур со свободным ДОКС и с частицами ГСХ-ДОКС была аналогичной: максимальной для клеток НЕК293Т, минимальной — для клеток МБСК.
Время, ч
Рис. 4
Связывание ДОКС (а) и ГСХ-ДОКС (б) с клетками RAW (•), MDCK (+) и HEK293T (А). Клетки инкубировали разное время с препаратами, затем измеряли остаточную флюоресценцию в надосадочной жидкости и рассчитывали долю связанного ДОКС по титровочной кривой
Бионанотехнологии и нанобиоматериаловедение
а)
100 -
80 -
60
a »
2
ч
m 40
20
б)
10
Время, ч
15
20
100
80
я, 60
а »
2
05 40
20
05
10 15
Время, ч
20
0
5
Рис. 5
Деградация хитозана внутри клеток RAW, MDCK и HEK293T. Клетки инкубировали с ДОКС (а) или частицами ГСХ-ДОКС (б) в течение разного времени, после чего оценивали долю элюированного ДОКС с использованием стандарта ДОКС в этаноле: • — RAW; ♦ — MDCK; А — HEK 293Т; □ — контроль
Оценка функциональной активности ДОКС в составе хитозановых носителей in vivo в модели рака молочных желез у мышей. Связывание частиц с клетками и гидролиз хитозана в клетках не означает, что ДОКС сохраняет свою функциональную активность. Проведенные эксперименты по локализации ДОКС в ядрах клетках позволяют предположить, что ДОКС активен. Однако требовалось прямое подтверждение функциональной активности ДОКС. Для этого провели эксперименты in vitro и in vivo. Для анализа активности in vitro использовали МТТ-метод. При титровании частиц использовали сравнимые концентрации ДОКС. Все препараты оказывали сравнимый эффект в подавлении пролиферации клеток (рис. 6, а), что показывает сохранность функ-
циональной активности ДОКС в составе как комплексов с наночастицами СХ-ДОКС, так и в форме конъюгированного с хитозаном ДОКС — ГСХ-ДОКС.
Последняя серия экспериментов была посвящена изучению возможности внутривенного введения наночастиц хитозана, нагруженных ДОКС, а также анализу влияния препаратов на рост опухоли молочной железы у мышей. Введение частиц в объеме 200 мкл на мышь не вызывало эмболии сосудов и гибели мышей, что показывает возможность использования наночастиц хитозана для внутривенного введения. Все препараты достоверно подавляли рост опухоли (рис. 6, б). Достоверных отличий по действию ДОКС в составе наночастиц от действия свободного препарата не было.
а)
б)
4000
1,0
0,8
д н
йч
0,6
0,4
0,2
0,01
<> — ДОКС • — СХНЧ
— СХ-ДОКС
— ГСХНЧ
— ГСХ-ДОКС
0,10
Концентрация, мкг/мл
— Контроль
— ДОКС
— ГСХ-ДОКС
— СХ-ДОКС
и
л о
ух2000
п
ю
б О
Время, дни
Рис. 6
Анализ функциональной активности ДОКС и наночастиц СХ-ДОКС и ГСХ-ДОКС на клетках in vitro (а) и по действию на рост опухоли молочной железы мышей Wnt-1 in vivo (б): а — клетки НЕК293Т инкубировали в течение 72 ч с различными количествами свободного ДОКС или наночастиц хитозана с ДОКС; наночастицы вносили в количестве, эквивалентном по ДОКС; на последние 4 ч добавляли МТТ и подсчитывали индекс подавления пролиферации; б — мышам перевивали опухоль молочной железы. Частицы или свободный ДОКС начинали вводить в/в на 40-й день роста опухоли в дозе 17 мкг/мышь/инъекцию раз в 3 дня
0
Обсуждение
Нами было получено два типа частиц на основе отрицательно заряженных производных хитозана. Размер таких частиц составил около 100 нм. Далее в полученные наночастицы был загружен противоопухолевый препарат доксорубицин. В первом случае мы использовали нековалентный комплекс на-ночастиц сукциноил-хитозана с доксорубицином. Использование комплекса имеет то преимущество, что при его получении не используются запрещенные в медицине сшивающие агенты типа глута-рового альдегида или карбодиимида. Однако емкость таких частиц по ДОКС составила 80 мкг/мг частиц, что недостаточно для использования ДОКС для внутривенного введения из-за большого объема вводимого материала. Для человека в случае монотерапии рекомендуемая доза доксорубицина составляет 60—75 мг/м2 поверхности тела при введении путем внутривенных инъекций один раз в три недели. Также доксорубицин можно вводить внутривенно в дозе 20 мг/м2 три дня подряд с повторением курсов через три недели. С учетом площади поверхности кожи взрослого человека (1,5—2,3 м2) минимальная разовая доза составляет 30—46 мг, что эквивалентно 750—1100 мл частиц СХ-ДОКС. Для увеличения нагрузки на частицы мы использовали конъюгат ДОКС с хитозаном (ГСХ-ДОКС). В этом случае емкость увеличивается в 2,4 раза, что позволяет использовать для инфузии 300—460 мл частиц. Полученные частицы не меняли функциональной активности ДОКС, что связано с быстрой биодеградацией хитозана внутриклеточными ферментами.
Эксперименты in vivo показали, что само по себе включение ДОКС в полимерные частицы не увеличивает активности антибиотика. Большим достижением является сохранение 100%-ной активности исходного препарата при его включении в носитель. Увеличения активности можно достичь за счет направленной доставки ДОКС к клеткам опухоли, чего можно добиться с помощью присоединения к частицам нацеливающего агента (например, антител к опухолевым маркерам). Вторым путем увеличения активности может быть включение двух препаратов с разным механизмом действия в состав одной наночастицы. Эти исследования будут проведены в дальнейшем.
Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», ГК № 16.512.11.2069, П730; РФФИ 09-04-00895 и FP7 NMP.2010.4.0-1.
I Литература I
1. Singh R., Nalwa H. S. Medical applications of nanoparticles in biological imaging, cell labeling, antimicrobial agents and anticancer nanodrugs // J. Biomed Nanotechnol. 2011. Vol. 7. N 44. P. 489-503.
2. Singha K., Namgung R., Kim W. J. Polymers in small-interfering RNA delivery // Nucleic Acid Ther. 2011. Vol. 21. N 3. P. 133-147.
3. Dinarvand R., Sepehri N., Manoochehri S. et al. Polylactide-co-glycolide nanoparticles for controlled delivery of anticancer agents // Int. J. Nanomedicine. 2011. N 6. P. 877-895.
4. Zhang L., Gu F. X., Chan J. M. et al. Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments // Clin Pharmacol Ther. 2008. Vol. 83. N 5. P. 761-769.
5. Petkar K. C., Chavhan S. S., Agatonovik-Kustrin S., Sa-want K. K. Nanostructured materials in drug and gene delivery: a review of the state of the art // Crit Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 2011. Vol. 28. N 2. P. 101-164.
6. Amsden B. G. Delivery approaches for angiogenic growth factors in the treatment of ischemic conditions // Expert Opin Drug Deliv. 2011. Vol. 8. N 7. P. 873-890.
7. Chan H. K. Nanodrug particles and nanoformulations for drug delivery // Adv Drug Deliv Rev. 2011. Vol. 63. N 6. P. 405.
8. Ильина А. В., Зубарева А. А., Курек Д. В. и др. Наночастицы на основе сукцинилированного хитозана с док-сорубицином: Формирование и свойства // Российские нанотехнологии. 2012. № 1-2. С. 46-51.
9. Gabizon A., Shiota R., Papahadjopoulos D. Pharmacokinetics and tissue distribution of doxorubicin encapsulated in stable liposomes with long circulation times // J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda). 1989. Vol. 81. P. 1484-1488.
10. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays // J Immunol Methods. 1983. Vol. 65. P. 55-63.
11. Chena M., Liua Y., Yanga W. et al. Preparation and characterization of self-assembled nanoparticles of 6-O-cholesterol-modified chitosan for drug delivery // Carbohydrate Polymers. 2011. Vol. 84. P. 1244-1251.
12. Tan Y. L., Liu C. G. Self-aggregated nanoparticles from linoleic acid modified carboxymethyl chitosan: Synthesis, characterization and application in vitro // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2009. Vol. 69. P. 178-182.
13. Saravanakumar G. , Min K. H., Min D. S. et al. Hydrotropic oligomer-conjugated glycol chitosan as a carrier of pacli-taxel: Synthesis, characterization, and in vivo biodistribution // Journal of Controlled Release. 2009. Vol. 140. (3). P. 210-217.
14. Parka J. H., Kwona S., Lee M. et al. Self-assembled nanopar-ticles based on glycol chitosan bearing hydrophobic moieties as carriers for doxorubicin: in vivo biodistribution and antitumor activity // Biomaterials. 2006. № 27. P. 119-126.
15. Kim J. H, Kim Y. S, Park K. et al. Antitumor efficacy of cisplatin-loaded glycol chitosan nanoparticles in tumor-bearing mice // Journal of Controlled Release. 2008. Vol. 127. P. 41-49.
16. Son Y. J., Jang J. S., Cho Y. W. et al. Biodistribution and anti-tumor efficacy of doxorubicin loaded glycol-chitosan nanoaggregates by EPR effect // Journal of Controlled Release. 2003. Vol. 91. № 1-2. P. 135-145.
17. Min K. H., Park K., Kim Y. S. et al. Hydrophobically modified glycol chitosan nanoparticles encapsulated camptothecin enhance the drug stability and tumor targeting in cancer therapy// Journal of Controlled Release. 2008. Vol. 127. N 3. P. 208-218.
18. Zhang J., Chen X. G., Li Y. Y., Liu C. S. Self-assembled nanoparticles based on hydrophobically modified chitosan as carriers for doxorubicin // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2007. N 3. P. 258-265.
19. Wang J., Zong J. Y., Zhao D. et al. In situ formation of chi-tosan-cyclodextrin nanospheres for drug delivery // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2011. Vol. 87. P. 198-202.
21
Бионанотехнологии и нанобиоматериаловедение
20. Zhou H., Yu W., Guo X. et al. Synthesis and characterization 23. of amphiphilic glycidol chitosan deoxycholic acid nanopar-
ticles as a drug carrier for doxorubicin // Biomacromolecules. 2010. N 11. P. 3480-3486.
21. Jin Y.-H., Hu H.-Y., Qiao M.-X. et al. pH-sensitive chitosan- 24. derived nanoparticles as doxorubicin carriers for effective anti-tumor activity: preparation and in vitro evaluation // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2010, in press.
22. Kato Y., Onishi H., Machida Y. N-succinyl-chitosan as 25. a drug carrier: water-insoluble and water-soluble conjugates // Biomaterials. 2004. N 25. P. 907-915.
Perez J., Szopkob R., Schmidtb C., Peniche Covas C. Novel drug delivery systems: chitosan conjugates covalently attached to steroids with potential anticancer and agrochemical activity // Carbohydrate Polymers. 2011. Vol. 84. P. 858-864. Jin N. K., Jain S. K. Development and in vitro characterization of galactosylated low molecular weight chitosan nanoparticles bearing doxorubicin // AAPS PharmSciTech. 2010. Vol. 11. N 2. P. 686-697.
Manocha B., Margaritis A. Controlled release of doxorubicin from doxorubicin/y-polyglutamic acid ionic complex // Journal of Nanomaterials. 2010. Vol. 1. P. 1-9.
УДК 579.61; 616.93; 616-078; 616-093; 615-07<<75>>
А. Б. Жебрун, д-р мед. наук, Г. Я. Ценева, д-р мед. наук, Г. Н. Хамдулаева, науч. сотр., Л. А. Краева, канд. мед. наук,
Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Т. М. Зимина, канд. физ.-мат. наук,
Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «ЛЭТИ»
Бактериологическая безопасность при дифтерии: от классических методов к современным миниатюрным устройствам специального микробиологического контроля
Ключевые слова: дифтерийный токсин, биологические чипы. Key words: diphtheritic toxin, biological chips.
Разработан высокочувствительный и высокоспецифичный способ обнаружения дифтерийного токсина с целью мониторинга токсигенных штаммов C. diphtheriae среди больных дифтерией и бактерионосителей. Способ позволяет обнаружить дифтерийный токсин в количестве 0,001 Lf/ml дифтерийного токсина в пробе за 2—3 мин и может быть использован в лабораториях различных уровней организации как при единичных, так и при массовых обследованиях.
Введение
Актуальность биологической опасности в настоящее время возрастает. Она исходит из существования в природе очагов особо опасных инфекций
с резервуарами в животном мире, наличия больных и бактерионосителей опасных возбудителей, обуславливающих высокий уровень заболеваемости в странах с высоким уровнем развития до 45 %, в развивающихся странах с высоким уровнем миграции и перемещения населения — до 75 %.
Важной проблемой следует признать эволюцию микроорганизмов, нередко ведущую к изменению степени патогенности микроорганизмов и приобретению патогенных свойств среди ранее непатогенных видов. Нельзя исключать возможность биотерроризма с использованием новых форм биологической угрозы, т. е. микроорганизмов с измененными биологическими свойствами.
Все сказанное диктует острую необходимость создания современных методов и систем обнаружения и распознавания биологических объектов, вирусов, бактерий, грибов и их токсинов. Класси-
