CC BY
173
УДК 577.2
Изучение мембранной локализации в E. coli рекомбинантных калиевых каналов
О. В. Некрасова1#, А. И. Тагвей1, А. А. Игнатова1,2, А. В. Феофанов1,2, М. П. Кирпичников1,2
1 Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН
2 Биологический факультет Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова # e-mail: [email protected]
РЕФЕРАТ Осуществление эффективной экспрессии рекомбинантных мембранных белков в E. coli напрямую связано с совершенствованием подходов и методов, направленных на встраивание целевых белков в клеточную мембрану и образование ими правильной пространственной структуры. Важной технологической задачей в этом направлении является разработка методов изучения локализации целевых белков в клетке-хозяине. На модельной системе гибридного калиевого канала KcsA-Kv 1.3 разработана технологическая схема изучения мембранной локализации в клетках E. coli рекомбинантных белков, содержащих функционально-активные участки вольт-зависимых эукариотических калиевых каналов. Схема включает применение биохимических и флуоресцентных методов детекции целевых белков в мембране, а также изучение их лиганд-связывающей активности в составе бактериальной мембраны.
Ключевые слова: мембранные белки; KcsA; фракционирование клеток; флуоресцентные методы
ВВЕДЕНИЕ
Определение структуры и функций мембранных и мембранно-связанных белков является одним из актуальных направлений современной биологии. Мембранные белки участвуют в важнейших клеточных процессах -рецепции и межклеточной коммуникации, молекулярном и ионном транспорте, играют роль в патогенезе многих заболеваний и являются мишенями большей части фармацевтических препаратов [1].
В связи с низким уровнем биосинтеза многих мембранных белков в биологических тканях основным источником этих белков для структурно-функциональных исследований являются рекомбинантные молекулы, полученные в различных системах гетерологической экспрессии. [2]. Бактериальные клетки (в частности, Escherichia coli) представляют собой распространенную и наиболее продуктивную систему биосинтеза рекомбинантных мембранных белков [3]. Вместе с тем гетерологическая экспрессия в E. coli эукариотических белков, в т.ч. мембранных, приводит к возникновению ряда проблем, связанных с их общей токсичностью для клеток. Кроме того, распространенным случаем является экспрессия агрегированного белка в тельцах включения, что приводит к необходимости тщательного подбора условий его рефолдинга после выделения. Более перспективным представляется подход, основанный на экспрессии мембранных белков в составе бактериальной мембраны с образованием правильной пространственной укладки (фолдинга) белковой молекулы [4].
Реализация такого подхода может быть существенно облегчена, если обеспечить возможность простого и эффективного тестирования правильности укладки полипеп-тидной цепи целевого белка в мембране, например, с помощью тестов, измеряющих его функциональную активность или способность связывать лиганды. Кроме того, применение простых биохимических методов для определения локализации целевых белков в клетке позволит оперативно контролировать встраивание целевого рекомбинантного белка в мембрану. Такой подход повысит эффективность планирования и осуществления экспериментов, позволит ускорить выбор оптимальной стратегии для функциональной экспрессии целевого мембранного белка.
Для разработки способов контролируемой функциональной экспрессии рекомбинантных мембранных белков в клетках E. coli нами был выбран гибридный калиевый канал KcsA-Kv1.3, возможность экспрессии которого в клетках бактерий была продемонстрирована ранее [5, 6]. Этот и аналогичные ему гибриды KcsA-Kvl.X были получены путем встраивания функционально-активного сайта связывания с лигандами эукариотических калиевых каналов семейства Kv1 в гомологичный участок бактериального канала KcsA.
Интерес к эукариотическим вольт-зависимым калиевым каналам Kv1 определяется важной ролью этих белков в таких процессах, как проведение нервного импульса, регуляция мускульных сокращений, пролиферация клеток [7]. В настоящее время канал Kv1.3 рассматривается в качестве терапевтической мишени при лечении целого ряда
аутоиммунных заболеваний [8], а тестирование его лиганд-связывающей активности составляет основу поиска новых лекарственных препаратов [9].
Получение гибридных белков KcsA-Kvl.X оказалось возможным вследствие высокой структурной и функциональной гомологии калиевых каналов. По своему строению эти белки являются тетрамерами, каждая субъединица которых содержит шесть (вольт-зависимые эукариотические каналы) или две (бактериальные каналы) трансмембранные спирали. В случае эукариотических каналов концевые спирали S5 и S6, соединенные петлей, образуют пору канала, проводящую ионы калия [10]. Бактериальный калиевый канал KcsA [11], имеющий более простое строение субъединиц, по общему плану строения гомологичен поровым доменам самых различных бактериальных и эукариотических вольт-зависимых каналов. Наибольшая гомология аминокислотной последовательности наблюдается в области поровой петли, соединяющей трансмембранные спирали М1 и М2 этого канала (рис. 1а).
Линкер S5-P эукариотических Kv1 каналов участвует в формировании сайта связывания с пептидными токсинами - природными блокаторами вольт-зависимых каналов [12]. Возможность замены S5-P-линкера KcsA на соответствующий участок Kv1.3 канала привела к созданию гибридного белка KcsA-Kv1.3 (рис. 1б), представляющего собой рецептор с высоким сродством к пептидным токсинам [5]. Полученный гибрид сохраняет специфичность связывания с лигандами, присущую эукариотическому каналу Kv1.3, и является, таким образом, подходящей биоинже-нерной конструкцией для поиска новых модуляторов активности этого канала.
Выбор KcsA-Kv1.3 для настоящего исследования обусловлен, во-первых, достаточно высоким уровнем экспрессии этого белка в E. coli (до 2.5 мг/л [5]), что позволяет детектировать этот белок в составе суммарного клеточного лизата с помощью традиционного метода анализа белков -денатурирующего электрофореза в ПААГ. Во-вторых, свойство гибридного белка связывать меченые лиганды может быть использовано для разработки альтернативных методов тестирования локализации мембранных белков в составе клеточной мембраны.
Целью работы является разработка на примере рекомбинантных калиевых каналов технологических подходов для реализации функциональной экспрессии рекомбинантных мембранных белков в составе мембраны клеток E. coli, контролируемой на основе методов флуоресцентной микроскопии.
материалы и методы материалы
В работе были использованы реактивы фирмы Merck, Германия, и фирмы Sigma, США; детергенты Mega 9 (нонаноил-Ы-метилглюкамид), N-лаурилсаркозинат натрия (фирмы Amresco, США), Тритон Х-100 (фирмы Merck, США); наборы для выделения плазмидной ДНК, очистки ПЦР-фрагментов, экстракции ДНК из агарозного геля (фирмы Qiagen, США); ферменты рестрикции и ДНК-модифицирующие ферменты (фирмы Fermentas, Латвия).
(К^чЛаД гиттля
S5ÜII I S5-I* V К Í' S6 I S6AÍ2
ffc*A * а . F1 й j-U ЦУJ V E TAT TV ¡3tGDLYF V TL Г- F- TAT
N-йНмЦ Mi ШШШАЯ ПЕТЛЯ М2 Стана KtauVKvlJ | | |гД*.Г | j |
KvlX
Рис. 1. Гомология аминокислотных последовательностей поровой петли вольт-зависимого канала Kv1.3 и бактериального канала KcsA (а) и схематическое изображение структуры гибрида KcsA-Kv1.3 (б). S5/M1 и S6/M2 — трансмембранные спирали; S5-P и P-S6 — последовательности линкеров; Р — поро-вая спираль; S — последовательность, участвующая в образовании селективного ионного фильтра в составе тетрамера (подчеркнута)
методы
В работе использовали общие методы работы с рекомбинантными ДНК [13].
экспрессия РЕКОМБИНАНТНОГО ГЕНА KcsA-Kv1. 3
Ночную культуру клеток E. coli BL21(DE3) (фирмы Novagen), трансформированых плазмидой pET28KcsA-Kv1.3, инокулировали в 30.0 мл среды М9, содержащей 40 мкг/мкл канамицина, до начальной мутности OD560 = 0.25 о.е./см. Культуру индуцировали при OD560 = 1.0 о.е./см добавлением ИПТГ (изопропил-P-D-тиогалактопиранозида) до конечной концентрации 50 мкМ и продолжали выращивание в течение 18 ч при 37 °С (конечная мутность культуры составляла 2.5-3 о.е./см). Биосинтез белка детектировали путем разделения белков клеточного лизата электрофорезом в денатурирующем 13.5 % полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ) по методу Лэммли [14].
ИММУНОБЛОТТИНГ
Белки из ДСН-ПААГ переносили на нитроцеллюлозный фильтр ВА-85 (фирмы Schleisher&Schuell) электрофорезом на приборе Mini-Protean 3 Cell (фирмы Bio-Rad, США) в буфере 25 мМ NaHCO3, рН 9.2, 10 % метанол в течение 1.5 ч и токе 0.8 мА/см при 20 °С. Иммунохимическое окрашивание проводили с использованием моноклональных мышиных IgG1 антител (Penta-His, фирмы Qiagen, США) в разведении 1:1000 и конъюгата вторичных антител (анти-IgG! мыши) с пероксидазой хрена (фирмы Novagen) в разведении 1:3000 в соответствии с методикой производителя. В качестве хромофорного субстрата пероксидазы использовали ТМБ (те-траметилбензидин) в растворе 0.03 % перекиси водорода.
ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОК
Пробы для фракционирования готовили осаждением клеток из 30 мл культуры центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин при 10 °С. Клетки лизировали в 4 мл буфера А (100мМ NaCl, 5мМ KCl, 50мМ Трис рН 8.0), содержащем 0.5 мг/мл лизоцима, 1 мМ ЭДТА и 1мМ фенилме-тилсульфофторид, при 4 °С в течение 20 мин, после чего проводили озвучивание в течение 5 мин на приборе Digital Sonifier model 250 (фирмы Branson) импульсами по 10 сек при мощности 200 Вт.
Суспензию центрифугировали 10 мин при 10000 g при 5 °С, осадок отделяли (осадок I), а супернатант центрифугировали 1 ч при 80 000 g при 5 °С на центрифуге TLA 100 (фирмы Beckman) и получали осадок II. Каждый осадок экстрагировали буфером В (0.1 М Na3PO4, рН 7.0, 5mM KCl), содержащим 40 мМ Mega 9 (1 % лаурилсаркозин или 1 % Тритон Х-100) при качании в течение 3-4 ч, затем проводили повторное центрифугирование и полученные конечные осадки растворяли в буфере для электрофореза в 13.5 % ДСН-ПААГ.
ОТМЫВКА МЕМБРАН ЩЕЛОЧНЫМ РАСТВОРОМ КАРБОНАТА НАТРИЯ
Клетки лизировали в буфере C (50мМ Tris pH 8, 5мМ EDTA), содержащем 1 мг/мл лизоцима. Суспензию подвергали трехкратному замораживанию и размораживанию для вскрытия клеток, затем проводили озвучивание в течение 1 мин импульсами по 10 сек. К суспензии добавляли равный объем 0.2 М Na2CO3, pH 12, и инкубировали на ледяной бане в течение 5 мин. Белки, встроенные в мембрану, осаждали центрифугированием в течение 1 ч при 80 000 g и 4 °С. Полученный осадок растворяли для анализа в 13.5 % ДСН-ПААГ.
ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА С ПОМОЩЬЮ МЕТАЛЛ-АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Экстракты осадков I или II наносили на колонку с 1 мл смолы Ni-ПТА агарозы (фирмы Qiagen) в буфере В, содержащем 40 мМ Mega 9. Смолу промывали раствором 20 мМ имидазола, и белок элюировали 0.4 М имидазола в этом же буфере.
ПРОЦЕДУРА ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ KCSA-KV1.3 С ЛИГАНДОМ
Культуру индуцированных клеток BL21(DE3) с белком KcsA-Kv1.3 (1 мл) центрифугировали в течение 10 мин при 5000 хд, осадок суспендировали в буфере А, содержащем 10 мМ Tris-Hcl, pH 8.0, 0.5 M сахарозу, 0.3 mM EDTA и 20 мкг/мл лизоцима, инкубировали в течение 20 мин при 4 °С, затем добавляли Mgcl2 до конечной концентрации 10 мМ. Полученную таким образом суспензию сферопла-стов разбавляли в 100-200 раз буфером А, содержащим 0.25 М сахарозу, и аликвоту (50-70 мкл) вносили в лунку планшета и инкубировали в течение 1.5 ч при 20 °С с флуоресцентно меченным AgTx2 в концентрации 10 нМ. AgTx2, конъюгированный с 5(6)-карбокситетраметилродамином (Rh-AgTx), был любезно предоставлен Ю. В. Корольковой (ИБХ РАН). Регистрацию образования комплекса мембранного белка KcsA-Kv1.3 с его лигандом Rh-AgTx осуществляли методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с помощью установки LSM510 META (Zeiss, Германия). Конфокальные флуоресцентные изображения сферопластов, окрашенных Rh-AgTx, измеряли с помощью 63-кратного водоиммерсионного объектива C-Apochromat (числовая апертура 1.2, Zeiss, Германия). Пространственное разрешение составляло около 0.2 мкм в плоскости препарата и 0.5 мкм в направлении оптической оси объектива. Флуоресценцию Rh-AgTx возбуждали He,Ne лазером (543.5 нм, мощность 12 мкВт на образце), а испускание флуоресценции регистрировали с помощью длинноволнового барьерного фильтра с границей 585 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРОЦЕДУР ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ И ЭКСТРАКЦИИ ДЕТЕРГЕНТАМИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ KcsA-Kv1.3
Ген гибридного белка KcsA-Kv1.3 был сконструирован в соответствии с работой [5] и клонирован в плазмиду рЕТ28а (фирмы Novagen). Экспрессию гибридного гена KcsA-Kv1.3 проводили в составе плазмиды pET28KcsA-Kv1.3 в клетках BL21(DE3). Уровень наработки рекомбинантного белка в клетках определяли с помощью анализа суммарного клеточного белка электрофорезом в SDS-ПААГ, а наличие целевого белка в клеточном лизате подтверждали с помощью иммуноблоттинга, используя антитела против участка Hisx6, локализованного на С-конце рекомбинантных белков.
Как известно из литературных источников, рекомбинантный KcsA, а также гибридные белки KcsA-Kvl.X накапливаются в составе цитоплазматической (внутренней) мембраны E. coli [5, 15, 16]. Так, например, выделение гибридных белков [5] проводили из мембранной фракции клеток, полученной путем высокоскоростного центрифугирования клеточного лизата (110 000 g в течение 45 мин). Эту процедуру мы решили использовать для разработки методики фракционирования клеток, направленной на определение клеточной локализации целевых мембранных белков - гибридных калиевых каналов.
Процедура фракционирования клеток, полученных после выращивания индуцированной культуры, основана на разрушении клеток ультразвуком, осаждении фрагментов клеточной стенки и нерастворимых компонентов низкоскоростным центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин (осадок I) и последующем осаждении мембранных везикул высокоскоростным центрифугированием (осадок II). На представленной электрофореграмме (рис. 2а) видно, что гибридный белок KcsA-Kv1.3 содержится в нерастворимой фракции клеток, причем значительное его количество детектируется в осадке II (рис 2а, дорожка 3), что свидетельствует о встраивании рекомбинантного белка в мембрану. Интересным наблюдением является наличие целевого белка в осадке I (рис 2а, дорожка 2). Этот низкоскоростной осадок обычно рассматривается в литературе как фракция, содержащая тела включения - нерастворимые агрегаты целевого белка, образующиеся в результате слипания но-восинтезированных рекомбинантных полипептидов в денатурированной форме [17]. В случае экспрессии растворимых белков при выделении рекомбинантных молекул из состава тел включения необходимо проводить процедуру ренатура-ции белка с целью получения его активной формы. В случае биосинтеза мембранных белков состав низкоскоростного осадка I, а также механизм его образования, по-видимому, могут быть иными. Так, в работе [18] показано, что распределение белков в цитоплазматической мембране клеток E. coli неравномерно: с помощью дифференциального центрифугирования были выявлены «легкие» фракции мембран, не содержащие белка, тяжелые фракции, нагруженные белком, а также промежуточные фракции. Учитывая, что в клетках BL21(DE3) происходит суперэкспрессия гибридного белка KcsA-Kv1.3, можно предположить, что осадок I содержит насыщенные белком мембранные везикулы, обладающие большей плотностью, чем мембраны в осадке II. Об этом
Рис. 2. Фракционирование клеток BL21 (DE3), содержащих белок KcsA-Kv1.3 (а). 1 — клеточный лизат; 2 — осадок I; 3 — осадок II; 4 — супернатант после высокоскоростного центрифугирования; 5 — иммуноблот клеточного лизата с анти-Hisx6 антителами. Экстракция осадка I растворами: 40 мМ Mega 9 (б), 1 % лаурилсаркозина (б); 1 % тритона (г). Экстракция осадка II растворами: 40 мМ Mega 9 (д), 1 % тритона (е). 1 — суспензия осадка в детергенте; 2 — экстракт. Фракционирование клеток карбонатным способом (ж). 1 — клеточный лизат;
2 — супернатант после высокоскоростного центрифугирования; 3 — осадок. Анализ образования тетрамерной формы белком KcsA-Kv1.3 (з). 1 — образец KcsA-Kv1.3 с предварительным прогревом в течение 10 мин при 96 °С; 2 — образец KcsA-Kv1.3, выделенный экстракцией 40 мМ Mega 9 из осадка I с предварительным прогревом в течение 10 мин при 37 °С; 3 — образец KcsA-Kv 1. 3 из осадка II, приготовленный в тех же условиях. М.в. — маркеры молекулярного веса. Стрелкой указано положение целевого белка (мономера или тетрамера)
механизме образования осадка I упоминается в обзоре [2]. Нельзя исключать и того, что осадок I содержит денатурированные молекулы целевого белка.
Исследование осадков I и II проводили с помощью экстракции детергентами. Сначала был использован неионный детергент Mega 9, который обычно применяется для экстракции KcsA и гибридов из мембранной фракции [19]. Как видно на рис. 2б и 2д, обработка обоих осадков этим детергентом привела к растворению целевого белка. Далее осадки экстрагировали мягким ионным детергентом - лауроилсаркозином. Известно, что 1-2 % раствор этого детергента применяется для избирательного растворения цитоплазматической мембраны E. coli [20, 21], а в некоторых случаях экспрессии мембранных белков - для растворения низкоскоростного осадка, содержащего целевой белок [22, 23]. Белок KcsA-Kv1.3 полностью экстрагировался из осадков I и II лаурилсаркозином (на рис. 2в представлены результаты по растворимости осадка I). Полная солюбилизация осадков I и II произошла и при их обработке раствором 1 % Тритона Х-100 по методу [24] (рис. 2г и 2е). Этот детергент в концентрациях
0.5-1.0 % обычно используется для растворения мембранной фракции клеток, а также для отмывки тел включения от примесных белков [17].
Для подтверждения локализации целевого белка в мембране было проведено определение суммарной фракции
мембранных белков путем отмывки мембран раствором карбоната натрия по методу [25]. Этот метод основан на дифференциальном растворении цитоплазматических агрегированных и мембранно-связанных белков в сильнощелочных условиях (рН = 12) и последующем отделении фракции клеток, содержащей интегральные мембранные белки, центрифугированием. Как видно из рис. 2ж, все количество гибридного белка KcsA-Kv1.3 содержится в осадочной фракции.
На следующем этапе мы провели очистку экстрагированных в Mega 9 белков KcsA-Kv1.3 с помощью металл-аффинной хроматографии на колонке Ni-NTA се-фарозы, а затем анализировали целевой белок электрофорезом в двух режимах - с предварительным прогреванием при 96 °С в течение 10 мин в буфере, содержащем 1 % SDS, и без прогрева. Этот тест, который используется для детекции образования белком KcsA и его мутантными формами нативной четвертичной структуры, основан на исключительной устойчивости тетрамерной формы KcsA в растворах различных детергентов [16]. Так, например, в случае раствора KcsA в 0.1 % SDS температура плавления комплекса составляет 68 °С. Как видно на рис. 2з, гибридный белок KcsA-Kv1.3, выделенный как из осадка I, так и из осадка II, образует тетрамер. Учитывая, что одним из условий образования тетрамерной структуры белком KcsA является наличие липидного окружения [36], а также основываясь на полученных данных о хорошей растворимости гибридного белка из обоих осадков в детергентах -Mega 9, лаурилсаркозине и Тритоне Х-100, можно с большой вероятностью предположить, что гибридный белок в осадке I принимает нативную конформацию в составе мембранных везикул. Дополнительным подтверждением наличия мембранных структур в обоих осадках является переход практически всего количества клеточного целевого белка в нерастворимую фракцию при проведении фракционирования карбонатным методом. Полученные результаты позволяют более правильно оценивать данные по фракционированию мембранных белков в E. coli, указывая на то, что локализация целевого мембранного белка в «низкоскоростном» осадке I не исключает образования этим белком нативной конформации в мембранном или мембраноподобном окружении.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕМБРАННОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ KCSA-KV1. 3 С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ
Наличие лиганд-связывающего сайта в составе гибридного белка KcsA-Kv1.3 дает возможность детектировать встраивание и фолдинг этого рекомбинантного белка в составе цитоплазматической мембраны E. coli. Для этих целей была использована разработанная нами процедура связывания флуоресцентно-меченного пептидного токсина - агиток-сина, с белком KcsA-Kv1.3 на поверхности целых клеток E. coli [26]. Агитоксин (AgTx2) - это пептид (38 аминокислотных остатков) из яда скорпиона Leiurus quinquestriatus, который является эффективным блокатором Kv1.3 канала [27]. Связываясь с внешней стороны поры, токсин препятствует транспорту ионов калия через канал. Агитоксин не проявляет сродства к KcsA, однако взаимодействует с высокой аффинностью с очищенным гибридом KcsA-Kv1.3 (IC50 = 6.4 nM) [5]. Кроме того, AgTx2 чувствителен к структурной целостности KcsA и обычно используется
как инструмент для тестирования образования четвертичной (тетрамерной) структуры канала [28].
Для осуществления флуоресцентной детекции связывания целевого белка с агитоксином клетки BL21(DE3), продуцирующие целевой белок KcsA-Kv1.3, предварительно обрабатывали лизоцимом для получения сферопластов с целью удаления клеточной стенки бактерий и обеспечения тем самым доступа меченого лиганда к цитоплазматической мембране. После инкубации сферопластов с Rh-AgTx2 проводили детекцию связывания с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. На представленной микрофотографии (рис. 3) видно, что флуоресцентный сигнал детектируется на поверхности клеточной мембраны бактерий. В контрольных клетках BL21(DE3), не содержащих плазмиды, а также в клетках, продуцирующих канал KcsA, связывание отсутствовало. Результаты тестирования указывают, что гибридный белок KcsA-Kv1.3 локализован в бактериальной мембране в функционально-активной форме, способной специфически связывать лиганд, пептидный токсин.
В результате проведенных экспериментов показано, что совокупность используемых методов (биохимических и флуоресцентных методов анализа) позволяет адекватно оценивать локализацию рекомбинантных белков - гибридных калиевых каналов в цитоплазматической мембране E. coli и контролировать правильность укладки полипептид-ной цепи по способности белка связывать специфический лиганд.
ВЫВОДЫ
1. На модельной системе мембранного белка KcsA-Kv1.3 разработан подход к изучению мембранной локализации в клетках E. coli рекомбинантных каналов, содержащих функционально-активные участки вольт-зависимых эукариотических калиевых каналов. Технологическая схема, основанная на использовании традиционных биохимиче-
Рис. 3. Связывание гибридного белка KcsA-Kv1.3 с флуоресцентно-меченым лигандом на поверхности бактерий. Цифровые микрофотографии клеток Bl21(DE3), продуцирующих KcsA-Kv1.3. (а, в) — флуоресцентные изображения в диапазоне X > 585 нм; (б) — клетки в проходящем свете
ских методов анализа, а также на разработанном нами методе флуоресцентной детекции, включает:
- фракционирование клеток, продуцирующих рекомбинантные мембранные белки, с помощью дифференциального центрифугирования клеточного лизата;
- исследование осадочных фракций путем экстракции различными детергентами;
- обнаружение мембранных белков в клеточном лизате «карбонатным» методом;
- определение тетрамерной структуры канала с помощью ДСН-ПААГ;
- детекцию в составе целых клеток E. coli, продуцирующих целевой белок, встраивания целевого белка в цитоплазматическую мембрану и образования им правильной тетрамерной структуры канала с помощью флуоресцентных методов.
2. Показано, что осадок, полученный низкоскоростным центрифугированием при фракционировании клеточного лизата, содержит целевой белок, образующий правильную тетрамерную конформацию в мембранном окружении.
Данная работа была выполнена при финансовой поддержке программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»
Список литературы
1. Byrne V., Iwata S. Membrane protein complexes. Curr Opinion in Struct Biol 2002. 12. Р. 239-243.
2. Grisshammer R., Tate C.G. Overexpression of integral membrane proteins for structural studies. Q Rev. Biophis 1995. 28. Р 314-422.
3. Jana S., Deb J.K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 2005. 67. Р 289-298.
4. Drew D., Fröderberg L., Baars L., de Gier J.W. Assembly and overexpression of membrane proteins in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 2003. 1610. Р 3-10.
5. Legros C., Pollmann V., Knaus H.-G., Farrell A.M., Darbon H., Bougis PE., Martin-Eauclaire M.F., Pongs O. Generating a high-affinity scorpion toxin receptor in KcsA-Kv1.3 chimeric potassium channels. J Biol Chem 2000. 275. Р 16918-16924.
6. Legros C., Schulze C., Garcia M.L., Bougis P.E., Martin-Eauclaire M.F., Pongs O. Engineering-specific pharmacological binding sites for peptidyl inhibitors of potassium channels into KcsA. Biochemistry 2002. 41.
Р. 15369-15375.
7. Shieh C.C., Coghlan M., Sullivan J.P, Gopalakrishnan M. Potassium channels: molecular defects, diseases, and therapeutic opportunities. Pharmacol Rev 2000. 52.
Р. 557-594.
8. Beeton C., Wulff H., Barbaria J., Clot-Faybesse O., Pennington M., Bernard D., Cahalan M.D., Chandy K.G., Béraud E. Selective blockade of T lymphocyte K(+) channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A 2001. 98. Р 13942-13947.
9. Kaczorowski G.J., Garcia M.L. Pharmacology of voltage-gated and calcium-activated potassium channels. Curr Opin Chem Biol 1999. 3. Р. 448-458.
10. MacKinnon R. Potassium channels. FEBS Lett 2003.
555. Р. 62-65.
11. Doyle D.A., Morais Cabral J., Pfuetzner R.A., Kuo A., Gulbis J.M., Cohen S.L., Chait B.T., MacKinnon R. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science 1998. 280. P. 69-77.
12. MacKinnon R., Cohen S.L., Kuo A., Lee A., Chait B.T. Structural conservation in prokaryotic and eukaryotic potassium channels. Science 1998. 280. P 106-109.
13. Sambrook J., Fritsch E.F., Mniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
14. Laemmli U.K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970.227. P 680-685.
15. Irizarry S.N., Kutluay E., Drews G., Hart S.J., Hegin-botham L. Opening the KcsA K+ channel: tryptophan scanning and complementation analysis lead to mutants with altered gating. Biochemistry 2002. 41. P. 13653-13662.
16. Cortes D.M., Perozo E. Structural dynamics of the Streptomyces lividans K+ channel (SKC1): oligomeric stoichiometry and stability. Biochemistry 1997. 36. P. 10343-10352.
17. Singh S.M., Panda A.K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng 2005. 99. P. 303-310.
18. van Heerikhuizen H., Kwak E., van Bruggen E.F., Witholt B. Characterization of a low density cytoplasmic membrane subfraction isolated from Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 1975. 413. P 177-191.
19. Schrempf H., Schmidt O., Kummerlen R., Hinnah S., M ller D., Betzler M., Steinkamp T., Wagner R. A prokaryotic potassium ion channel with two predicted transmembrane segments from Streptomyces lividans. EMBO J 1995. 14. P. 5170-5178
20. Carlone G.M., Thomas M.L., Rumschlag H.S., Sottnek F.O. Rapid microprocedure for isolating detergent-insoluble outer membrane proteins from Haemophilus species. J Clin Microbiol 1986. 24. P 330-332.
21. Gauthier A., Puente J.L., Finlay B.B. Secretin of the enteropathogenic Escherichia coli type III secretion system requires components of the type III apparatus for assembly and localization. Infect Immun 2003. 71. P 3310-3319.
22. Fiermonte G., Walker J.E., Palmieri F. Abundant bacterial expression and reconstitution of an intrinsic membrane-transport protein from bovine mitochondria. Biochem J 1993. 294. P. 293-299
23. Kerman A., Ananthanarayanan V.S. Expression and spectroscopic characterization of a large fragment of the mu-opioid receptor. Biochim Biophys Acta 2005. 1747. P. 133-40
24. Shimada Y., Wang Z.Y., Mochizuki Y., Kobayashi M., Nozawa T. Functional expression and characterization of a bacterial light-harvesting membrane protein in Escherichia coli and cell-free synthesis systems. Biosci Biotechnol Biochem 2004. 68. P. 1942-1948.
25. van Dalen A., Schrempf H., Killian J.A., de Kruijff B. Efficient membrane assembly of the KcsA potassium channel in Escherichia coli requires the protonmotive force. EMBO Rep 2000. 1. P. 340-346.
26. Nekrasova O.V., Ignatova A.A.,
Nazarova A.I., Feofanov A.V., Korolkova Y.V., Boldyreva E.F., Tagvei A.I., Grishin E.V., Arseniev A.S., Kirpichnikov M.P. Recombinant Kv channels at
the Membrane of Escherichia coli Bind Specifically Agitoxin2. J Neuroimmune Pharmacol 2009. 4. P. 83-91.
27. Garcia M.L., Garcia-Calvo M., Hidalgo P., Lee A., MacKinnon R. Purification and characterization of three inhibitors of voltage-dependent K+ channels from Leiurus quinquestriatus var. hebraeus venom. Biochemistry 1994. 33. P. 6834-6839.
28. Valiyaveetil F.I., MacKinnon R., Muir T.W. Semisynthesis and folding of the potassium channel KcsA. J Am Chem Soc 2002. 124. P. 9113-9120.
