CC BY
63
УДК 547. 962. 9:597. 6/9
І. П Михайлова, І. В Бєлочкіна, Л. М Тининика, Б. П Сандомирський
ВИВЧЕННЯ ДЕЯКИХ ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ КОЛАГЕНУ, ВИДІЛЕНОГО ЗІ ШКІРИ R. RIDIBUNDA
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (м. Харків)
Робота виконана у рамках науково-дослідної роботи 2. 2. 6. 27 «Отримання водно-сольових екстрактів із тканин Rana ridibunda і вивчення можливостей їх використання у середовищах для кріоконсервування клітин», № держ. реєстрації 0106U002168
Вступ. Природний біополімер колаген, перспективний для використання в медичній промисловості поєднує позитивні риси синтетичних і тканинних трансплантатів, такі як біосумісність з тканинами і органами, здатність до резорбції і утилізації організмом, і позбавлений при цьому ряду їх негативних сторін. Достоїнствами колагену як пластичного матеріалу є відсутність токсичних і канцерогенних властивостей, слабка антигенність, висока механічна міцність і стійкість до тканинних ферментів, регульована швидкість лізису в організмі, здатність утворювати комплекси з біологічно активними речовинами (гепарином, антибіотиками. хондроітінсульфатом і ін. ), стимуляція регенерації власних тканин організму. В цьому відношенні препарати з колагену мають переваги перед препаратами з інших біополі-мерів, зокрема з фібрину або желатину, що є денатурованим колагеном [5, 10].
Колаген гідробіонтів, зокрема амфібій, є предметом вивчення багатьох досліджень [1, 4, 16]. Припускають, що одночасний зв'язок з водою і сушею дозволив амфібіям розвинути певні фізіологічні спеціалізації. Встановлено переваги застосування колагену з шкіри жаби, як субстрата для культивування клітин, зокрема, фібробластів і кератіноцитів. Переваги ці пов'язані з надзвичайно високою гідрофільністю колагену шкіри жаби і легким формуванням колагенового гелю після регідратації [14].
Метою дослідження було виділення колагену зі шкіри жаби Rana ridibunda і вивчення його фізико-хімічних характеристик: характеристичної в’язкості і теплофізичних параметрів термоденатурації.
Об’єкт і методи дослідження. Об'єктом дослідження були розчини колагену зі шкіри жаби Rana ridibunda. Амфібії привозили з Нововодолазького водосховища (30 зразків).
Колаген зі шкіри жаби виділяли за методом [11], який включає подрібнення сировини, екстракцію колагену оцтовою кислотою з додаванням пепсину і соляної кислоти, очищення колагену шляхом інактивації і видалення пепсину з подальшим отриманням кінцевого сухого продукту.
В'язкість розбавлених розчинів колагену зі шкіри жаби визначали за допомогою капілярного віскозиметра Убеллоїде при 20°С. Для розрахунку характеристичної в'язкості виконували вимірювання при декількох концентраціях розчину і одержані дані графічно екстраполювали на нульову концентрацію [9].
Теплофізичні параметри термоденатурації молекул колагену зі шкіри жаби визначали методом диференциальної скануючої калориметрії (ДСК) [8, 15] на мікрокалориметрі третього покоління ДАСМ-4, призначеному для високочутливого теплового аналізу рідини в інтервалі температур від 0, 5 до 130С. Прилад дає можливість реєструвати теплові ефекти розтягнутих по температурі процесів внутрішньомолекулярних перетворень біологічних речовин, що знаходяться в розчині з низькою початковою концентрацією (0, 1%), а також їх парціальну теплоємність, як функцію від температури. Калориметричну ентальпію денатурації розраховували з ДСК-термограмм, реєструючих зміни надмірної теплоємності білка в розчині при скануванні температури.
Розчини колагену зі шкіри жаби досліджували методом електрофорезу в поліакри-ламідному гелі (ПААГ) з додаванням 1% до-децилсульфата натрію [6]. Після відмивання гелі сканували на сканері «Epson perfection 1260». Для визначення молекулярної маси білків використовували маркери LMWC «Pharmacia», Швеція.
Результати досліджень та їх обговорення. Макромолекули колагену при фізіологічній температурі, рН і іонній силі агрегують у волокнини з нативною структурою (фібрілоут-ворення). При нагріванні вище 37°С трьохспі-ральні структури колагену розпадаються на окремі ланцюги з конформацією глобулярного клубка. Відомо, що температура денатурації колагену в розчині становить 38°С [7].
В даний час відомо і широко застосовуються розроблені в 60-і роки способи підготовки і розчинення тканин, що містять колаген: ферментативний і лужний. При дії ферментів на нерозчинний колаген відбувається руйнування телопептидів фрагментів, які забезпечують їх впорядковану агрегацію і міцне міжмолекулярне скріплення у фібрілах і волокнах і він стає розчинним в розчинах органічних кислот. Широко застосовується і діє найбільш ефективно для розчинення колагену пепсин. Розчини ферменторозчинного колагену (ФРК) за своїми фізико-хімічними властивостями близькі до розчинів тропоко-лагену (ТК). Видалення телопептидів дещо уповільнює процес самоскладення у фізіологічних умовах, але структура волокон ідентична структурі нативного колагену. Особливо важливим є те, що видалення телопептидів практично повністю усуває антигенну активність колагену [2, 3]. Саме ферментативний спосіб був використаний нами для виділення колагену зі шкіри жаби Rana ridibunda.
Основна відмінність лугорозчинного колагену (ЛРК) від ФРК обумовлена неспецифічною дією лугу, що окрім розщеплювання телопептидів призводить до руйнування інших, перш за все амідних груп бокових ланцюгів. Розчини ЛРК не здатні до утворення фібрілярних гелів з нативною структурою у фізіологічних умовах рН, температури, іонної сили.
Порівняння фізико-хімічних властивостей і молекулярних параметрів солюбілізова-ного колагену з існуючими даними для розчинних фракцій дозволяє вирішити питання про збереження або руйнування в процесі попередньої обробки характерної для ТК конформації потрійної спіралі, а також здібності молекул розчиненого колагену реконструювати фібрілярні структури. Вивчення процесу зворотної реконструкції волоконного колагену з розчинів, окрім з'ясування питань молекулярної будови, тісно пов'язане з різними аспектами виготовлення різноманітних матеріалів на основі колагену.
Ступінь нативності віділеного колагену визначають за різноманітними структурними та фізико-хімічними показниками: характеристичною в'язкістю, теплофізичних параметрів термоденатурації, константою дифузії і седіментації, питомого оптичного обертання, спектру кругового діхроїзма і т. д, які змінюються в процесі денатурації розчинів колагену [8, 12, 13, 15].
Показники характеристичної в'язкості [П] колагенів визначалася неодноразово [4, 7, 12]. Величини характеристичної в'язкості оцтовокислих розчинів з рН 2, 9—3, 2 знаходяться в межах 12—25 дл/л. Характеристич-
на в'язкість колагену шкіри теляти при рН 3, 0 і іонній силі 0, 25 по МаСІ коливається близько 12 дл/л. Для ферментнорозчиненого колагену (ФРК) дорослих тварин [р] коливалася в межах 16—30 дл/л. При зміні рН розчинів ФРК від 2, 8 до 12, 0 (за винятком ізо-електричної області осадження колагену) [р] змінювалася в межах 11—24 дл/л, показуючи найбільші значення при рН біля ізоелек-тричної області.
В наших дослідженнях в'язкості розчинів колагену зі шкіри жаби Б,. :^іЬи^а було встановлено показники характеристичної в'язкості [п] на рівні 14 дл/л (рис. 1), які свідчать про досить високий рівень нативності виділеного колагену. Для нативних розчинів колагену, щодо показників [р] спостерігається варіація в широких межах (11—30 дл/л). Це пов'язано з методикою виділення колагену, умовами очищення і вимірювання і з існуванням, так званого, полімерного колагену. Значення [р] рівня 10 дл/л і вище свідчать про наявність в розчинах асиметричних, стержневидних макромолекул, подібних молекулам ТК [3].
5-------------------------------------------
0 ------------1----------1-----------1------
0,03 0,06 0,08 0,12
с.%
Рис. 1. Змінення приведенної в’язкості (п уд/с) в залежності від концентрації колагену шкіри жаби в розбавлених розчинах. Характеристична в'язкість [п] = 14.
Ці значення [п] на два порядки вище за в'язкість денатурованого колагену або желатину, для яких [п] знаходиться в межах 0, 23-0, 83 дл/л. Варіації у величинах [п] розчиненого колагену підтверджують присутність в одержаних розчинах агрегатів полімерного колагену. Очевидно, що ферменти або луг руйнують не всі міжмолекулярні зв'язки, частина з них залишається і є причиною існування полімерного колагену. Цікаво, що якнайменші величини [п] були одержані для колагену шкіри теляти, найбільші - для колагену шкіри дорослих тварин. Це пояснюється тим, що в тканинах молодих тварин
менше ковалентних зв язків, ніж в тканинах дорослих тварин. Тому за однакових умов обробки швидше розчиняється колаген шкіри теляти і розчин містить більше мономірних молекул, ніж колаген шкіри дорослих тварин, для повної солюбілізації якого необхідна інтенсивніша обробка.
Відомо, що при електрофорезі в ПААГ (у присутності додецилсульфата натрію після денатурації при 37 С) ферментно-і лугороз-чинний колаген розпадається на 4—5 компонентів. Нативний розчинний колаген розщеплюється в цих умовах на п'ять фракцій, з яких дві найшвидші, розташовані поряд. П'ять смуг при електрофорезі розчинного колагену були ідентифіковані. Вони відповідають аі-, а2-, р- і у-компонентам.
Може бути дві смуги ^-компонентів: |3И-являє собою агрегат двох а^ланцюгів, в12-агрегат аі- і а2- ланцюгів. Частинки з внутрішньо- і міжмолекулярними зшивками з молекулярною масою близько 300 000 рухаються однією смугою і відповідають у- компонентам. Невелика розташована поряд зі стартом смуга свідчить про присутність ви-сокомолекулярної фракції з молекулярною масою більше 300 000, що є «полімерною» молекулою [2, 6].
20 мкл 15 мкл маркери
'У /^12 і
Сі2 %
*10)
80 кДа
40 кДА
виділити смуги, відповідні а-, Р~, у- компонентам і високомолекулярній фракції. Після дії ферментів і лугів смуги, відповідні а1- і а2- компонентам є однією широкою смугою, яка є з’єднаною, тоді як смуга ^-компоненту тільки розмита. За результатами наших досліджень, електрофореграми (рис. 2), для розчинів колагену зі шкіри жаби, досить подібні до описаних вище. Чітко означені чотири смуги , що відповідають компонентам
а^ ^, Рі^ в 12 і V.
Теплофізичні параметри термоденатура-ції молекул колагену зі шкіри жаби визначали методом скануючої калориметрії, який дозволяє досліджувати процес переходу спіраль-клубок в біополімерах. Термодинамічні характеристики цього переходу є фундаментальними властивостями біомакромо-лекул [8, 15].
Процес денатурації фібрілярних білків, до яких належить колаген, складається з декількох стадій, кожна з яких відповідає плавленню певного кооперативного блоку в довгій молекулі. Першими починають виплавляти ділянки з нижчою термоста-більностью незалежно від їх просторового розташування. Процес термоденатурациі молекули колагену привертав увагу дослідників [8, 15]. Було знайдено, що термодинамічні характеристики цього процесу залежать від вмісту в молекулі проліну і оксипроліну, які визначають стабільність колагенових молекул у різних видів. Молекула колагену відрізняється низькою термостабільністю і при розпаді може утворювати різні типи спіралей і клубків.
Криві термопоглинання розчину колагену шкіри жаби в наших дослідженнях мають пік термопоглинання при температурі 37°С. Це свідчить про типовий для нативного колагену розпад при цій температурі трьохспі-ральної конформації молекул на окремі пеп-тидні ланцюги (рис. 3).
Рис. 2. Електрофореграма розчину колагену зі шкіри Б,. г1ё1Ъипёа.
Як повідомлено в [10], порівняно з електро-фореграмою нативного розчинного колагену в солюбілізованому колагені можна також
Рис. 3. Криві теплопоглинання розчинів колагена шкіри жаби Б,. гідіЬипда: - типова ДСК- термограма колагена.
Після обробки термограм з порівнянням площі піку плавлення та площі калібрувальної приступки було встановлено значення питомої теплоти денатурації колагена шкіри
жаби, яка дорівнює 61±17 Дж/г. Це значення сходиться зі значеннями q, встановленними для колагену шкіри та сухожилів щурів [8].
Висновки. Колаген, який було виділено зі шкіри жаби Б. пёШипёа, зберігає здатність при регідратації демонструвати характерні для нативних молекул колагену фізико-хімічні показники за результатами електрофорезу і теплофізичних параметрів термоденатурації. Було встановлено показники характеристичної в’язкості колагену зі шкіри жаби Б. пёШипёа
Перспективи подальших досліджень. Подальші дослідження допоможуть розширити розуміння ступені пошкодження молекулярної структури в процесі підготовки колагену до розчинення і процесу зворотної реконструкції волоконного колагену з розчинів, що тісно пов'язане з різними аспектами виготовлення різноманітних матеріалів на основі колагену.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Александров В. Я. Сравнение устойчивости коллагена двух видов лягушек, различающихся по теплолюбиво-сти / Александров В. Я. , Андреева А. П. // Цитология. -1967. - Т. 11, № 10. - С. 1288- 1293.
2. Баташева Е. В. Получение и исследолвание порошков коллагена / Баташева Е. В. , Иванова Л. А. , Истранов Л. П. // Химико-фармацевтический журнал. - М. : Медицина, 1976. - С. 94-98.
3. Истранова Е. В. Фармацевтический анализ препаратов на основе коллагена / Истранова Е. В. , Истранов Л. П., Грищенко С. В. // Фармация. - 1986. - № 1. - С. 22-24.
4. Львов К. М. Вторичная структура коллагена I из кожи холоднокровных животных / Львов К. М. , Бекмурзаев Б. М.,
Андреева А. П. // Биофизика. - 1991. - Т. 36, Вып. 5. - С. 774-777.
5. Носова И. М. К вопросу о механизме действия коллагена на процессы регенерации / Носова И. М. , Писаржевский С. А. , Абоянц Р. К. , Карелин А. А. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1981. - Т. 92, № 8. - С. 79-81.
6. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование / Остерман Л. А. - М. : Наука, 1981. -286 с.
7. Рубин М. А. Механизмы влияния имминокислот на физические характеристики коллагена / Рубин М. А. , Тикто-пуло Е. И. , Намиот В. И. , Туманян В. Г. , Есипова Н. Г. // Биофизика. - 2008. - Вып. 53, № 5. - С. 910-920
8. Солов'йова О. С. Калориметричні дослідження термоденатурації ізольованих і мембранозв'язаних білків у присутності деяких кріопротекторів до і після охолодження до -196°С: автореф. дис. на здобуття ступеня канд. біол. наук. спец. 03. 00. 19 “Кріобіологія” / Солов'йова О. С. - Харків, 1998. 15, [1]с.
9. Тагер А. А. Физикохимия полимеров / Тагер А. А. - М. : Химия, 1978. - С. 370-374.
10. Коллаген и его применение в медицине / [Хилькин А. М., Шехтер А. Б. , Истранов Л. П. , Леменев В. Л]. - М. : Медицина, 1976. - 256 с.
11. Пат. 20381 А, Україна. МПК7 А61К38/00. Спосіб одержання нативного колагену/ патентообладатель: колективне науково-виробниче підприємство «ЕЛЕКОМ», Україна, автори: Володіна Т. Т. , Печенова Т. М. , Шимановська А. К. , Дзвонкевич Н. Д. , Петрунь Л. М. , Чуркін В. О. -N 20381 А, заявл. 26. 07. 95, опубл. 15. 07. 97, Бюл. Про-мисл. власність № 1.
12. Mechanical properties and collagen cross-linking of the patellar tendon in old and young men / Coupp C, Hansen P, Kongsgaard M, Kovanen V, Suetta C, Aagaard P, Kjaer M, Magnusson SP //J Appl Physiol. - 2009. -Vol. 107, N3. -P. 880-886.
13. Han S. Segregation of type I collagen homo- and heterotrimers in fibrils / Han S, McBride D. J, Losert W, Leikin S // J Mol Biol. - 2008. -Vol. 31, N 1. -P. 122-132
14. fajmar K. V. Application of frog (Rana tigerina Daudin) skin collagen as a novel substrate in cell culture / Kumar K. V. , Sai K. P. , Babu M. // J. Biomed. Mater. Res. - 2002. -V. 61, N 2. - P. 197-202.
15. Privalov P. L. Scanning calorimeters for studyng macromolecules/ Privalov P. L. // Pure and Appl. Chem. -1980. -1980. -V. 52, N4, P. 479-497.
16. Sai K. P. Studies on Rana tigerina skin collagen / Sai K. P. , Babu M. // Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. - 2001. - V. 128, N 1. - P. 81-90.
УДК 547. 962. 9:597. 6/9
ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КОЛЛАГЕНА ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ КОЖИ R. RIDIBUNDA
Михайлова И. П. , Белочкина И. В. , Тыныныка Л. Н. , Сандомирский Б. П.
Резюме. Данные исследования показали, что коллаген, выделенный из кожи лягушек R. ridibunda, сохраняет способность при регидратации демонстрировать характерные для нативных молекул коллагена физико-химические показатели по результатами электрофореза и теплофизических параметров термоденатурации. Были установлены показатели характеристической вязкости коллагена, полученного из кожи лягушек R. ridibunda.
Ключевые слова: коллаген, характеристическая вязкость, электрофорез, теплофизические параметры термоденатурации.
UDC 547. 962. 9:597. 6/9
STUDY of SOME PHYSICAL and CHEMICAL PROPERTIES of COLLAGEN ISOLATED from R. RIDIBUNDA SKIN
Mikhaylova I. P. , Belochkina I. V. , Tynynyka L. N. , Sandomirsky B. P.
Summary. This research has showed that when rehydratated collagen isolated from R. ridibunda skin saves ability to demonstrate physical and chemical indices that are typical for the native molecules of collagen by the results of electrophoresis and heat-physical parameters of termodenaturation. The indices of characteristic viscosity of collagen isolated from skin of the frog R. ridibunda have been determined.
Key words: collagen, characteristic viscosity, electrophoresis, heat-physical parameters of termodenaturation.
Стаття надійшла 25. 01. 2010 р. ------------------------------------------ 64 ------------------------------------------
