Изучение молекулярной ультраструктуры биологических мембран лимфоцитов при BLV-инфекции Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

Применение современных компьютерных скрининг-диагностических экспертных технологий на всех этапах лечения открывает возможность осуществлять патогенетически адекватную терапию и проводить своевременную ее корректировку.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Бройтигам В., Кристиан П., Рад М. Психосоматическая медицина / пер. с нем. - М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. - 376 с.

2 Губачев Ю.М., Стабровский Е.М. Клинико-физиологические основы психосоматических соотношений. - Л.: Изд. Медицина, Ленингр. отд., 1981. - 214 с.

3 Ильин Е.П. Дифференциальная психофизиология. - СПб.: Питер, 2001. - 464 с.

4 Кафанов Ю.Н., Мягков В.И., Юрин Д.В. Методические и аппаратные средства современной интегральной медицины: комплекс медицинский экспертный (КМЭ) // [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.kmedex.org/technology_CME.php (дата обращения: 25.11.2014).

5 Мантрова И.Н. Методическое руководство по психофизиологической и психологической диагностике. -Иваново : ООО «Нейрософт», 2007. - 216 с.

6 Новик А.А., Ионова Т.И. Исследование качества жизни в гастроэнтерологии: Руководство по исследованию качества жизни в медицине. - СПб., 2002. - С. 157-168.

7 Психосоматические расстройства в практике терапевт: руководство для врачей / под ред. В.И. Симоненкова. - СПб.: СпецЛит, 2008. - 335 с.

8 Ткаченко Е.И. Питание, эндоэкология человека, здоровье, болезни. Современный взгляд на проблему их взаимосвязей // Тер. Архив. - 2004. - № 2. - С. 67-71.

9 Фролов Б.С., Овечкина И.В. Программно-аппаратный комплекс СMS для оценки психического состояния. -М.: Архангельск, 2002. - 99 с.

Рукопись получена: 23 мая 2016 г. Принята к публикации: 1 июня 2016 г.

УДК577.352: 57.087.1: 612.112: 599.735.51: 578.828.11

ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

ЛИМФОЦИТОВ ПРИ BLV-ИНФЕКЦИИ

© 2016 Д.А. Артемьев1, Б.Б. Костишко2, Е.С. Красникова1, О.В. Столбовская2

1ФГБОУ ВО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»

2ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет»

Вирусная лейкемия коров - хроническая инфекционная болезнь, характеризующаяся неоплазией кроветворной ткани. Возбудитель болезни, BLV, присутствует в инфицированных лимфоцитах в форме провируса. Зараженный лимфоцит не уничтожается при попадании в восприимчивый организм. Целью нашего исследования стало сравнение структурно-функционального состояния цитоскелета лимфоцитов здорового и ВЦУ-инфицированного скота методом атомно-силовой микроскопии. Установлено, что поверхность здоровых лимфоцитов является более гладкой, их средний объем на 21,5 % больше, и модуль Юнга на 37 % выше, чем у инфицированных клеток. Таким образом, мембраны лимфоцитов BLV-инфицированного скота характеризуются повышенной жесткостью при меньшей эластичности.

Ключевые слова: атомно-силовой микроскоп, вирусная лейкемия, лимфоцит, иммунитет, модуль Юнга, профилометрия.

Вирусная лейкемия коров - это хроническая инфекционная болезнь, характеризующаяся неопластической пролиферацией клеток кроветворной и лимфоидной тканей с появлением в

крови малодифференцированных клеток лимфоидного или миелоидного ряда. Размножаясь в селезенке и лимфоузлах, вирус (BLV) поражает иммунную систему организма и способствует развитию вторичных бактериальных и вирусных инфекций, угнетает процесс кроветворения, из-за чего развивается анемия, могут наблюдаться спонтанные кровотечения [3].

Животные не проявляют клинических симптомов заболевания длительное время. Иногда явные признаки могут вовсе не проявиться за всю жизнь животного на фермерском подворье. Однако согласно статистическим данным, у коров - вирусоносителей, даже при отсутствии выраженных симптомов заболевания продуктивность снижается на 5-12 %. У зараженных лейкозом коров зачастую рождаются здоровые телята, которые впоследствии могут заразиться лейкозом от животных-вирусоносителей [4].

К сожалению, такие явные симптомы лейкоза, как увеличенные лимфоузлы, снижение иммунитета, истощение, увеличенная селезенка, низкая продуктивность наступают в терминальной, заключительной стадии заболевания. При вскрытии погибшего, или забитого животного обнаруживается, что весь его организм поражен опухолями. Продукты метаболизма и лейкозные клетки накапливаются в организме больного животного. Они обладают канцерогенными свойствами. Не исключено, что употребление мяса и молока, полученного от больных животных, может скомпрометировать онкогенез. Поэтому молоко от больных лейкозом коров и пораженные опухолями туши животных, согласно ветеринарному законодательству, подлежат утилизации [1, 2].

Естественный иммунитет при гемобластозах крупного рогатого скота имеет ряд специфических особенностей, отличающих его от естественного иммунитета при других инфекционных болезнях. Главное отличие заключается в том, что антитела не способны элиминировать вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), который обычно присутствует в инфицированных лимфоцитах в форме провируса и защищен от действия антител. Известно, что заражение в большинстве случаев происходит ВЛКРС, а лимфоцитом, содержащем в своей хромосоме провирус.

Проблема специфической профилактики лейкоза крупного рогатого скота не решена, хотя исследования в этой области активно продолжаются. В частности, в России ведутся изыскания с целью создания вакцины против лейкоза крупного рогатого скота с использованием вируса осповакцины как вектора генов протективных антигенов ВЛКРС. Исследователи не могут найти объяснение тому, что инфицированный лимфоцит не уничтожается при попадании в восприимчивый организм, а приживается и дает обильное потомство, в то время как неинфицированные клетки быстро элиминируются иммунной системой.

Потому исследование в сравнительном аспекте здоровых и пораженных ВЛКРС лимфоцитов является обоснованно актуальной в настоящее время задачей. Сравнение структурно-функционального состояния цитоскелета здоровых и BLV-инфицированных лимфоцитов может сыграть ключевую роль в понимании причины «живучести» зараженных клеток и определит пути разработки способов специфической борьбы и профилактики вирусного лейкоза.

Один из современнейших методов исследования - атомно-силовая микроскопия (АСМ) -является высокоэффективным при изучении клеточных мембран и подмембранных структур. К таким структурам в первую очередь относится цитоскелет. Лимфоциты характеризуются хорошо выраженным цитоскелетом: микротрубочками, промежуточными виментиновыми филаментами и микрофиламентами. Микротрубочки и филаменты располагаются в цитоплазме удаленно от клеточной мембраны в составе нескольких систем. Они обеспечивают поддержание формы и распределение компонентов клетки. Микрофиламенты также участвуют в процессах адгезии [1, 3].

Целью настоящего исследования является сравнение структурно-функционального состояния цитоскелета лимфоцитов здорового и BLV-инфицированного КРС методом атомно-силовой микроскопии. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить фракцию лимфоцитов периферической крови от здорового и BLV-инфицированного крупного рогатого скота.

2. Приготовить препарат из лимфоцитов для исследования методом АСМ.

3. Осуществить сканирующую зондовую микроскопию препаратов.

4. Провести сравнительный анализ полученных результатов.

Материалы и методы исследования. Материал: периферическая кровь. Объект исследования - лимфоциты здорового и BLV- инфицированного КРС.

Методы исследования:

1. Лимфоциты выделяли из периферической крови в градиенте плотности фиколл-урографина по стандартной методике.

2. Каплю лимфоцитов адгезировали на обезжиренном стекле.

3. Фиксацию осуществляли очищенным безводным метиловым спиртом 1 минуту.

4. Исследовали механические и топографические свойства лимфоцитов методом АСМ.

5. Полученные АСМ-сканы обрабатывали в программе Nova, статистическую обработку производили с помощью Excel 2007, Statistica.

Для оценки локализации клеток препараты окрашивали по методу Романовского-Гимзы. Для исследования поверхности клеток использовали сканирующий зондовый микроскоп Solver Smena A (на базе НИТИ УлГУ, лаборатории сканирующей и зондовой микроскопии).

Сканирование поверхности фиксированных препаратов проводили в полуконтактном режиме на воздухе. Использовались неконтактные кремниевые зонды серии NSG10 (NT-MDT) с жесткостью 5,5 Н/м, резонансной частотой приблизительно 150 кГц, радиусом закругления 10 нм, высота зонда 10-20 мкм.

Результаты исследования и обсуждение. Была осуществлена профилометрия лимфоцитов. АСМ профилометрия позволяет отобразить особенности структуры рельефов клеток. Обнаружено, что поверхность здоровых лимфоцитов является более гладкой по сравнению с поверхностью инфицированных лимфоцитов.

Атомно-силовая микроскопия позволяет получать карты латеральных сил. То есть при взаимодействии зонда с поверхностью помимо нормальных сил возникают также боковые (латеральные) силы. Существуют две основные силы, которые имеют горизонтальную составляющую - это сила трения и нормальная реакция образца, которая из-за локальных неровностей поверхности отклоняется от вертикали. Последняя всецело определяется рельефом поверхности. Таким образом, карта латеральных сил несет информацию о топографии, что существенно расширяет возможности для исследования свойств поверхностей.

В результате проведенных измерений и среднестатистических расчетов инфицированные и здоровые лимфоциты имели следующие характеристики.

Как видно из таблицы 1, средний объем инфицированных лимфоцитов на 21,5 % меньше объема здоровых клеток. Высота, длина и ширина имеет большее морфофункциональное значение, поэтому изменение данных параметров у инфицированных лимфоцитов говорит об уменьшении функциональной активности. Это свидетельствует о дегенеративных процессах в клетке, в частности об уменьшении размера ядра у инфицированных животных. Ведь именно ядро придает куполообразную форму лимфоциту. Аналогичная тенденция, подтверждающая наше предположение, прослеживается и при сравнении размеров сторон клеток.

Анализ модуля Юнга показывает, что упругие свойства мембран инфицированных лимфоцитов на 37 % меньше, чем у свободных от БЬУ.

Таблица 1

Сравнительная характеристика лимфоцитов В£^-инфицированного и здорового скота

Средний Средний Средняя Средняя Средняя Соотношение Модуль

объем, мкм3 периметр, высота, мкм длина, мкм ширина, мкм сторон, Юнга, МПа

мкм3 мкм/мкм (по модели

Герца)

Лимфоциты здорового скота

211.7±16,1 62,3±6,0 11,7±3,2 19.2±3,3 5.2±2,5 1,04±5,3 120,1±2,2

Лимфоциты скота пораженного БЬУ

166,1±13,2 56,2±3,2 10,5±2,5 18,1±4,1 4,9±2,3 0,87±5,1 75,6±2,5

Следует оговорить, что модуль Юнга (модуль продольной упругости) - физическая величина, характеризующая свойства материала сопротивляться растяжению, сжатию при упругой деформации, в данном случае биологических мембран.

Как известно, биологическим мембранам принадлежит ключевая роль в обеспечении и регуляции физиологической активности клеток. Дестабилизация молекулярной ультраструктуры плазмолеммы приводит к потере функциональной активности клетки и изменению жизнедеятельности, что отражается на ее функции.

Выводы. 1. Средний объем инфицированных лимфоцитов на 21,5 % меньше объема здоровых клеток, что является показателем дегенеративных процессов в клетке либо незрелостью последних.

2. Модуль Юнга здоровых лимфоцитов на 37 % выше, чем у инфицированных, что свидетельствует о сохранении упругих свойств мембран здоровых клеток.

Вышеперечисленные структурные изменения могут повлечь за собой изменение функции лимфоцитов, в частности увеличение возможности агрегации клеток.

Таким образом, полученные нами данные показывают, что мембраны лимфоцитов БЬУ-инфицированного скота характеризуются повышенной жесткостью при меньшей эластичности. А сами клетки имеют морфологические признаки, позволяющие судить о снижении их функциональности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Красникова Е.С. О необходимости ужесточения мер контроля над энзоотическим лейкозом крупного рогатого скота / Е.С. Красникова, Т.А. Плютина // Труды Кубанского ГАУ. - 2014. - № 5 (50). - С. 131-133.

2 Изучение структурно-функционального состояния лимфоцитов здоровых и ^еХК-инфицированных кошек методом атомно-силовой микроскопии / Е.С. Красникова, О.В. Столбовская, Д.А. Артемьев, Б.Б. Костишко // Научная жизнь. - 2014. - № 6. - С. 156-163.

3 Красникова Е.С. Биологическая безопасность продукции животных, инфицированных вирусами энзоотического лейкоза и иммунодефицита КРС / Е.С. Красникова, О.С. Ларионова // Вестник Ветеринарии. - 2014. -Вып. 69, № 2. - С. 85-88.

4 Красникова Е.С. Диагностическая оценка серологического и молекулярно-генетического методов лабораторных исследований на ретровирусные инфекции крупного рогатого скота / Е.С. Красникова, В.А. Аголь-цов, П.С. Мелкина // Ветеринарная патология. - 2013. - Вып. 45, № 3. - С. 23-29.

Рукопись получена: 11 мая 2016 г. Принята к публикации: 20 мая 2016 г.