Изучение кинетики окисления глюкозы бактериальными клетками Escherichia coli с помощью метода вращающегося дискового электрода Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКАЯ ЭНЕРГЕТИКА. 2007. Т. 7, № 4. С.200-204

УДК УЛК 541.136

ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ ОКИСЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ ESCHERICHIA COLI С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ВРАЩАЮЩЕГОСЯ ДИСКОВОГО ЭЛЕКТРОДА

Е. В. Кузьмичева, А. Н. Степанов, И. А. Казаринов, О. В. Игнатов*

Cаратовский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского *Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов, Россия

Поступила в редакцию 15.11.07 г.

Методом вращающегося дискового электрода проведено изучение основных закономерностей электрохимического поведения медиатора как основного электроактивного компонента биоэлектрохимической системы и определено влияние скорости вращения электрода, концентрации медиатора, глюкозы и микробных клеток на общую скорость процесса биоэлектрокаталитического окисления глюкозы.

The method of a rotating disk electrode leads studying the basic laws of electrochemical behaviour of mediator as basic electroactive component of bioelectrochemical system and influence of speed of rotation of an electrode, concentration of mediator, glucose and microbial cells are certain for the general speed of process bioelectrocatalitic oxidation of glucose.

ВВЕДЕНИЕ

Окисление органических соединений (например, углеводов, углеводородов, спиртов) бактериальными клетками с использованием диффузионно-подвижных промежуточных низкомолекулярных переносчиков электронов — медиаторов, заслуживает значительного внимания при изучении микробных топливных элементов (МТЭ).

МТЭ представляют собой устройства, в которых химическая энергия, заключенная в субстрате (топливе), с помощью каталитических систем микроорганизмов превращается в электрическую [1].

Общий механизм биоэлектрокаталитического процесса в системе субстрат — микроорганизм — медиатор — электрод достаточно сложен. В живом организме субстрат окисляется посредством фермент-катализируемых реакций. При этом отданные субстратом электроны используются микроорганизмом для восстановления медиатора. Восстановленный медиатор окисляется на электроде, отдавая электроны и, далее, опять участвуя в дыхании микроорганизма.

Таким образом, при помощи сопрягающих редокс-реакций устанавливается прямая связь между дыханием микробов и электродными процессами.

Для создания микробного медиаторного электрода в настоящее время используют различные типы микроорганизмов и медиаторов [2]. Однако такие системы недостаточно исследованы и для создания эффективного микробного топливного элемента необходимо их детальное изучение.

Метод вращающегося дискового электрода — один из основных методов экспериментальной электрохимии. С его помощью исследуется механизм и измеряются кинетические характеристики электрохимических реакций, изучаются объемные химиче-

ские реакции, сопровождающие электродные процессы. Возможность осуществления процесса в режиме стационарной конвективной диффузии, строгая количественная зависимость толщины диффузионного слоя от скорости вращения электрода и предельного диффузионного тока от объемной концентрации электроактивного вещества дают широкие перспективы для исследования кинетики сложных многостадийных электрохимических реакций [3].

Целью работы является изучение методом вращающегося дискового электрода закономерностей процесса окисления глюкозы бактериальными клетками Escherichia coli в присутствии медиатора — тетраметилдиаминофенотиазина.

МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

Исследования проводились с использованием следующей модельной системы: глюкоза в качестве субстрата, клетки Escherichia coli в качестве биологического катализатора и тетраметилдиаминофено-тиазин (индикатор «метиленовый синий») в качестве медиатора:

л N л

2H+

(CH3)N

2H+ +2e+

+2e+ N(CH3)2

Окисленная форма

H

N

+ H+

(СИз)2М § ^ М(СИз)2

Восстановленная форма

Рабочим электролитом служил фосфатный буферный раствор (рИ 7.0) с добавкой хлорида натрия (10 г/л).

S

© Е. В. КУЗЬМИЧЕВА, А. Н. СТЕПАНОВ, И. А. КАЗАРИНОВ, О. В. ИГНАТОВ, 2007

Клетки Escherichia coli штамма К-12 выращивались на жидкой питательной среде LB в конической колбе на круговой качалке при температуре 37 °C в аэробных условиях. После двенадцатичасового культивирования биомасса трижды отмывалась центрифугированием (5000 об/мин, 5 минут, центрифуга К24 ГДР) с последующим ресуспензированием в фосфатном буфере.

Состав питательной среды LB (на 1 литр воды):

пептон 5 г,

дрожжевой экстракт 5 г,

NaCl 10 г.

Электрохимические измерения были сделаны с помощью потенциостата П-5848, электрический отклик рабочего электрода регистрировался самопишущим потенциометром КСП 4. Измерения были выполнены в стеклянной трёхэлектродной электрохимической ячейке на вращающемся дисковом электроде (Pt, S = 0.39 см2). Эксперименты проводились в термостатических условиях при температуре 37 °C с применением водяного термостата UT-10. Ячейка была снабжена длинной трубкой со шлифом для прокачивания через рабочий электролит аргона (марки А) с целью удаления из ячейки кислорода и создания анаэробных условий.

Потенциометрические измерения проводились относительно насыщенного хлорсеребряного электрода сравнения (ЭВЛ-1М1), имеющего потенциал +0.201 В относительно нормального водородного электрода. Вспомогательный электрод был выполнен из платиновой проволоки, скрученной в спираль.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С целью изучения электрохимического поведения медиатора были сняты поляризационные кривые процесса восстановления медиатора при различных скоростях вращения дискового электрода. На рис. 1 представлена поляризационная кривая процесса восстановления 5.610-4 М раствора медиатора в рабочем электролите при различных скоростях вращения. Видно ,что кривые характеризуются чётко выраженными предельными токами восстановления медиатора в области потенциалов от -0.210 до -0.300 В.

На рис. 2 представлена зависимость плотности предельного тока процесса восстановления медиатора от корня квадратного из скорости вращения электрода для различных концентраций медиатора. Видно, что i, ш1/2 — кривую легко аппроксимировать прямой линией, проходящей через начало координат, следовательно, процесс электрохимического восстановления медиатора на электроде протекает с чисто диффузионным контролем.

E, В

Рис. 1 Поляризационные кривые процесса восстановления медиатора на вращающемся дисковом электроде при различных скоростях вращения (рад/с): 1 — 36.6; 2 — 54.5; 3 — 80.64; 4 — 104.6; 5 — 151.8. Рабочий электролит содержит 5.610-4 моль/л медиатора. Скорость развертки 5 мВ/с

ю1/2, (рад/с)1/2

Рис.2 Зависимость плотности предельного тока процесса восстановления медиатора от корня квадратного из скорости вращения дискового электрода при различной концентрации медиатора: 1 — 3.7 • 10-4 моль/л; 2 — 7.5 • 10-4 моль/л; 3 — 11.2 • 10-4 моль/л. В рабочем электролите содержится 2 мг вл. веса/мл клеток и 4.6 ммоль/л глюкозы

Амперометрические измерения электрокаталитического окисления глюкозы бактериальными клетками Escherichia Coli были проведены на вращающемся дисковом электроде при различных концентрациях клеток, субстрата и медиатора.

На рис. 3 приведены потенциостатические кривые процесса анодного окисления медиатора на вращающемся дисковом электроде в рабочем электролите, содержащем 7.5-10"4 моль/л медиатора, 4.6 ммоль/л глюкозы и 2 мг вл.веса/мл клеток при различной скорости вращения дискового электрода.

г, c

Рис. 3. Потенциостатические кривые процесса анодного окисления медиатора на вращающемся дисковом электроде в рабочем электролите, содержащем 7.5 • 10-4 моль/л медиатора, 4.6 ммоль/л глюкозы и 2 мг вл.веса/мл клеток при различных скоростях вращения дискового электрода (рад/с): 1 — 36.6; 2 — 54.5; 3 —

80.64; 4 — 104.6; 5 — 151.8 при потенциале +0.250 В

Как видно из рисунка, начальный экспоненциальный спад тока процесса анодного окисления мети-ленового синего (без клеток) на платиновом электроде свидетельствует о способности последнего в выбранных экспериментальных условиях осуществлять быстрый перевод медиатора в окисленную форму Такая эффективная работа электрода позволяет иметь в анолите окисленную форму метиленового синего в качестве единственного акцептора электронов, физиологически приемлемого для применявшихся бактерий. В момент времени указанный стрелкой весь медиатор переведен в окисленную форму. Клетки, введенные в анолит, начинают производить восстановленную форму медиатора, «дышать» его окисленной формой, что приводит к возрастанию анодного тока.

Кривые проходят через максимум, причем величины плотностей тока максимума возрастают при увеличении скорости вращения дискового электрода. Затем наблюдается постепенное уменьшение тока во времени с выходом на постоянное значение, что связано со снижением объемной концентрации субстрата.

На основании полученных зависимостей можно провести кинетический анализ реакций, протекающих на границе раздела фаз электрод — электролит, а также определить параметры, от которых зависит протекание реакций во внешнедиффузионной цепи. Последнее обстоятельство является очень важным для оптимизации условий работы микробного меди-аторного анода.

На рис. 4, 5 приведены зависимости плотности тока максимума процесса анодного окисления медиатора от корня квадратного из скорости вращения дискового электрода для различных концентраций

медиатора и глюкозы. Видно, что процесс протекает в режиме смешанного диффузионно-кинетического контроля.

ю1/2, (рад/с)1/2

Рис. 4. Зависимость плотности тока максимума процесса анодного окисления медиатора от корня квадратного из скорости вращения дискового электрода при различной концентрации медиатора (моль/л): 1 — 7.5 • 10-4; 2 — 9.4• 10-4; 3 — 11.2 • 10-4. В рабочем электролите содержится 2 мг вл. веса/мл клеток и 4.6 ммоль/л глюкозы

ю1/2, (рад/с)1/2

Рис. 5. Зависимость плотности тока максимума процесса анодного окисления медиатора от корня квадратного из скорости вращения дискового электрода при различной концентрации глюкозы (моль/л): 1 — 58.1 • 10-6; 2 — 69.8• 10-6; 3 — 116.3 • 10-6. В рабочем электролите содержится 2 мг вл. веса/мл клеток и 7.5 • 10-4 моль/л медиатора

На рис. 6, 7 представлены зависимости обратной величины плотности тока максимума процесса анодного окисления медиатора от обратной величины корня квадратного из скорости вращения дискового электрода при различных концентрациях медиатора и глюкозы. Экстраполяция прямых на ось ординат позволила нам определить значение истинного кинетического тока. Из рис. 8 следует, что величина кинетического тока зависит от концентрации медиатора и глюкозы. Из тангенса угла наклона ^ ^С-зависимостей следует, что порядок реакции по медиатору и глюкозе приблизительно равен единице, следовательно, кинетический ток пропорционален концентрации медиатора и глюкозы в растворе.

^ 0.020

0.015

0.010

0.005

1 — y = 0.0976x + 0.004

2 — y = 0.09586x + 0.0032

3 — y = 0.0917x + 0.0026

lg i, А/см2 +3.95

+4.00

+4.05

+4.10

+4.15

+4.20

+4.25

4.30

0 _i_I_i_I_i_I_i_I_i_I_i_I_i_I_i_I_i_I

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18

_L_

_L_

_L_

_L_

_L_

_L_

_L

J

ю1/2, (рад/с)1/2

Рис. 6. Зависимость обратной плотности тока максимума процесса анодного окисления медиатора от обратной величины корня квадратного из скорости вращения дискового 2 электрода при различной концентрации медиатора (моль/л): ^ к А/см2

+7.25 +7.20 +7.15 +7.10 +7.05 +7.00 +6.95 +6.90

lgC, моль/см3

1 — 7.5 • 10+4; 2 бочем электролите

— 9.4 • 10+4; 3 — 11.2 • 10+4. В ра-содержится 2 мг вл. веса/мл клеток и 4.6 ммоль/л глюкозы

0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005

0

1 — y = 0.0821x + 0.0195

2 — y = 0.0791x + 0.0158

3 — y = 0.118x + 0.0

_L

_L

_L

_L_

_L

_L

_L

_L

J

0 0.02 0.04 0.06 0.0

0.10 0.12 0.14 0.16 0.18

ю1/2, (рад/с)1/2

Рис. 7. Зависимость обратной плотности тока максимума процесса анодного окисления медиатора от обратной величины корня квадратного из скорости вращения дискового электрода при различной концентрации глюкозы (моль/л): 1 — 58.1 • 10-6; 2 — 69.8 • 10-6; 3 — 116.3 • 10-6. В рабочем электролите содержится

2 мг вл. веса/мл клеток и 7.5 • 10-4 моль/л медиатора

На рис. 9 приведена зависимость плотности тока максимума процесса анодного окисления медиатора от корня квадратного из скорости вращения дискового электрода для различной концентрации клеток. Как видно из рис. 9 наблюдается прямая пропорциональность между плотностью тока максимума и корнем квадратным из угловой скорости вращения дискового электрода. В этом случае i, ю1/2-кривую легко аппроксимировать прямой линией, проходящей через начало координат, что свидетельствует о диффузионной природе процесса. При этом увеличение концентрации бактериальной суспензии приводит к увеличению скорости процесса биоэлектрокаталити-ческого окисления глюкозы.

3.45

3.50

3.55

3.60

_i_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I

-6.14 -6.10 -6.06 -6.02 -5.98 -5.94

lgC, моль/см3

б

Рис. 8. Зависимость кинетического тока процесса анодного окисления медиатора от концентрации глюкозы (а) и концентрации медиатора (б)

0 2 4 6 8 10 12 14

ю1/2, (рад/с)1/2

Рис. 9. Зависимость плотности тока максимума процесса анодного окисления медиатора от корня квадратного из скорости вращения дискового электрода при различной концентрации клеток (мг вл. веса/мл): 1 — 1.3; 2 — 1.7; 3 — 2; 4 — 2.7. В рабочем электролите содержится 5.6 • 10-4 моль/л медиатора и 4.6 ммоль/л глюкозы

1

а

ВЫВОДЫ

1. Методом вращающегося дискового электрода изучены закономерности процесса окисления глюкозы бактериальными клетками Escherichia coli в присутствии медиатора — тетраметилдиаминофено-тиазина. Установлено, что общая скорость процесса зависит от концентрации медиатора, субстрата и бактериальных клеток.

2. Зависимость скорости процесса от скорости вращения дискового электрода позволила изучить процессы, протекающие во внешнедиффузионной цепи. Установлено, что в целом процесс протекает

в режиме смешанного диффузионно-кинетического контроля.

3. Определен порядок реакции по медиатору и глюкозе. Показано, что он приблизительно равен единице.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Калюжный С. В. // Катализ в промышленности. 2004. №5. С. 38-42.

2. Shukla A.K., Suresh P., Berchmans S., Rajendran A. // Current Science. 2004. Vol. 87, №4. P. 455-468.

3. Плесков Ю. В., Филиновский В. Ю. Вращающийся дисковый электрод. М.: Наука, 1972.